معلومة

هل التفاعلات الجينية الدوائية متوقعة؟

هل التفاعلات الجينية الدوائية متوقعة؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد قرأت عن التفاعلات الجينية الدوائية واختبارات الجينات الدوائية. لم أتمكن من العثور على العديد من الموارد التي تحدد عملية اختبار التفاعلات المحتملة بين الأدوية والجينات دون إجراء طريقة التجربة والخطأ. على سبيل المثال ، يمكن التنبؤ بالتفاعلات الدوائية باستخدام العديد من المعلمات كما هو مذكور هنا. هل هناك أي معلمات مماثلة لتلك الموصوفة في ورقة معينة للتنبؤ بالتفاعلات الجينية الدوائية في حالة توفر خصائص الأدوية والبيانات الجينية؟ يرجى وصف العملية أو تقديم المصدر.


يمكن للمرء أن يسرد الجينات المرشحة بناءً على وظائفها.

إذا كان الدواء يعمل عن طريق تثبيط التعبير الجينيجيمن أجل تقليل العمليةصثم الجينجي، جميع عناصرها التنظيمية وجميع التسلسلات تشارك في العمليةصهم مرشحون جيدون لمثل هذا التفاعل ويجب التحقيق معهم. إذا كان هناك تباين جيني معروف في السكان في هذه المواقع وإذا علمنا أن هذا الاختلاف الجيني يؤثر على التباين الظاهري ، فعندئذٍ بالتأكيد ، هؤلاء مرشحون جيدون.

ومع ذلك ، على حد علمي ، هذا هو المدى الذي يمكننا الذهاب إليه. يمكننا أن نضع قائمة بالمرشحين ولكن هذا لا يعني بشكل مطلق أن المرشح يجب أن يقدم تفاعلًا مع الدواء محل الاهتمام ولا يعني ذلك أن الجين غير المرشح لن يكون له بالضرورة تفاعل. فقط الاختبار الإحصائي لمثل هذا التفاعل سيسمح للفرد بحل اللغز.


علم الوراثة وعلم التخلق من حقائق الإدمان

لماذا يصبح بعض الناس مدمنين والبعض الآخر لا؟ تشير الدراسات الأسرية التي تشمل التوائم المتماثلة والتوائم المتماثلة والمتبنين والأشقاء إلى أن ما يصل إلى نصف خطر إدمان الشخص للنيكوتين أو الكحول أو المخدرات الأخرى يعتمد على تركيبته الجينية. يعد العثور على الأساس البيولوجي لهذا الخطر وسيلة مهمة للبحث للعلماء الذين يحاولون حل مشكلة إدمان المخدرات.

علم الوراثة هي دراسة الجينات. الجينات هي وحدات وظيفية من الحمض النووي تشكل الجينوم البشري. أنها توفر المعلومات التي توجه الأنشطة الخلوية الأساسية للجسم. أظهرت الأبحاث التي أجريت على الجينوم البشري أن متوسط ​​تسلسل الحمض النووي لأي شخصين هو 99.9٪ متماثل. ومع ذلك ، فإن هذا الاختلاف بنسبة 0.1 في المائة مهم للغاية - فهو يمثل ثلاثة ملايين اختلاف في ما يقرب من ثلاثة مليارات زوج أساسي من تسلسل الحمض النووي! تساهم هذه الاختلافات في الاختلافات الواضحة ، مثل الطول ولون الشعر ، والسمات غير المرئية ، مثل زيادة خطر الإصابة بأمراض معينة أو الحماية منها مثل النوبات القلبية والسكتة الدماغية والسكري والإدمان.

تحدث بعض الأمراض ، مثل فقر الدم المنجلي أو التليف الكيسي ، بسبب تغير يعرف باسم أ طفره، في جين واحد. أصبحت بعض الطفرات ، مثل طفرات BRCA 1 و 2 التي ترتبط بارتفاع خطر الإصابة بسرطان الثدي والمبيض ، أدوات طبية مهمة في تقييم مخاطر إصابة المريض بأمراض خطيرة. حقق الباحثون الطبيون نجاحًا مذهلاً في الكشف عن الجينات الوراثية لهذه الاضطرابات أحادية الجين ، على الرغم من أن إيجاد العلاجات أو العلاجات لم يكن بهذه البساطة. معظم الأمراض ، بما في ذلك الإدمان ، معقدة ، وتساهم الاختلافات في العديد من الجينات المختلفة في المستوى العام للمخاطر أو الحماية لدى الشخص. والخبر السار هو أن العلماء يتابعون بنشاط المزيد من المسارات لعلاج هذه الأمراض المعقدة والوقاية منها.


خلفية

تُعرف القدرة على استجواب الخلفيات الجينية المتعددة بشكل منهجي مع المضطربات الكيميائية باسم التنميط الكيميائي. في حين أن هذا النهج له العديد من التطبيقات في البيولوجيا الكيميائية ، إلا أنه وثيق الصلة بشكل خاص بعلاج السرطان ، حيث يتم وصف المركبات السريرية أو المجسات الكيميائية لتحديد الطفرات التي تُعلم عن نقاط الضعف الجينية أو آليات المقاومة أو الأهداف [1]. قدمت المسوحات المنهجية لتأثيرات اللياقة للاضطرابات البيئية عبر مجموعة حذف الخميرة [2] نظرة ثاقبة لوظيفة الجينات على نطاق واسع ، في حين أن تحديد حساسية الدواء في سلالات حذف الزيجوت متغايرة الزيجوت حدد الخلفيات الجينية التي تؤدي إلى زيادة حساسية الدواء [3]. الآن ، مع ظهور تقنية كريسبر وتكييفها مع شاشات المكتبة المجمعة في خلايا الثدييات ، يمكن إجراء شاشات كيميائية عالية الدقة مباشرة في الخلايا البشرية [4،5،6،7]. تشمل المزايا الرئيسية لهذا النهج القدرة على فحص جميع الجينات البشرية ، وليس فقط أخصائي تقويم العظام للكائنات الحية النموذجية ، وتحليل كيفية اختلاف تفاعلات الجينات الدوائية عبر أنواع الأنسجة المختلفة والخلفيات الجينية والحالات اللاجينية وتحديد القامع وكذلك التفاعلات التآزرية ، والتي قد تشير بشكل استباقي إلى آليات المقاومة المكتسبة أو المصادر الموجودة مسبقًا للخلايا المقاومة في مجموعات الأورام غير المتجانسة.

قد يكون تصميم وتحليل شاشات التفاعل الكيميائي الوراثي بوساطة كريسبر في الخلايا البشرية مشكلة. عادةً ما يكون لشاشات الاختيار الإيجابي التي تحدد الجينات التي تمنح مقاومة للاضطرابات الخلوية نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية ، حيث أن الطفرات فقط في جينات المقاومة تبقى على قيد الحياة. تم استخدام هذا النهج لتحديد الجينات التي تمنح المقاومة للعلاجات المستهدفة ، بما في ذلك مثبطات BRAF و MEK ، وكذلك الأدوية الأخرى [5،6،7،8،9،10،11،12،13]. على العكس من ذلك ، تتطلب شاشات CRISPR ذات التحديد السلبي نمو خلايا مضطربة تزيد عن 10 مرات أو أكثر للسماح بالكشف الحساس عن الجينات التي يؤدي خروجها المغلوب إلى عيوب معتدلة في اللياقة البدنية. تتطلب إضافة اكتشاف التفاعلات الدوائية إلى هذه التجارب إعطاء جرعات بمستويات شبه مميتة لتحقيق التوازن بين الحفاظ على قابلية بقاء الخلية على مدار فترة زمنية طويلة وتحفيز تفاعلات الجينات الدوائية بما يتجاوز تأثيرات الأدوية المحلية [14 ، 15 ، 16 ، 17].

في هذه الدراسة ، نصف عقار Z ، وهو خوارزمية لتحليل شاشات التفاعل الكيميائي الوراثي بوساطة كريسبر. نطبق الخوارزمية لتحديد الجينات التي تدفع المقاومة الخلوية العادية لمثبط أولاباريب PARP في ثلاثة خطوط خلوية. لقد أظهرنا الحساسية المعززة بشكل كبير للدواء Z على الخوارزميات المعاصرة [7 ، 18 ، 19 ، 20] من خلال إظهار كيفية تحديدها لعدد أكبر من الضربات ذات الإثراء العالي لمسار الاستجابة لتلف الحمض النووي المتوقع ، وكذلك كيفية تحديد التفاعلات التآزرية والمثبطة. نوضح كذلك اكتشاف كل من التفاعلات التآزرية والمثبطة في تجربة واحدة مع خطوط خلايا سرطان البنكرياس المتحولة من KRAS والتي عولجت بمثبط ERK ، ومن خلال إعادة تحليل البيانات المنشورة. ومن المثير للاهتمام ، أننا نلاحظ وجود اتجاه عبر العديد من مجموعات البيانات حيث تسجل جينات مثبط الورم كمثبطات للأدوية ، مما يشير إلى مصدر منهجي محتمل للإيجابيات الكاذبة. نحن نقدم جميع البرامج والبيانات [21] اللازمة لتكرار التحليلات المقدمة هنا انظر "توفر البيانات والمواد" أدناه للحصول على الروابط.

تطبيق

خوارزمية DrugZ

نحسب السجل2 أضعاف تغيير كل جرنا في التجمع عن طريق تطبيع إجمالي عدد القراءة لكل عينة (إلى ن = 10 مليون قراءة) في نفس النقطة الزمنية مع أخذ نسبة السجل ، لكل تكرار ، من المعالجة للتحكم في القراءات.

pseudocount = القيمة الافتراضية هي 5

نحن نقدر التباين في كل تغيير أضعاف عن طريق حساب الانحراف المعياري لتغيرات الطية مع الوفرة المماثلة في عينة التحكم:

ن = عدد مرات التغيير مع الوفرة المماثلة (الافتراضي = 1000)

ناديص, أنا = أضعاف التغيير لكل دليل في نسخة مكررة

ثم احسب ض- الدرجات لكل تغيير طية باستخدام هذا التقدير:

الدليل ض- يتم جمع درجات جميع جرنا عبر جميع التكرارات للحصول على مجموع نقاط على مستوى الجينات ، والتي يتم بعد ذلك تطبيعها (عن طريق القسمة على الجذر التربيعي لعدد المصطلحات المجمعة) إلى القاعدة النهائية Z (الشكل 1 ب):

سير العمل. أ تصميم تجريبي. في شاشة التفاعل الجيني الدوائي ، يتم نقل الخلايا بمكتبة CRISPR مجمعة. يتم تقسيم الخلايا إلى عينات تحكم مُعالجة بالعقاقير وغير مُعالجة ، ويتم زراعتها لعدة مضاعفات يتم جمع الحمض النووي الجيني ومقارنة الوفرة النسبية لتسلسلات CRISPR gRNA في المجموعة المعالجة والمجموعة الضابطة. ب تتضمن خطوات معالجة DrugZ تطبيع عدد القراءة ، وحساب تغيير الطية ، وتقدير الانحراف المعياري لكل تغيير في الطية ، ض-تحول الدرجات ، والجمع بين درجات الدليل في درجة الجينات. ج – هـ مقارنة الطرق الحالية مقابل عقار Z لشاشة أولاباريب SUM149PT. تظهر نتائج DrugZ أقوى إثراء لجينات DDR عبر مجموعة من عتبات FDR. ج عدد الزيارات الأولية. د عدد الجينات المشروحة لاستجابة تلف الحمض النووي (DDR) في الضربات. ه سجل ص قيم تخصيب جين DDR باختبار فوق هندسي

أ ص يتم حساب القيمة من المعيار Z وتصحيحها لاختبار الفرضيات المتعددة باستخدام طريقة Benjamini و Hochberg [22]. يمكن تنزيل برنامج Python مفتوح المصدر من github.com/hart-lab/drugz.

خوارزمية DrugGS

بعد تطبيق نهج تقدير تباين Bayes التجريبي على تغييرات لوغاريتمية طبيعية لحساب أ ض- درجات لكل دليل ، طبقنا أخذ عينات جيبس ​​لتوليد التوزيع اللاحق لتغييرات الطيات لكل جين.

كل جين له توزيع يتكون من ض- درجات للأدلة التي تستهدف هذا الجين المحدد عبر التكرارات. يتميز التوزيع بأنه (ميكرومتر, τ)، أين τ هو ( فارك <1> < سيجما ^ 2> ).

على حد سواء μ و لديها معلمات تشعبية (ميكرومتر : ميكرومتر, σ 2 , τ : أ, ب) نقوم بالتهيئة في بداية أخذ العينات.

Γ (أ ، ب) = جاما سابقة مع معلمات فائقة (الشكل) وب (معدل)

ص(ميكرومتر| τ، البيانات)

(ميكرومتر, σ 2) = عادي سابق بـ ميكرومتر (يعني) و σ 2 (التباين) hyperparameters

ثم نقوم بتحديث μ و فيما يتعلق بسابقاتها في كل 1000 عينة ننتجها لكل جين.

تحديث المعادلات ميكرومتر:

تحديث المعادلات τ:

ن = عدد نقاط البيانات (دليل ض-نتائج) لكل جين

( overline ) = المتوسط ​​الفعلي لنقاط البيانات

من هؤلاء الألف الذين تم أخذ عيناتهم حديثًا ميكرومتر و τ، ثم نحسب المتوسط ​​والانحراف المعياري. كل جين ميكرومتر يعني التوزيع اللاحق ما تم تحويله إلى ض- الدرجات وتستخدم للمقارنة مع قيم الدواء Z normZ.

س = عدد العينات (في حالتنا 1000)

شاشات التفاعل الجيني الدوائي

تم وصف شاشات أولاباريب في [14]. تم وصف شاشات Temozolomide في [23].

زراعة الخلايا

تم شراء خلايا hTERT RPE-1 (CRL-4000) و 293 T (CRL-3216) من ATCC ونمت في وسيط Eagle المعدل عالي الجلوكوز في Dulbecco (DMEM HyClone) مع 10 ٪ من مصل الأبقار الجنيني (FBS) ، 1 × GlutaMAX (Gibco ) ، 100 ملي بيروفات الصوديوم (جيبكو) ، 1 × أحماض أمينية غير أساسية (NEAA) ، 1X بنسلين ستربتومايسين (قلم / ستريب) ، و 5 ميكروغرام مل −1 Plasmocure. تم الاحتفاظ بظروف الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون2.

إنتاج الفيروسة البطيئة

لإنتاج الفيروس البطيء TKOV3 ، تم نقل 9.0 × 10 6293T من الخلايا باستخدام psPAX2 (التعبئة والتغليف الفيروسي Addgene # 12260) ، و pMD2.G (VSV-G envelope Addgene # 12259) ، و TKOV3 (Toronto KnockOut CRISPR Library Addgene # 90294) باستخدام X-tremeGENE 9 كاشف ترنسفكأيشن DNA (Sigma-Aldrich) في وسط بتركيز مضاد حيوي منخفض (0.1 × Pen / Strep). تم استبدال الوسيط بوسط الحصاد الفيروسي (DMEM + 1.1٪ BSA + 1 × Pen / Strep) بعد 18 ساعة من الإصابة بالعدوى. تم جمع طاف يحتوي على فيروس

تمت إضافة 24-48 ساعة بعد تعداء العدوى ، ووسط الحصاد الفيروسي الطازج إلى الصفائح المنقولة. تم جمع طاف يحتوي على فيروس مرة أخرى

24 في وقت لاحق. تم طرد الطاف المحتوي على الفيروس لإزالة حطام الخلية وتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

فحص CRISPR

لنقل خلايا hTERT RPE-1 ، تمت إضافة فيروس TKOv3 بـ 8 ميكروغرام / مل من Polybrene. لاختيار الخلايا المنقولة ، تم إدخال بوروميسين بتركيز 20 ميكروغرام / مل في 24 ساعة بعد الإصابة (تحتوي الكاسيت hTERT المستخدم لتخليد خلايا RPE1 على علامة مقاومة بوروميسين ، مما يستلزم تركيزات بوروميسين شديدة للاختيار). استمر اختيار Puromycin لمدة 72 ساعة بعد التحويل واستكمل عند التحديد مقابل الخط الأبوي hTERT RPE-1 كعنصر تحكم. تم اعتبار الانتهاء من الاختيار هو النقطة الزمنية الأولية (تي0). تم تقسيم الخلايا المنقولة TKOv3 إلى مكررات تقنية. لضمان التغطية المناسبة ، تم استخدام 15 × 10 6 خلايا عبر أطباق 11 × 15 سم للعدوى بفيروس TKOv3 لكل مكرر. تمت إضافة أدوية العلاج الكيميائي gemcitabine (2 نانومتر) و vincristine (0.4 نانومتر) إلى مكررات منفصلة ، مع عدم تلقي مجموعة واحدة من التكرارات لأي علاج دوائي. لم يُسمح لكل من التكرارات المعالجة بالأدوية وغير المعالجة بالوصول إلى التقاء الأطباق التي يبلغ طولها 15 سم. تم رفع الخلايا وعدها وإعادة طلاءها عند التغطية المذكورة أعلاه ، وتم تجميد كريات الخلايا الزائدة عند -20 درجة مئوية كنقطة زمنية. بمجرد الوصول إلى 8 مضاعفات من تي0، تم إنهاء الشاشات وتجميد الكريات عند - 20 درجة مئوية. تم الاحتفاظ بتغطية الشاشات عند 200 خلية لكل جرنا.

تم استخدام QIAamp Blood Maxi Kit (Qiagen) لعزل الحمض النووي الجيني (gDNA) من كريات الخلايا المجمدة. تم إثراء تسلسل الدليل باستخدام PCR مع HiFi HotStart ReadyMix (Kapa Biosystems) والبادئات التي تستهدف منطقة الدليل في الحمض النووي الجيني. تم إجراء جولة ثانية من PCR باستخدام بادئات i5 و i7 لإعطاء كل حالة وتكرار رمز شريطي فريد لتعدد الإرسال. تمت تنقية منتجات PCR النهائية باستخدام نظام E-Gel (Invitrogen) ، وتم تطبيعها وتسلسلها على نظام NextSeq500 لتحديد تمثيل الأدلة تحت كل حالة معالجة وغير معالجة.


التفاعلات الدوائية - الدوائية - الجينية

يمكن تقسيم DDGIs إلى ثلاث فئات رئيسية: التفاعلات المثبطة ، والتفاعلات الحثية ، وتفاعلات التحويل الظاهري. يمكن تعريف التفاعلات المثبطة والتحريضية على أنها أي تفاعلات تؤثر على الحرائك الدوائية للعقار المصاب (PK) لزيادة أو تقليل تركيزات الدواء ، على التوالي. يمكن أن يحدث الحث أو التثبيط إما مع إعطاء الدواء الجاني الذي يغير عملية التمثيل الغذائي للدواء الضحية أو نقله ، أو مع وجود متغيرات وراثية لفقدان أو اكتساب الوظيفة (LOF أو GOF) التي تغير وظيفة الإنزيمات التي تغير عملية التمثيل الغذائي أو نقل عقار الضحية ، أو الجمع بينهما. يمكن اعتبار DDGI بمثابة ضربة مزدوجة - حيث يتحد المتغير الجيني والعقار الجاني للعمل على مسارات الناقل أو الأيض لتغيير تركيزات الدواء بشكل كبير. من الممكن أيضًا رؤية التحويل الظاهري - حيث يكون لتأثير الدواء المتفاعل والنمط الجيني تأثيرات معاكسة ، مما يؤدي إلى تحول مؤقت في النمط الظاهري ، على سبيل المثال معادلة / عكس تأثير النمط الجيني GOF عند وصف دواء مثبط. في هذه المراجعة نصف ، بأمثلة ، حالات مختلفة من التفاعلات تحت كل فئة من الفئات الثلاث المذكورة أعلاه ، مع التركيز في البداية على استقلاب الإنزيمات ، قبل التفكير في ناقلات الأدوية.

التفاعلات الجينية لإنزيم التمثيل الغذائي للأدوية (DDMEGIs)

التفاعلات المثبطة

يمكن للتأثيرات المثبطة للعقاقير والنمط الجيني أن تغير استقلاب الركيزة عن طريق كل من الدواء والنمط الجيني الذي يؤثر على نفس إنزيم الأيض ، أو على طريقين متميزين للتمثيل الغذائي.

بشكل عام ، من المتوقع أن تعاني المستقلبات الضعيفة من أعلى تركيز في بلازما الركيزة الدوائية ، مقارنة بالأنماط الجينية الأخرى ، عند التعامل معها بالمثبطات. على سبيل المثال ، تبين أن الإدارة المشتركة لسيمفاستاتين (مثبط CYP2C9) مع الوارفارين (ركيزة CYP2C9) تقلل من متطلبات جرعة الوارفارين في ناقلات CYP2C9 * 3 بنسبة أكبر مقارنة بالناقلات غير الحاملة (29٪ مقابل 5٪ على التوالي) [9 ]. تم الإبلاغ عن نتيجة مماثلة باستخدام السيليكوكسيب (الجدول التكميلي 1) [10]. التأثير التثبيطي للدواء والنمط الجيني ليس مضافًا دائمًا - فالمستقلبات الضعيفة وراثيًا قد يكون لها فقط المزيد من تثبيط الإنزيم المحدود عن طريق إعطاء دواء مثبط. على سبيل المثال ، لوحظ ارتفاع ذو دلالة إحصائية في مستويات البلازما رابيبرازول (ركيزة CYP2C19) في كل من المستقلبات الطبيعية وحاملات النمط الوراثي متغاير الزيجوت بعد العلاج بفلوفوكسامين (مثبط CYP2C19) بينما لم يتم الكشف عن ارتفاع هام سريريًا إضافيًا مع المستقلبات الضعيفة التي سبق لها تجربة أعلى مستويات البلازما رابيبرازول [11]. سيناريو مماثل مع أمثلة أخرى (الجدول التكميلي 1) [12،13،14،15].

عندما يتم استقلاب الدواء بواسطة اثنين أو أكثر من إنزيمات CYP ، فإن تثبيط أحد هذه الإنزيمات بمفرده (عن طريق الدواء أو النمط الجيني) قد يكون له تأثير ضئيل ، بسبب تكرار المسارات. ومع ذلك ، إذا كان النمط الجيني والدواء المتفاعل يؤثران على طرق التمثيل الغذائي المختلفة هذه ، فقد يكون التفاعل كبيرًا جدًا. على سبيل المثال ، لوحظ أنه بالنسبة لـ voriconazole (ركيزة CYP2C19 و CYP3A4) يزداد التوافر البيولوجي بشكل ملحوظ (

5.6 أضعاف) في المرضى الذين قللوا من نشاط CYP2C19 وتم إعطاؤهم مع أتازانافير أو ريتونافير (مثبطات CYP3A4 القوية) [16]. يمكن ملاحظة سيناريو مشابه مع أمثلة أخرى (الجدول التكميلي 1) [17 ، 18 ، 19].

من ناحية أخرى ، تتطلب العقاقير الأولية وظيفة معينة CYPs لتكون فعالة علاجياً ، وفي هذه الحالات يكون التأثير عكس ذلك الموصوف أعلاه. Clopidogrel ، على سبيل المثال ، يتم تنشيطه بواسطة CYP1A2 و CYP2B6 و CYP3A4 و CYP2C9 و CYP2C19 [20]. حاملات متغيرات LOF في واحد أو أكثر من هذه الجينات ويتم تناولها بشكل مشترك مع مثبطاتهم معرضون لخطر متزايد لمقاومة العلاج. على سبيل المثال ، لوحظ أن حاملي CYP2C19 * 2 و / أو * 3 الأليلات الذين عولجوا بمثبطات كلوبيدوجريل ومضخة البروتون (مثبطات CYP2C19) يكونون أكثر عرضة لتقليل فعالية كلوبيدوجريل إضافة عامل خطر ثالث (على سبيل المثال ، قناة الكالسيوم حاصرات (مثبطات CYP3A4)) كانت مرتبطة أيضًا بانخفاض أكبر في فعالية عقار كلوبيدوجريل [21 ، 22].

يوضح الشكل 1 التغيرات المتوقعة لمستويات البلازما للأدوية الفعالة والمستقلبات النشطة للعقاقير الأولية مع وبدون وجود مثبطات و / أو متغيرات LOF.

الدواء الفعال / المستقلبات النشطة المتوقعة لمستويات بلازما العقاقير الأولية والتغيرات في إفراز القنوات الصفراوية بدون أو مع وجود مثبطات أو متغيرات LOF أو كليهما على إنزيمات الأيض. الدواء النشط المتوقع / المستقلبات النشطة لمستويات بلازما العقاقير الأولية والتغيرات في إفراز القنوات الصفراوية بدون (أ -1 / أ -2) أو مع وجود مثبطات أو متغيرات LOF (ب -1 / ب -2) او كلاهما (ج -1 / ج -2) على استقلاب الإنزيمات. أ -1 / أ -2 تمثل السيناريو العادي مع عدم وجود دواء متفاعل أو متغير جيني. في ب -1 / ب -2 إما عقار مثبط أو متغير لفقدان الوظيفة (LOF) في إنزيم الأيض ، مما يؤدي إلى انخفاض التمثيل الغذائي إلى المستقلبات غير النشطة ، وزيادة (ب -1)/انخفضت (ب -2) دواء فعال في الدورة الدموية الجهازية. في ج -1 / ج -2 يتحد وجود الدواء المثبط والمتغير الجيني LOF لإنتاج زيادة أكبر (ج -1)/ينقص (ج -2) في التركيز الجهازي للدواء الفعال

تفاعلات الحث

زيادة التمثيل الغذائي للعقاقير الفعالة بواسطة محفز الإنزيم أو متغير GOF سيؤدي إلى تقليل فعالية الدواء المصاب. على سبيل المثال ، عندما يتم وصف voriconazole (ركيزة CYP2C19) بالاشتراك مع carbamazepine (محفز CYP2C19) ، عادة ما يتم زيادة جرعة voriconazole للتغلب على هذا التمثيل الغذائي المتزايد. في تقرير حالة ، لم تتحقق التركيزات العلاجية من فوريكونازول ، حيث حمل المريض نوعين من GOF CYP2C19 * 17 [23].

يظهر التأثير المعاكس مع العقاقير الأولية. زيادة التمثيل الغذائي عن طريق دواء محفز للإنزيم أو متغير GOF ، سيؤدي إلى ارتفاع مستويات البلازما من المستقلبات النشطة مما يؤدي إلى زيادة الآثار الجانبية و / أو الفعالية. وهكذا ، فإن المرضى الذين يحملون CYP2C19 * 17 متغيرات GOF قد زادوا تحويل كلوبيدوجريل إلى مستقلبات نشطة مما أدى إلى انخفاض أحداث القلب والأوعية الدموية و / أو زيادة نوبات النزيف [24،25،26،27،28،29،30،31،32،33]. من المتوقع أن تؤدي الإدارة المشتركة لمحفز لـ CYP1A2 و CYP2C9 و / أو CYP3A4 إلى فعالية أكبر من عقار كلوبيدوجريل ، مع زيادة خطر النزيف ، ولكن لم يتم نشر أي دراسات لإثبات ذلك.

يوضح الشكل 2 التغيرات المتوقعة لمستويات البلازما للأدوية النشطة والمستقلبات النشطة للعقاقير الأولية مع وبدون وجود محرضات و / أو متغيرات GOF.

يتغير الدواء الفعال / المستقلبات النشطة المتوقعة لمستويات بلازما العقاقير الأولية والإفراز الصفراوي مع وجود محرضات أو متغيرات GOF أو كليهما على إنزيمات الأيض. الدواء النشط المتوقع / المستقلبات النشطة لمستويات بلازما العقاقير الأولية والتغيرات في إفراز القنوات الصفراوية بدون (أ -1 / أ -2) أو مع وجود محرضات أو متغيرات GOF (ب -1 / ب -2) او كلاهما (ج -1 / ج -2) على استقلاب الإنزيمات. أ -1 / أ -2 تمثل السيناريو العادي مع عدم وجود دواء متفاعل أو متغير جيني. في ب -1 / ب -2 إما دواء محفز أو متغير اكتساب الوظيفة (GOF) في إنزيم الأيض ، يؤدي إلى زيادة التمثيل الغذائي إلى المستقلبات غير النشطة ، وانخفاض (ب -1)/زيادة (ب -2) دواء فعال في الدورة الدموية الجهازية. في ج -1 / ج -2 يتحد وجود الدواء المحرض والمتغير الجيني GOF لإنتاج انخفاض أكبر(ج -1)/يزيد(ج -2) في التركيز الجهازي للدواء الفعال

تفاعلات التحويل الظاهري

كما هو موضح أعلاه ، يمكن رؤية تحول مؤقت في النمط الظاهري عندما يتعارض العقار الجاني والتأثير الجيني. على سبيل المثال ، يؤدي وجود متغيرات CYP2C9 منخفضة الوظيفة إلى انخفاض التمثيل الغذائي لتولبوتاميد (ركيزة CYP2C9) ، ومع ذلك فإن العلاج المشترك مع ريفامبيسين (محفز CYP2C9) في هؤلاء المرضى يعكس هذا التأثير الجيني مما يؤدي إلى زيادة مضاعفة في تصفية تولبوتاميد [34] . على العكس من ذلك ، فإن علاج مثبطات مضخة البروتون (مثبطات CYP2C19) باستخدام عقار كلوبيدوجريل ينتج عنه تحويل ظاهري في النمط الظاهري فائق السرعة المحدد وراثيًا إلى حالة التمثيل الغذائي الضعيفة المشار إليها بفقدان فعالية عقار كلوبيدوجريل [35].

يتمثل الجانب المفيد لتفاعلات التحويل الظاهري في أنه يمكن تطبيع الأنماط الظاهرية المحددة وراثيًا عن طريق إضافة الأدوية ذات التأثيرات المعاكسة على عملية التمثيل الغذائي. على سبيل المثال ، تم عكس مقاومة nortriptyline (ركيزة CYP2D6) بسبب التمثيل الغذائي السريع بشكل غير طبيعي وتطبيعها بنجاح مع إضافة الباروكستين أ (مثبط CYP2D6) ، والذي ينتج عنه استعادة مستويات البلازما العلاجية من nortriptyline [36].

يعرض الشكل 3 سيناريوهات مختلفة لتفاعلات التحويل الظاهري.

سيناريوهات مختلفة لتفاعلات التحويل الظاهري حيث يمكن عكس التأثيرات الجينية أو تحويلها في الاتجاه المعاكس. أ يمثل السيناريو الطبيعي مع عدم وجود دواء متفاعل أو متغير جيني. في ب ينعكس تأثير متغير فقدان الوظيفة (LOF) أو متغير اكتساب الوظيفة (GOF) بوجود عقار محفز معتدل أو عقار مثبط معتدل على التوالي وينتج عن نتيجة سريرية مشابهة للحالة الطبيعية (أ). في ج أدى وجود دواء محفز قوي إلى تحويل حالة التمثيل الغذائي السيئة مؤقتًا إلى حالة التمثيل الغذائي السريع ويؤدي إلى انخفاض الدواء النشط في الدورة الدموية الجهازية. في د أدى وجود عقار مثبط قوي إلى تحويل حالة التمثيل الغذائي السريع مؤقتًا إلى حالة التمثيل الغذائي السيئة ويؤدي إلى زيادة الدواء النشط في الدورة الدموية الجهازية

تفاعلات جينات ناقلات الأدوية (DDTGIs)

يتحكم ناقلات الأدوية في حركة المركبات الصيدلانية من وإلى أنسجة الجسم المختلفة. الكبد والكلى والحاجز الدموي الدماغي (BBB) ​​والأمعاء هي المواقع الرئيسية للناقلات التي تؤثر على عقار PK. بالإضافة إلى تلخيص توزيع وتوطين الناقلات ، يصنف الشكل 4 أيضًا الناقلات إلى ثلاث فئات وفقًا لتشابه اتجاهات النقل في أنواع الأنسجة المختلفة (تمت صياغة الشكل بمساعدة المرجع [37]). تمت دراسة التفاعلات بين الأدوية والعقاقير والجينات للناقلات بشكل أقل من دراسة تفاعلات التمثيل الغذائي للإنزيمات. لكل مجموعة فرعية ، سيتم استخدام دراسات التفاعل الجيني لنقل الأدوية (DTGI) (في حالة عدم توفر دراسات DDTGI مباشرة) لتوضيح كل آلية للتفاعل المحتمل. على غرار سيناريوهات إنزيم استقلاب الدواء الموضحة أعلاه ، نتوقع أن هذه التفاعلات قد يتم تكثيفها أو عكسها ، عبر مسارات مثبطة / تحريض أو تحويل ظاهري ، مع الإدارة المشتركة للمثبطات أو المحرضات.

ناقلات الأدوية مصنفة إلى ثلاث فئات حسب تشابه اتجاهات النقل في أنواع الأنسجة المختلفة. أرقام من إلى = ترتيب حركة الدواء عن طريق الفم من خلال أنواع الأنسجة المختلفة. تتجاوز تركيبات الأدوية غير الفموية تأثير الناقلات المعوية. / = زيادة / انخفاض مستوى بلازما الركيزة للدواء متوقع نتيجة لضعف هذا الناقل بسبب متغيرات LOF أو مثبطات. يتم توقع العكس مع المتغيرات أو المحرضات GOF. من المتوقع أن يؤدي وجود هذين العاملين (أي متغير LOF + مثبط أو متغير GOF + محفز) إلى مضاعفة التأثير السريري مع تحييد أو تحويل التأثير السريري عندما يتعارض عقار التحضير والتأثير الجيني (تفاعلات التحويل الظاهري). = غشاء قمي. = غشاء باسولاتيرال

ناقلات التدفق

تم تصنيف ناقلات التدفق إلى مجموعتين (المجموعة الأولى والمجموعة الثانية) وفقًا للتشابه في اتجاهات النقل.

المجموعة الأولى

يتم التعبير عن P-glycoprotein 1 (P-gp ، ABCB1) ، والبروتين 2 المرتبط بمقاومة الأدوية المتعددة (MRP2 ، ABCC2) ، والبروتين المقاوم لسرطان الثدي (BCRP ، ABCG2) في الأمعاء ، والكبد ، والكلى ، و BBB ، ويتشاركان نفس الشيء ممرات النقل. إنها تتدفق إلى تجويف الأمعاء ، وتسهل إفراز الكبد والكلى (باستثناء BCRP) ، وتعمل بشكل عكسي في BBB حيث تحمي الدماغ من دخول المواد الغريبة الحيوية وتعيدها إلى الدورة الدموية الجهازية. من المتوقع أن يؤدي إعاقة وظيفتها في الأمعاء أو الكبد أو الكلى إلى زيادة التعرض الجهازي للركيزة (على الرغم من أنه يمكن توقع التأثيرات المعاكسة إذا تم تثبيط النقل عبر BBB).

في هذه المجموعة ، يأتي معظم الدليل على DDTGI من الأدوية التي تغير نقل ABCB1 (P-gp) والمتغيرات الجينية في الجين الذي يشفر هذا الناقل. على سبيل المثال ، السيكلوسبورين عبارة عن ركيزة ABCB1. ثبت أن الديلتيازيم (مثبط ABCB1 معتدل [38]) يزيد من تركيزات حوض السيكلوسبورين في المرضى الصينيين الذين يحملون النمط الجيني TT (نشاط P-gp منخفض) عند rs1045642 (C & gtT) في ABCB1 ولكن لم يلاحظ أي تأثير في الأنماط الجينية الأخرى ABCB1 ( على سبيل المثال ، CC في rs1045642) [39]. الميثادون هو أيضًا ركيزة P-gp ، تعمل في الدماغ وتدفق عبر BBB عبر P-gp. المرضى الذين يعانون من النمط الوراثي TT في rs1045642 والمعالجين بالكويتيابين (مثبط ABCB1) شهدوا أقل زيادة في مستويات بلازما الميثادون مقارنة مع أولئك الذين لديهم طرز وراثية CT أو CC (3٪ مقابل 23٪ مقابل 33٪ على التوالي) [40]. يمكن تفسير انخفاض مستويات الميثادون في البلازما في هذه الدراسة بفقدان وظيفة الحماية ABCB1 في BBB مما يؤدي إلى زيادة التركيز داخل الدماغ لعقار الجهاز العصبي المركزي (CNS). نتيجة لآلية DDTGI مشابهة ، ارتبط عقار جرانيسترون الخاص بالجهاز العصبي المركزي بزيادة الفعالية في الموضوعات اليابانية (الجدول التكميلي 1) [41].

في بعض الحالات ، يبدو أن إضافة مثبطات قوية تلغي تأثير التركيب الجيني. على سبيل المثال ، لم يتم الكشف عن أي تأثيرات مثبطة إضافية في ناقلات أنماط وراثية مختلفة من المتغير rs1045642 (C & gtT) ABCB1 الذين كانوا إما على تركيبة دابيغاتران / ريفاروكسابان-كلاريثروميسين أو تركيبة تاكروليموس-إيتراكونازول (ABCB1 ركائز- ABCB1 مثبطات قوية [38]) ، 43].

من المتوقع أن يتبع ABCC2 و ABCG2 سيناريوهات تفاعل مماثلة مثل ABCB1 ، ومع ذلك لم نتمكن من العثور على أي دراسات تبلغ عن DDTGIs لهذه الناقلات.

المجموعة الثانية

على عكس ناقلات المجموعة الأولى ، لا توجد دراسات منشورة تصف DDTGIs لناقلات المجموعة الثانية. لذلك نُبلغ هنا عن DGTIs لتسليط الضوء على الآليات المحتملة التي قد تؤثر بها الجينات والأدوية التي تغير هذه الناقلات على نتائج الأدوية. تشترك MRP1 (ABCC1) و MRP3 (ABCC3) و MRP4 (ABCC4) في اتجاه النقل المماثل في الكلية و BBB مثل ناقلات المجموعة الأولى. ومع ذلك ، في الكبد ، يتم التعبير عنها في الغشاء القاعدي الذي يعمل على ضخ الأدوية مرة أخرى في الدورة الدموية الجهازية. MRP1 ، على سبيل المثال ، ينقل المستقلب النشط للإرينوتيكان (SN-38) من خلايا الكبد إلى الدم مما يساهم في الآثار الجانبية المعروفة لقلة العدلات التي يسببها إرينوتيكان [44]. متغير الوظيفة المصغرة ، rs17501331 ، في ABCC1 يرتبط الجين بانخفاض معدل قلة العدلات ، وقد تم اكتشاف التأثير العكسي مع متغير GOF rs6498588 في نفس الجين [45]. في بعض الحالات ، يمكن أن يكون زيادة نشاط ناقل MRP1 مفيدًا ، كما يتضح من السمية الكبدية للميثوتريكسات حيث ABCC1 يعتبر متغير rs246240 (A & gtG) أكثر عرضة للإصابة بسمية الميثوتريكسات مقارنة بحاملات الأليلات الوظيفية المنخفضة [46]. من الجدير بالذكر أن MRP1 يتم التعبير عنه أيضًا في عضلة القلب التي تحمي القلب من دخول الكائنات الحيوية [47]. على سبيل المثال ، يؤدي انخفاض النقل المرتبط بـ rs45511401 (G & gtT) في ABCC1 إلى زيادة فرصة تطوير السمية القلبية بسبب التراكم داخل الخلايا للدوكسوروبيسين [48]. يتم التعبير عن MRP1 و MRP3 ، على عكس P-gp و MRP2 و BCRP ، في الغشاء الجانبي الجانبي لركائز تدفق الأمعاء في دوران البوابة. نظرًا لأن الأدوية التي يتم تناولها عن طريق الفم تتعرض أولاً للناقلات المعوية ، فإن أي تعديل في دورها قد يؤثر على تركيز الدواء في الأنسجة الأخرى (الكبد أو الكلى أو BBB). C.1037 C & gtT و c.1820G & gtA ABCC3 ، على سبيل المثال ، لها نشاط نقل منخفض [49] مما يشير إلى قدرتها على تقليل التوافر الحيوي لركائز MRP3 عن طريق الفم بغض النظر عن التغيير اللاحق في النقل إلى الأنسجة الأخرى ، أو التمثيل الغذائي اللاحق.

Uptake Transporters (المجموعة الثالثة)

في الكبد والكلى و BBB ، جميع ناقلات الامتصاص المهمة (ناقلات الكاتيون العضوية (OCTs) 1/2/3 ، بولي ببتيد عضوي لنقل الأنيون (OATP) 1B1 / 1B3 / 2B1 ، وبروتينات البثق المركب السامة والمتعددة الأدوية (MATE) 1/2) ، اتبع طريقًا رئيسيًا متطابقًا لنقل ركائزها: من الدورة الدموية الجهازية إلى الأنسجة المختلفة أو البول / الصفراء في حالة MATEs. وبالتالي ، فإن تقليل أو زيادة قدرات النقل هذه من شأنه أن يؤدي إلى زيادة أو انخفاض تركيزات الأدوية الجهازية على التوالي. تظهر التأثيرات العكسية مع ناقلات الامتصاص المعبر عنها في الغشاء القمي المعوي مثل OATPs و OCT1 لأن مسار النقل في الاتجاه المعاكس.

في بعض الحالات ، يمكن أن يؤدي تغيير وظيفة ناقل الامتصاص إلى زيادة التفاعلات الدوائية الضائرة. على سبيل المثال ، لوحظ أن ناقلات اثنين OCT1 (SLC22A1) كانت الأليلات الوظيفية المنخفضة التي عولجت بمثبطات OCT1 أكثر عرضة للإصابة بآثار جانبية معدية معوية بأكثر من أربع مرات مع علاج الميتفورمين (ركيزة OCT1) ، والتي يمكن أن تُعزى إلى تراكم الميتفورمين في تجويف الأمعاء (بافتراض توطين OCT1 القمي) [50] . تم دعم هذه النتيجة من خلال دراسة سابقة [51]. على مستوى ناقلات الامتصاص الكلوي ، تم الإبلاغ عن DDTGIs أخرى حيث تم ربط حمل الأليلات الطافرة والإعطاء المشترك للمثبطات بزيادة مستويات / سمية ميتفورمين في بلازما الدم أو انخفاض التخليص (انظر الجدول التكميلي 1) [52 ، 53]. على النقيض من ذلك ، قد يقلل تقليل النقل في بعض الحالات من بعض الآثار الجانبية. على سبيل المثال ، سيسبلاتين (أ OCT2 (SLC22A2) الركيزة) هو عامل سام للكلية وعامل سام للأذن. تمت حماية الأشخاص الذين يحملون طفرة OCT2 rs316019 (C & gtA) من هذه التفاعلات الضائرة لأن المتغير أدى إلى انخفاض نقل السيسبلاتين إلى الكلية والأذن الداخلية (القوقعة) (حيث يتم التعبير عن OCT2 أيضًا) [54،55،56].

في كثير من الحالات ، تعتمد فعالية الدواء على قدرة هذا الدواء على الوصول إلى أنسجة معينة. يتم تناول الستاتينات في الكبد عن طريق OATP1B1 (SLCO1B1) وهذا أمر حاسم لتأثيرها الخافض للدهون. إن تقليل مسار الامتصاص هذا يقلل من فعالية الستاتين ويزيد من تركيزات البلازما ، مما يؤدي إلى اعتلال عضلي ، ونادرًا ، انحلال الربيدات. تمت دراسة متغير rs4149056 (T & gtC) (SLCO1B1 * 15) على نطاق واسع ، وفي 23 دراسة [57،58،59،60،61،62،63،64،65،66،67،68،69،70،71 ، 72،73،74،75،76،77،78،79] ، تم ربط هذا المتغير باستمرار بزيادة التعرض لبلازما الستاتين ، وآلام العضلات ، وتقليل الجرعة ، و / أو الأنماط الظاهرية المقاومة للعلاج. تم وصف عدد من DDGIs الأخرى لناقل SLCO1B1. على سبيل المثال ، على الرغم من أن الزيادة في برافاستاتين (ركيزة SLCO1B1) AUC بعد العلاج باستخدام ريتونافير (مثبط SLCO1B1) لم تكن ذات دلالة إحصائية (زيادة بنسبة 21٪ مقابل برافاستاتين وحده) ، لوحظ تفاعل كبير في أولئك الذين يحملون SLCO1B1 * 15 أو * 17 أنماط فردانية ، مع ارتفاع بنسبة 113٪ في برافاستاتين AUC [80]. كما تم نشر DDTGIs الأخرى ذات الآلية المماثلة (انظر الجدول التكميلي 1) [81،82،83]. ومن المثير للاهتمام ، على عكس مثال ريتونافير الموضح للتو ، في بعض الحالات ، لا تظهر متغيرات الوظيفة المخففة أي تغيير مهم في PK إلا بعد إضافة المثبطات. على سبيل المثال ، المرضى الذين يعانون من الأنماط الجينية AG أو AA في rs2289669 (G & gtA) لناقل MATE1 كان لديهم فقط تخليص أقل بكثير من الميتفورمين (ركيزة MATE1) مقارنة مع حاملي النمط الجيني GG بعد العلاج بالرانيتيدين (مثبط MATE1) [84].


المشهد الجيني للتفاعل المادي

السؤال الرئيسي في علم الوراثة البشرية وعلم الأحياء التطوري هو كيف تتحد الطفرات في الجينات المختلفة لتغيير الأنماط الظاهرية. استفادت الجهود المبذولة لرسم خريطة التفاعلات الجينية بشكل منهجي من عمليات حذف الجينات. ومع ذلك ، فإن معظم التنوعات الجينية تتكون من طفرات نقطية ذات تأثيرات متنوعة ويصعب التنبؤ بها. هنا ، من خلال تطوير مقايسة تفاعل بروتين جديدة قائمة على التسلسل - deepPCA - قمنا بتحديد تأثيرات & gt120.000 زوج من الطفرات النقطية على تكوين معقد عامل النسخ AP-1 بين منتجات FOS و JUN proto-oncogenes. التفاعلات الجينية وفيرة في كل من رابطة الدول المستقلة (ضمن بروتين واحد) و عبر (بين الجزيئين) وتتكون من فئتين - تفاعلات مدفوعة بالديناميكا الحرارية التي يمكن التنبؤ بها باستخدام نموذج عالمي ثلاثي المعلمات ، والتفاعلات الهيكلية بين البقايا القريبة. تكشف هذه النتائج كيف تولد التفاعلات الفيزيائية تفاعلات جينية يمكن التنبؤ بها كميًا.

الكلمات الدالة: S. cerevisiae البيولوجيا الحسابية الطفرات العميقة الرعاف التفاعل الجيني تفاعلات البروتين البشري أنظمة عوامل النسخ البيولوجية.

بيان تضارب المصالح

GD، BL لم يتم الإعلان عن أي مصالح متنافسة

الأرقام

( أ ) نطاقات Leucine zipper (ملونة) ومواقف heptad للإنسان ...

الشكل 1 - ملحق الشكل 1 .. مراقبة جودة ...

الشكل 1 - الشكل الملحق 1 .. مراقبة الجودة لدرجات PPI المقاسة بواسطة deepPCA .

الشكل 2 .. آثار الطفرات الفردية.

الشكل 2 .. آثار الطفرات الفردية.

( أ ) خريطة الحرارة لدرجات PPI ذات الطفرات الفردية ...

الشكل 2 - الشكل الملحق 1 .. آثار متحولة واحدة.

الشكل 2 - الشكل الملحق 1 .. آثار متحولة واحدة.

( أ ) توزيع تأثيرات الطفرات الفردية ...

الشكل 3 .. نموذج ديناميكي حراري يتنبأ بمضاعفة ...

الشكل 3 .. نموذج ديناميكي حراري يتنبأ بنتائج طفرة مزدوجة.

( أ ) توزيع مزدوج ...

الشكل 3 - ملحق الشكل 1 .. الارتباطات بين الجينات ...

الشكل 3 - ملحق الشكل 1 .. الارتباطات بين درجات التفاعل الجيني من التكرارات البيولوجية الثلاثة لـ ...

الشكل 3 - ملحق الشكل 2 .. تركيب الديناميكا الحرارية ...

الشكل 3 - الشكل الملحق 2 .. تركيب النموذج الديناميكي الحراري على عبر بيانات المكتبة.

الشكل 4 .. التفاعلات الجينية البنيوية.

الشكل 4 .. التفاعلات الجينية البنيوية.

( أ ) خريطة الحرارة ( أعلى ) والتوزيع (...

الشكل 4 - ملحق الشكل 1 .. توزيع العدد ...

الشكل 4 - ملحق الشكل 1 .. توزيع عدد التفاعلات الجينية المهمة لـ Fos أو Jun ...

الشكل 4 - ملحق الشكل 2 .. متانة الإثراء ...

الشكل 4 - ملحق الشكل 2 .. متانة الإثراء في أزواج المواضع من أجل (FDR

الشكل 4 - ملحق الشكل 3 .. متانة الإثراء ...

الشكل 4 - الشكل الملحق 3 .. متانة التخصيب في السمات الهيكلية للمهمة (FDR

الشكل 5 .. مقارنة الطفرة المزدوجة ...

الشكل 5 .. مقارنة بين نتيجة الطفرة المزدوجة والتفاعلات الجينية في رابطة الدول المستقلة و عبر…

الشكل 5 - ملحق الشكل 1 .. درجات مؤشر أسعار المنتجين لـ ...

الشكل 5 - الشكل الملحق 1 .. عشرات PPI ل رابطة الدول المستقلة مكتبة.

( أ ) العلاقة بين…

الشكل 5 - الشكل الملحق 2 .. نسبة رابطة الدول المستقلة ...

الشكل 5 - الشكل الملحق 2 .. نسبة رابطة الدول المستقلة و عبر طفرات مزدوجة مصنفة على أنها تقوية ، وسيطة ...

الشكل 5 - الشكل الملحق 3 .. تركيب الديناميكا الحرارية ...

الشكل 5 - الشكل الملحق 3 .. تركيب النموذج الديناميكي الحراري على كل من عبر و رابطة الدول المستقلة البيانات.

الشكل 5 - الشكل الملحق 4 .. الجينات البنيوية الهامة ...

الشكل 5 - الشكل الملحق 4 .. التفاعلات الجينية الهيكلية الهامة في رابطة الدول المستقلة و عبر .

الشكل 5 - ملحق الشكل 5 .. مقارنات بين ...

الشكل 5 - الشكل الملحق 5 .. مقارنات لأنماط التفاعلات الجينية البنيوية في رابطة الدول المستقلة و…

الشكل 5 - ملحق الشكل 6 .. مقارنات بين ...

الشكل 5 - ملحق الشكل 6 .. مقارنات بين أزواج من المواقف المخصبة في رابطة الدول المستقلة و عبر…

الشكل 5 - ملحق الشكل 7 .. متانة ...

الشكل 5 - ملحق الشكل 7 .. متانة الإثراء في السمات الهيكلية عند أخذ عينات فرعية لمطابقة ...

الشكل 5 - ملحق الشكل 8 .. متانة الإثراء ...

الشكل 5 - الشكل الملحق 8 .. متانة التخصيب بشكل كبير (FDR cis and عبر المكتبات.

الشكل 5 - ملحق الشكل 9 .. مقارنات بين ...

الشكل 5 - الشكل الملحق 9 .. مقارنات لمدى التفاعلات الجينية الهيكلية في رابطة الدول المستقلة و…


نقاش

في هذه الدراسة ، قمنا باختبار فكرة أن تفاعلات الأنواع ذات التأثيرات الإيجابية على المستوى الفردي تزيد من معدلات التنويع في السلالات التي توجد فيها ، في حين أن الأنواع ذات الآثار السلبية تقلل من معدلات التنويع. نحن نستفيد من العشرات من دراسات علم الوراثة التي فحصت العلاقة بين تفاعلات الأنواع ومعدلات التنويع. تشير نتائجنا إلى وجود أنماط عامة عبر النباتات والحيوانات ، على الرغم من عدم اليقين الكبير في الأدبيات حول كيفية تأثير تفاعلات الأنواع على التنويع (على سبيل المثال Jablonski، 2008 Ricklefs، 2010 Weber وآخرون. ، 2017 تشوميكي وآخرون. ، 2019 Hembry and Weber ، 2020). نناقش أدناه الأسباب المحتملة لهذه الأنماط وآثارها الأوسع.

كيف تؤثر تفاعلات الأنواع على معدلات التنويع؟

وجدنا أن تفاعلات الأنواع ذات التأثيرات الإيجابية على المستوى الفردي تزيد بشكل عام من معدلات التنويع وأن تفاعلات الأثر السلبي تقلل من التنويع. على مستوى ما ، هذه النتائج منطقية بديهية. بعد كل شيء ، قد يُتوقع أن يؤدي التفاعل الذي له آثار سلبية على اللياقة البدنية على الأفراد إلى زيادة الانقراضات على مستوى الأنواع على مدى فترات زمنية أطول. وبالمثل ، فإن السمات التي تزيد من لياقة الفرد قد تمنع الكليد من الانقراض ، وبالتالي تعزز استمراره وانتشاره على المدى الطويل. ومع ذلك ، فمن غير الواضح كيف أن زيادة اللياقة الفردية ستؤدي بالضرورة إلى زيادة معدلات التكاثر. تتمثل إحدى الآليات المحتملة في أن أحجام الأعداد الكبيرة قد تؤدي إلى توسيع النطاق على مستوى الأنواع (مثل Ricklefs ، 2010) ، والذي يمكن أن يؤدي بعد ذلك إلى نطاقات أكبر على مستوى الكليد (مثل الانتشار إلى مناطق جديدة) ، والتي يمكن أن تزيد من معدلات التنويع (مثل Gómez و Verdú، 2012 Hernández-Hernández and Wiens، 2020).

تشوميكي وآخرون. (2019) ناقش الآليات الأخرى التي قد تؤدي التفاعلات الإيجابية (على وجه التحديد التبادلية) إلى زيادة معدلات التنويع ، والتي تبدو ذات صلة بشكل عام هنا. بالإضافة إلى زيادة حجم النطاق ، ناقشوا أيضًا الاختيار المتباين والفرص البيئية وتقليل الانقراض. نناقش هذه بدورها أدناه. أحد الأمثلة على الكيفية التي قد يؤدي بها الانتقاء المتباين إلى زيادة التنويع يتضمن تلقيح الحيوانات في النباتات البرية (خاصة كاسيات البذور) ، وهي سمة مرتبطة بشكل كبير بمعدلات التنويع المتزايدة عبر النباتات (Hernández-Hernández and Wiens، 2020). قد تكون هذه الزيادة قد حدثت من خلال زيادة العزلة الإنجابية والانتواع بين الأنواع النباتية ، بوساطة الاختيار المتباين المرتبط بالتحولات في أنواع الملقحات ومورفولوجيا الزهور (مثل Whitehead and Peakall ، 2014). قد تكون تأثيرات الملقحات المختلفة على الانتواع مهمة بشكل خاص بالاقتران مع عوامل عزل أخرى (تمت مراجعتها في Kay and Sargent ، 2009). قد يكون تبديل الشريك بشكل عام دافعًا مهمًا للتنويع في الصفائح مع التبادلية (Chomicki وآخرون. ، 2019) ومع الخصومات (مثل الطفيليات).

يُعتقد أن الفرصة البيئية تغذي الإشعاع التكيفي وبالتالي التنويع السريع (مثل Yoder وآخرون. ، 2010) ، ربما من خلال استخدام موارد جديدة والتحرر من قيود المنافسة والموارد المحدودة. قد تكمن الفرصة البيئية في كل من التأثيرات الإيجابية للتبادل على التنويع ، والآثار الإيجابية للتفاعلات العدائية للفرع البؤري.

يمكن أيضًا زيادة معدلات التنويع على مستوى Clade عن طريق تقليل معدلات الانقراض على مستوى الأنواع ، من خلال زيادة بقاء الأفراد المشاركين في التبادل. على سبيل المثال ، تتضمن إحدى السمات التبادلية التي تم النظر فيها هنا رحيق الأزهار الإضافية (Weber and Agrawal ، 2014). توفر هذه الرحيق الرحيق للحشرات التي تدافع بعد ذلك عن النباتات ضد الحيوانات العاشبة ، وترتبط بمعدلات تنوع أعلى في النباتات (Weber and Agrawal ، 2014). قد تقلل هذه المدافعات عن الحشرات من خطر انقراض هذه الأنواع النباتية (على الرغم من عدم اختبارها صراحة من قبل Weber and Agrawal ، 2014).

تشوميكي وآخرون. وصف (2019) أيضًا الآليات التي قد تقلل من خلالها التبادلية معدلات التنويع بدلاً من ذلك ، بما في ذلك تثبيت الاختيار المرتبط بالتطور المشترك ، وتقليل التنوع الجيني للمتعايشين وزيادة خطر الانقراض المرتبط بانخفاض النطاق المتخصص أو ارتفاع تكاليف اللياقة البدنية لفقدان الشريك. قد تنطبق هذه الآليات على بعض نتائجنا التي كانت معاكسة للأنماط المتوقعة ، وخاصة التفاعلات ذات التأثير الإيجابي التي قللت من معدلات التنويع في بعض الحيوانات.

على مستوى ما ، قد تبدو نتائجنا مخالفة لدراسة المحاكاة التي أجراها Yoder و Nuismer (2010). وخلصوا إلى أن تأثير التفاعلات التطورية المشتركة على التنويع يعتمد على نوع التفاعل ، حيث من المحتمل أن تزيد المنافسة وخصم الطفيليات بين العائل من التنويع (عندما تكون هناك تكلفة لمطابقة الأنماط الظاهرية بين المتفاعلات) ، والمفاهيم المتبادلة التي تقيد التنويع. ومع ذلك ، في تلك الدراسة ، أشار "التنويع" إلى التباين في سمة نمطية واحدة بين نوعين متفاعلين. وبالتالي ، قد لا تُعمم هذه النتائج على معدلات التكاثر والانقراض بين عشرات إلى آلاف الأنواع على مدى عشرات الملايين من السنين (تركيزنا هنا). نقترح أن هناك حاجة إلى نظرية جديدة ، بناءً على Yoder و Nuismer (2010) ، لمعالجة تأثير الأنواع المختلفة من تفاعلات الأنواع على معدلات الانتواع والانقراض على مدى فترات التطور الكبير.

هناك أيضًا مجموعة من الأعمال التجريبية والنظرية التي تشير إلى أن المنافسة تدفع بالانتواع (على سبيل المثال Schluter، 1994، 2000 Dieckmann and Doebeli، 1999) ، والذي يبدو مخالفًا لاستنتاجنا أن المنافسة تقلل التنويع. ومع ذلك ، هناك أيضًا العديد من الدراسات التي تشير إلى أن المنافسة تعيق التنويع ، وخاصة الدراسات التي تقترح أن الإشعاعات التكيفية تحدث عندما تكون هناك فرصة بيئية مرتبطة بالإطلاق التنافسي (مثل Yoder وآخرون، 2010). قد تكون تأثيرات المنافسة محددة النطاق ، مع وجود منافسة غير محددة تقود الأنواع البيئية بين السكان على فترات زمنية أقصر ، والمنافسة بين الأنواع تقلل التنويع على فترات زمنية أطول (Hembry وآخرون، 2014). نتائجنا ، التي تظهر أهمية المنافسة بين الأنواع في خفض معدلات التنويع على مدى فترات التطور الكلي ، تتفق مع هذه الفكرة. الأهم من ذلك ، أن نتائجنا لا تستبعد إمكانية أن تساعد المنافسة أيضًا في دفع انتشار الأنواع ، خاصة في النطاقات الزمنية الضحلة.

بشكل عام ، قد تعتمد الآليات المحددة التي من خلالها تزيد تفاعلات الأنواع أو تنقص التنويع على التفاعل والأصناف. ومع ذلك ، قد تكون بعض الآليات عامة ، مثل الروابط بين اللياقة ، وحجم السكان ، وأحجام النطاق ، والانقراض والانتواع ، وإمكانية تبديل الشركاء لدفع التنويع.

المحاذير المحتملة

نقر بالعديد من المحاذير المحتملة فيما يتعلق بتحليلاتنا. أولاً ، تحليلاتنا مترابطة فقط. لذلك ، من الممكن أنه في بعض الحالات ، كان التأثير الواضح لتفاعل الأنواع على معدلات التنويع ناتجًا بالفعل عن عامل آخر بدلاً من ذلك. ومع ذلك ، يبدو من غير المحتمل أن يفسر هذا النمط العام عبر هذه التفاعلات المتنوعة ومجموعات الكائنات الحية. وبالمثل ، من الممكن أن تؤثر الزيادات في معدلات التنويع بطريقة ما على تطور تفاعلات الأنواع في بعض الحالات ، بدلاً من العكس (كما نفترض هنا). نحن نعلم عددًا قليلاً من الآليات المعقولة التي يمكن أن يحدث بها ذلك. على سبيل المثال ، من المرجح أن تتطور أي سمة (بما في ذلك تفاعل الأنواع) في كليد غني بالأنواع عن طريق الصدفة ، وكل شيء آخر متساوٍ. ومع ذلك ، لا ينبغي أن تسفر معظم طرق اختبار ارتباطات تنويع السمات عن نتيجة مهمة في ظل هذه الظروف (على سبيل المثال ، إذا كان التفاعل ينشأ بشكل عشوائي داخل كليد كبير وبالتالي يكون موجودًا فقط في بعض الأنواع التي لديها معدلات تنويع متسارعة). مرة أخرى ، تبدو هذه الأنواع من الإيجابيات الكاذبة ممكنة في حالات قليلة ، ولكن أقل من ذلك بكثير في العديد من الدراسات. علاوة على ذلك ، فإن نتيجتنا الرئيسية ليست ببساطة أن تفاعلات الأنواع تؤثر على معدلات التنويع ، بل بالأحرى أن تفاعلات الأثر الإيجابي تزيدها وتؤدي تفاعلات الأثر السلبي إلى تقليلها. هذا النمط الأكثر تعقيدًا يجعل ارتباطات الصدفة بين التفاعلات ومعدلات التنويع تبدو أقل احتمالًا لتفسير نتائجنا الإجمالية.

ثانيًا ، يعتمد أخذ العينات لدينا على الدراسات ذات الصلة المتوفرة في الأدبيات ، وليس أخذ عينات منهجية لجميع الكتل و / أو التفاعلات. هذا النوع الأخير من أخذ العينات ببساطة غير ممكن في هذا الوقت. ومع ذلك ، فإن الأدبيات تحتوي على العديد من الدراسات ذات الصلة عبر أنواع الأصناف والتفاعل (الجدول 1). نحن نقر بأن بعض الأنماط قد تتغير مع نشر المزيد من الدراسات. نقترح أن ملخصنا هنا لا يزال بإمكانه توجيه الدراسات التجريبية والنظرية المستقبلية.

ثالثًا ، قد تكون طرق تقدير معدلات التنويع وربطها بالسمات مثيرة للجدل (على سبيل المثال ، مورلون ، 2014). على سبيل المثال ، يمكن لنماذج انقراض الأنواع المعتمدة على الدولة (مثل BiSSE) أن تستنتج التنويع المعتمد على السمات عند عدم وجود تبعية (مثل Maddison and FitzJohn ، 2015). ومع ذلك ، إذا استنتجت طريقة ما بشكل روتيني التنويع المعتمد على السمات عندما كانت غائبة ، فإن هذا من شأنه أن يجعل من الصعب استنتاج أن تفاعلات الأثر الإيجابي تزيد من التنويع وأن التفاعلات ذات الأثر السلبي تقلل من التنويع. قد تقلل الطرق الأخرى من التباين في معدلات التنويع بين الأغطية (على سبيل المثال ، Rabosky ، 2014 Meyer and Wiens ، 2018) ، مما يزيد من صعوبة العثور على علاقات مهمة مع السمات. بشكل عام ، يبدو من غير المحتمل أن تكون نتائجنا نتاجًا لطرق تقدير معدلات التنويع ، لأن المشاكل في هذه الأساليب ستجعل من الصعب العثور على أنماط مهمة.

قد تكون النتائج غير المهمة ممثلة تمثيلا ناقصا في تحليلنا بسبب تحيز النشر. ومع ذلك ، يجب أن يكون اتجاه التأثيرات (أي التأثيرات الإيجابية مقابل التأثيرات السلبية على معدلات التنويع) غير حساس لهذا التحيز. علاوة على ذلك ، هناك القليل من الأدلة على أن أحجام التأثير بشكل عام أكبر في الدراسات المنشورة من الدراسات غير المنشورة (على سبيل المثال Koricheva، 2003 Møller وآخرون، 2005). تحيز آخر ("التحيز البحثي" كوريشيفا وآخرون، 2013) ، إذا ركز الباحثون على التفاوت في الثراء عبر سلالة. مرة أخرى ، لا ينبغي أن يؤثر هذا على اتجاه التأثيرات على التنويع. الأهم من ذلك ، أن دراستنا تختبر كيف تؤثر أنواع التفاعل المختلفة على التنويع ، وليس عدد المرات التي تؤثر فيها تفاعلات الأنواع على التنويع.

أخيرًا ، نقر بأن حجم عينة الدراسات لدينا محدود. ومع ذلك ، فإن رفض النتائج المهمة بسبب انخفاض أحجام العينات أمر غير منطقي من الناحية الإحصائية (نظرًا لأن أحجام العينات الأقل تقلل من الطاقة). علاوة على ذلك ، تتضمن بعض نقاط البيانات الفردية الخاصة بنا جميع الحيوانات وكذلك جميع النباتات البرية (تشمل معًا ما يقرب من 90٪ من جميع الأنواع الموصوفة على Earth Scholl and Wiens ، 2016). قمنا أيضًا بتضمين دراسات متعددة (& GT10) داخل كلتا المجموعتين. سوف تجد الدراسات المستقبلية بلا شك بعض الاستثناءات لهذه الأنماط العامة (كما فعلنا نحن) ، لكن نتائجنا تشير إلى احتمال وجود نمط عام واسع.


المواد والأساليب

خطوط الخلايا وزراعة الخلايا

تم الحصول على خلايا أبوية HCT116 (HCT116 ، P1) من ATCC. تم الحصول على خط الخلية الأبوي الثاني HCT116 (HCT116 ، P2) وجميع خطوط الخلايا المتجانسة HCT116 من Horizon Discovery Ltd.. تتألف خطوط الخلايا المتجانسة من الأنماط الجينية التالية: خطوط الخلايا الأبوية HCT116 (P1 و P2 ، HCT116 CTNNB1 wt + / mt + KRAS wt + / طن متري + وزن PI3KCA + / طن متري +) وزن CTNNB1 حيث الطفرة الورمية CTNNB1 تم حذف (β-catenin) مع ترك الأليل من النوع البري فقط (HCT116 CTNNB1 wt + / mt -) كراس بالوزن حيث الطفرة الورمية كراس تم حذفه مع ترك أليل النوع البري فقط (HCT116 KRAS wt + / mt -) PI3KCA بالوزن حيث الطفرة الورمية PI3KCA تم حذفه مع ترك أليل النوع البري فقط (HCT116 PI3KCA wt + / mt -) PTEN KO (HCT116 PTEN - / -) AKT1 KO (HCT116 AKT1 - / -) AKT1 KO و AKT2 KO (AKT1 / 2 KO، HCT116 AKT1 - / - AKT2 - / -) خريطة KO (MEK1 KO ، HCT116 MAP2K1 - / - ), خريطة KO (MEK2 KO ، HCT116 MAP2K2 - / - ), TP53 KO (ص 53 KO ، HCT116 TP53 - / - ) و باكس KO (HCT116 BAX - / -).

تمت مصادقة جميع خطوط الخلايا باستخدام التنميط SNP (Multiplexion). تم نشر خلايا HCT116 في وسط مكوي 5a المعدل (تقنيات الحياة) مع 10٪ FBS (Biochrom) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO.2. تم إجراء الزراعة الفرعية كل 4 أيام بنسبة 1:10 - 1:20. تم الحصول على خلايا DLD-1 من ATCC وانتشرت في وسط النسر المعدل (DMEM) الخاص بـ Dulbecco (تقنيات الحياة) مع 10 ٪ FBS (Biochrom) و 1 ٪ P / S عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون.2. تم إجراء الزراعة الفرعية كل 4 أيام بنسبة 1:10 - 1:20.

العلاج المركب

قبل الفحص ، قمنا بإعداد التخفيفات التسلسلية لمكتبة LOPAC المركبة (Sigma) في وسط RPMI (تقنيات الحياة) لتوفير تركيز مخزون نهائي قدره 50 ميكرومتر. تم تضمين تاكسول / باكليتاكسيل ، فينبلاستين ، و U0126 ، وكذلك DMSO (كلها من سيجما) كعناصر تحكم إضافية في الارتفاع موجودة على جميع اللوحات. يتم توفير قائمة بجميع المركبات المدرجة في هذه المكتبة مع حزمة R / Bioconductor PGPC و Table EV1. لقد زرعنا 1250 خلية في وسط 45 ميكرولتر ماكوي في كل بئر من 384 صفيحة مجهرية ذات قاع واضح جيدًا (BD Biosciences) وحضنت لمدة يوم واحد عند 37 درجة مئوية. تمت إضافة 5 ميكرولتر من المحلول المركب باستخدام روبوت Beckman Biomek FX برأس طرف بئر 384 للحصول على تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر و 0.1٪ DMSO. تم زراعة الخلايا لمدة يومين عند 37 درجة مئوية قبل التحليل. للفحص ، تم استخدام تركيز دواء واحد قدره 5 ميكرومتر.

تلطيخ الخلايا والتصوير

تم إجراء تلطيخ الخلية باستخدام روبوت Biomek FX برأس رأس بئر 384. تم إصلاح الخلايا ونفاذها باستخدام 5 ٪ بارافورمالدهيد (سيغما) و 0.2 ٪ تريتون X-100 (سيجما) من أجل

60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم تلوين النوى والأكتين بـ 2 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 (Invitrogen) و 75 نانوغرام / مل phalloidin المسمى بـ tetramethylrhodamine isothiocyanate (Sigma) لـ

60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم غسل الخلايا أربع مرات باستخدام PBS (Invitrogen) ، وأضيف 0.05٪ أزيد الصوديوم (Sigma) للتخزين. تم إغلاق الألواح بأختام الألومنيوم (Corning) وتخزينها حتى يتم تصويرها عند 4 درجات مئوية مع الحماية من الضوء. تم الحصول على صور مضان باستخدام InCell Analyzer 2000 (GE Healthcare) بتكبير 10 ×. تمت تغطية كل بئر بالكامل بأربع صور في كل من القناتين اللونيتين ، مما أدى إلى

معالجة الصور واستخراج الميزات

تم الحصول على الصور كصور TIFF 16 بت بحجم 2048 بكسل × 2048 بكسل. قمنا بتكييف طرق تصحيح الشدة وتجزئة الصورة واستخراج الميزات من الدراسات السابقة ، بناءً على حزمة R EBImage (Pau وآخرون، 2010). لإزالة التحيزات بسبب شدة الإضاءة المنخفضة عند حدود الصورة ، تم اقتصاص 150 بكسل على كل جانب. تم تجزئة النوى بواسطة العتبة التكيفية لصور قناة Hoechst بحجم نافذة 10 × 10 بكسل. تم استخدام عدد النوى المجزأة كبديل لعدد الخلايا. باستخدام النوى المجزأة كبذور ، تم إنشاء قناع تجزئة الخلية عن طريق توسيع تجزئة النوى إلى قناع عتبة قناة الأكتين باستخدام خوارزمية انتشار تعتمد على Voronoi. تم توثيق إعدادات المعلمات والطريقة في نقوش PGPC. باختصار ، تم استخدام النوى المكتشفة كبذور وتم توسيعها إلى أقنعة من السيتوبلازم لكل خلية. تم استخراج السمات المورفولوجية والنسيجية من الصور باستخدام أقنعة التجزئة. في المجموع ، قمنا باستخراج 385 سمة نمطية كمية لكل بئر (الجدول EV3). تم تحويل البيانات باستخدام تحويل لوغاريتمي معمم (Huber وآخرون, 2002 ).

اختيار الميزات غير الزائدة عن الحاجة

لتحديد ميزات إعلامية غير زائدة عن الحاجة ، تم استخدام خوارزمية لخفض الأبعاد والاختيار التدريجي (Laufer وآخرون، 2013). بدءًا من رقم الخلية كميزة أولية ، يناسب هذا النهج التكراري كل ميزة بواسطة نموذج خطي باستخدام الميزات المحددة كمتنبئات. تم استخدام الارتباطات بين بقايا النموذج لكل تكرار كبديل للمعلومات الجديدة التي تحتويها الميزة. يتم تحديد الميزة ذات الارتباط الأعلى لبقايا النموذج بعد ذلك. تستمر هذه العملية حتى تصبح النسبة المئوية للارتباطات المتبقية للنموذج الإيجابي على جميع الميزات أصغر من 50٪.

تم تجميع المجموعة النهائية المكونة من 20 سمة مظهرية في خمس فئات. تتضمن فئة "نسيج / شدة الحمض النووي" ميزات مرتبطة بالكثافة والملمس محسوبة من صورة تلطيخ Hoechst ، مثل ميزات نسيج Haralick. تشتمل مجموعة "الشكل النووي" على ميزات متعلقة بالحجم والشكل محسوبة من قناة Hoechst ، بما في ذلك الانحراف المركزي ونصف القطر النووي. تشتمل مجموعة "شكل الخلية" على ميزات متعلقة بالحجم والشكل وتشتمل مجموعة "نسيج / شدة الأكتين" على ميزات متعلقة بالكثافة والملمس المستخرجة من قناة الأكتين. تم تصور السمات المظهرية العشرين بواسطة المخططات الرادارية ، والتي أطلقنا عليها اسم الفينوبرينتس. هنا ، المسافة الشعاعية متناسبة مع المتغير الموضح. باستخدام رقم الخلية كمثال ، فإن المسافة الأعلى من الأصل تتوافق مع رقم الخلية الأعلى.

القياس الكمي للتفاعلات الكيميائية الجينية

تم نمذجة بيانات كل ميزة باستخدام نموذج مضاعف كما هو موضح سابقًا (Laufer وآخرون، 2013) وانحدار L1 القوي لتقدير تأثيرات خط الخلية والمعالجة المركبة باستخدام وظيفة medpolish لحزمة الإحصائيات R (http://www.r-project.org).في هذا النهج التكراري ، يتم طرح متوسطات الصف والعمود بالتناوب حتى التغيير في S ، ومجموع البقايا المطلقة ، مقسومًا على S ، يقع تحت العتبة المحددة 0.0001. تصف قيم الصفوف والعمود النهائيين تأثير المركب وخط الخلية ، على التوالي. تمثل القيم المتبقية ، إما ذات قيمة موجبة أو سالبة ، معاملات التفاعل. تم تنفيذ هذه العملية لكل تكرار ولكل ميزة على حدة. لحساب معدلات الانتشار المختلفة لخطوط الخلايا المتجانسة ، تم تطبيع قيم رقم الخلية على المقياس اللوغاريتمي المعمم باستخدام النطاق المحدد بواسطة متوسط ​​قيم التحكم السالبة (1) وقيم التاكسول المركب (0) لكل خلية خط. القيم التي تقل عن 0 وما فوق 1 ممكنة. للكشف عن التفاعلات الهامة ، تم استخدام قيم التكرارات لأداء خاضعة للإشراف ر- اختبار مقابل الفرضية الصفرية μ = 0 باستخدام تنفيذ الدالتين lmFit و eBayes لحزمة limma R (Smyth ، 2004) على مصفوفة التفاعل لكل ميزة. ص- تم تعديل القيم للاختبارات المتعددة عن طريق التحكم في معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) باستخدام طريقة Benjamini and Hochberg (1995) كما هو موضح سابقًا لتقدير التفاعلات الجينية الجينية (Laufer وآخرون، 2013). تم اختيار تفاعلات كبيرة باستخدام حد 0.01 (FDR) على المعدل ص-القيم.

للتنبؤ بوضع العمل المركب ، أجرينا التجميع الهرمي بقاعدة الربط الكاملة (الشكل 5 أ). كمقياس للاختلاف ، استخدمنا 1 - cor (x ، y) ، حيث x و y هما ملامح التفاعل لمركبين و cor هو معامل ارتباط بيرسون.

خريطة التفاعل الكيميائي الوراثي المظهرية

استخدمنا Cytoscape الإصدار 2.8. (شانون وآخرون، 2003) لرسم خريطة التفاعل الكيميائي الجيني المظهرية لمجموعة بيانات تمت تصفيتها. باختصار ، أزلنا عناصر التحكم وفكرنا فقط في تلك المركبات التي لها تفاعلات بحد أقصى ثلاثة من أصل اثني عشر خلفية جينية تم اختبارها. كما نظرنا فقط في المركبات التي أثرت على أكثر من سمة نمطية واحدة. نتيجة لخطوات التصفية هذه ، تم اختبار خمسة من الخلفيات الجينية الاثني عشر (كلاهما من خطوط HCT116 الأبوية ، باكس, AKT1، و MEK2 خلايا KO) غير مدرجة في الخريطة. يتم تضمين ملف بيانات لإنتاج خريطة Cytoscape في حزمة R / Bioconductor PGPC.

مؤشر القرار (∆AUC)

لتقدير اكتساب المعلومات باستخدام نهج الجينوم الكيميائي المظهر عالي المحتوى على نهج النمط الظاهري عالي المحتوى (خط خلية واحدة) أو الدوائية (رقم الخلية فقط في جميع خطوط الخلية) ، قمنا بحساب مؤشر الدقة ∆AUC على النحو التالي. أولاً ، تم حساب ارتباط ملفات التعريف المركبة باستخدام جميع الميزات وجميع خطوط الخلايا (الأنماط الجينية والأنماط الظاهرية متعددة العوامل) ، وجميع السمات المظهرية المحددة العشرين لخط الخلية الأبوي HCT116 P1 (الأنماط الظاهرية متعددة العوامل) ، وفقط ميزة رقم الخلية لجميع خطوط الخلايا (الأنماط الجينية). ثانيًا ، تم استخدام انتقائية الهدف المشروحة (الجدول EV1) لتصنيف الأزواج المركبة إلى فئة "الانتقائية المشتركة" أو فئة "لا انتقائية مشتركة" اعتمادًا على ما إذا كانت المركبات تشترك في نفس الهدف بناءً على التعليق التوضيحي. تم استخدام التشابه الكيميائي لتصنيف أزواج المركبات إلى فئة "بنية متشابهة" أو فئة "بنية مختلفة". لهذا ، استخدمنا مصفوفة المسافة المحسوبة من ملفات sdf المركبة باستخدام حزمة ChemmineR (Cao وآخرون، 2008). تم تصنيف المركبات على أنها "بنية متشابهة" إذا كانت مسافتها الهيكلية كما حددتها مسافة Tanimoto المحسوبة بواسطة ChemmineR أقل من 0.6. لكلا النهجين ، تم حساب دالة التوزيع التراكمي التجريبية (ECDF) لارتباطات المظهر الجانبي المركب بين الأزواج المركبة بشكل منفصل لكل من الفئتين. يُعرَّف مؤشر الاستبانة على أنه الفرق بين المنطقة الواقعة تحت المنحنى (∆AUC) بين الفئتين لكل نهج.

تحليل بيانات توليفة الدواء

قمنا بقياس التأثير على قابلية الخلية للتركيبات المركبة الزوجية باستخدام حركيات تركيز نسبة الجرعة الثابتة واستخدمنا اختبار CellTiterGlo (Promega) لتحديد تكاثر الخلايا وقابليتها للحياة بشكل مستقل عن رقم الخلية. تم تجميع المركبات بتركيز 20 ملي مولار بطريقة زوجية وتم تخفيفها في سلسلة 1: 2 لتغطية 10 تركيزات. تم الحصول على MK2206 من التكنولوجيا الحيوية سانتا كروز. تم الحصول على AKTi VIII من VWR International. تم الحصول على Bendamustine و disulfiram و U0126 و PD 98،059 من Sigma. تم رصد المركبات في 384 لوحًا جيدًا (Greiner) ثم تم تخفيفها في RPMI باستخدام روبوت Biomek FX. باختصار ، تم زرع خلايا HCT116 و DLD-1 بتركيز 1000 خلية في وسط 45 ميكرولتر ماكوي في كل بئر من صفيحة 384 بئر (Greiner) وحضنت لمدة يوم واحد عند 37 درجة مئوية. ثم تمت إضافة 5 ميكرولتر من المركبات إلى الخلايا كما هو موصوف من قبل لتغطية نطاق تركيز من 10 - 0.0195 ميكرومتر. بعد إعطاء المركب ، تم تحضين الخلايا لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية وتم قياس صلاحية الخلية عبر مقايسة CellTiterGlo (Promega) باستخدام قارئ لوحة Mithras LB940 (Berthold Technologies). تم تحليل البيانات باستخدام cellHTS2 (Pelz وآخرون, 2010 ).

كتأثيرات مركبة E ، استخدمنا 1 - NPI ، وهي نسبة تثبيط طبيعية تم الحصول عليها من بيانات فحص CellTiterGlo عن طريق طرح قيمة كل قياس من متوسط ​​الشدة على الضوابط الموجبة للوحة وقسمة النتيجة على الفرق بين يعني القياسات على الضوابط الموجبة والسالبة على اللوحة. تم تحويل قيم قارئ اللوحة الخام إلى لوغاريتم قبل هذه الحسابات.

قمنا بقياس عدم توقع تأثير الزوج المركب بواسطة نموذج غير متفاعل (استقلال بليس ، BI) كما تم استخدامه سابقًا لشاشات التآزر المركب واسعة النطاق (تان). وآخرون، 2012). في نموذج BI ، يتم إعطاء التأثير المشترك للمزيج المركب A و B بواسطة EAB = هـأ + إيب - إيج: بحيث Eأ و هـب هي التأثيرات المركبة المفردة بنفس الجرعة كما في المجموعة و E.ج: ب هو مصطلح التفاعل ، وهو صفر للمركبات غير المتفاعلة. لكل تركيز ، استخدمنا 10 قياسات على الأقل لـ E.AB و 20 قياسات لكل من E.أ و هـب. قدرنا تأثير التفاعل E.ج: ب بإدخال وسائل القياسات وحل المعادلة لـ E.ج: ب. لاختباره مقابل الفرضية الصفرية Eج: ب = 0 ، قمنا بتوظيف الطالب ر-اختبار.

مقايسة نشاط البروتياز القائم على الخلية

تم رصد المركبات المراد اختبارها في 384 لوحًا جيدًا (Greiner) بتركيز 50 ميكرومتر. تم الحصول على ZPCK و disulfiram و CAPE و tyrphostin AG555 و AG1478 و DAPH من Sigma. تم الحصول على Bortezomib من NEB وتم الحصول على MG132 من Merck Bioscience. تم زرع خلايا HCT116 بتركيز 3000 خلية في وسط 45 ميكرولتر ماكوي في كل بئر من 384 صفيحة جيدة (Greiner) وحضنت لمدة يوم واحد عند 37 درجة مئوية. بعد إعطاء المركب بتركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر و 0.1 ٪ DMSO ، تم تحضين الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية وتم قياس أنشطة البروتياز الشبيهة بالكيموتريبسين والتريبسين والشبيهة بالكاسبيز باستخدام خلية Proteasome-Glo ™ - طقم الفحص المستند إلى تعليمات الشركة المصنعة (Promega) باستخدام قارئ لوحة Mithras LB940 (Berthold Technologies). لحساب التأثيرات المركبة على تكاثر الخلايا ، تم قياس صلاحية الخلية عبر مقايسة CellTiterGlo (Promega). يتم تطبيع البيانات إلى آبار فحص CTG للتحكم في الجدوى على كل لوحة (تم ضبط CTG على 1 على كل لوحة). بناءً على القيم المصححة لصلاحية الخلية ، قمنا بحساب نشاط البروتياز مقارنة بعناصر تحكم DMSO للآبار المقابلة في كل لوحة. تم ضبط نشاط البروتياز لـ DMSO على 1 لكل مقايسة. تم حساب التثبيط بالنسبة لهذه القيمة. ثم يتم تحديد تثبيط البروتيازوم من خلال 100 * (1 - (PT / PC) / (VT / VC)) ، حيث يكون PT هو النشاط البروتيازومي الخاص بكل علاج دوائي ، والكمبيوتر الشخصي هو نشاط البروتياز الخاص لعلاج التحكم (DMSO) ، VT هي صلاحية الخلية لكل علاج دوائي ، والسيرة الذاتية هي قابلية الخلية للبقاء من أجل علاج التحكم (DMSO). وبالتالي ، فإن التحكم في DMSO يحدد 0 ٪ تثبيط بروتيازوم طبيعي. أجرينا أ ر- اختبار مقارنة القيم للمركبات مقابل الفرضية الصفرية للتأثير الصفري.

النشاف الغربي

تم بذر خلايا HCT116 بتركيز مليون خلية في 2 مل وسط مكوي في كل بئر من صفيحة 6 آبار. في اليوم التالي ، تمت إضافة المركبات في وسط جديد سعة 2 مل بتركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر و 0.1 ٪ DMSO وحضنت الخلايا لمدة 24 ساعة. تم الحصول على ZPCK و disulfiram و CAPE و tyrphostin AG555 و AG1478 و DAPH من Sigma. تم الحصول على Bortezomib من NEB وتم الحصول على MG132 من Merck Bioscience. تم حصاد الخلايا في محلول تحلل وتحضيرها للنشاف الغربي كما هو موصوف سابقًا (Kranz & Boutros ، 2014). تم قياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA (بيرس ، Thermo Scientific). تم استكمال عشرين عينة ميكروغرام بمخزن مؤقت 5 × Laemmli وتم تسخينها لمدة 5 دقائق عند 96 درجة مئوية. تم فصل محلولات الخلايا على 4-12٪ من المواد الهلامية NuPAGE Bis / TRIS (تقنيات الحياة) ونقلها إلى أغشية Immobilon PVDF (Millipore ، Merck Biosciences). كانت الأجسام المضادة المستخدمة هي مضادات اليوبيكويتين (استنساخ P4D1 ، إشارة الخلية 1: 1000) ، مضادات بيتا أكتين (Abcam 1: 20000) ، ومضاد الفأر IgG2b المترافق مع HRP (التكنولوجيا الحيوية الجنوبية 1: 10000).

توافر البيانات

تتوفر وجهات النظر التكميلية حول البيانات من خلال الطرق التالية. تتوفر ملفات بيانات الصورة من قاعدة بيانات BioStudies في المعهد الأوروبي للمعلومات الحيوية (EMBL-EBI) تحت الانضمام S-BSMS-PGPC1 (http://wwwdev.ebi.ac.uk/biostudies/studies/S-BSMS-PGPC1 ). يتم توفير واجهة أمامية تفاعلية لاستكشاف الصور بواسطة قاعدة بيانات IDR (http://dx.doi.org/10.17867/10000101). على www.bioconductor.org ، توفر الحزمة PGPC مستندًا قابلاً للتنفيذ مع الكود الذي تم استخدامه للتحليل الوارد في الورقة ، بالإضافة إلى أنواع البيانات الوسيطة ، مثل الميزات الرقمية (https://bioconductor.org/packages /devel/data/experiment/html/PGPC.html ، راجع كود EV1). يستضيف المؤلفون صفحة ويب تفاعلية لتصفح الصور وملفات تعريف التفاعل على http://dedomena.embl.de/PGPC.


نود أن نشكر جميع أعضاء فريق Translational Cancer Genomics الذين قدموا نظرة ثاقبة مفيدة ، بما في ذلك Matthew Coelho لتوفير قراءة متأنية للمخطوطة. نحن ممتنون للمساهمات الدؤوبة من جون وينتر هولت فيما يتعلق بتعريف المركب وتصفية البيانات ، و Pedro Beltrao لإجراء مناقشات مفيدة و Danilo Horta لدعمه في دمج حزمة Limix. تم تمويل العمل في مختبر M.J.G من قبل Wellcome (206194) و AstraZeneca.

المفاهيم: EG و MJG التحليل الرسمي: EG تنظيم البيانات: EG ، CP ، DvdM ، ABa ، HL ، JTL ، BS ، CC ، FI ، SF و MJG اكتساب ومعالجة الاستجابة للأدوية: DvdM ، TM ، ABa ، LR ، WY ، EL و JH و CT و CH و IM و FT و JM و ABe و HL شرح توضيحي للأدوية: EG و AS-C و GP و FMB و PJ و EAC و ARL و CC و MJG إعداد المسودة الأصلية للكتابة: EG و MJG الكتابة والمراجعة و التحرير: جميع المؤلفين التصور: EG الإشراف: ABa و AL و JTL و BS و CC و FI و SF و MJG اكتساب التمويل: SF و MJG.


حركية الدواء 1

يمكن أن تكون DDIs بارزة للأدوية التي يتم استقلابها بآليات مفردة. على سبيل المثال ، يتم استقلاب الكافيين بالكامل تقريبًا (97٪) بواسطة إنزيم السيتوكروم P450 CYP1A2 إلى الحد الذي يتم استخدامه كمسبار فيزيولوجي لوظيفة CYP1A2. يمكن أن تحتكر التركيزات العالية من الكافيين في مجرى الدم هذا الإنزيم مما يؤدي إلى تفاعلات مع الأدوية الأخرى التي تتطلب إزالته. يمكن أن يؤدي هذا التفاعل المشترك عند إنزيم CYP1A2 مع أدوية أخرى إلى تفاعلات دوائية - دوائية سامة مع عدد من الأدوية بما في ذلك بعض مثبطات امتصاص السيروتونين الانتقائية مثل فلوفوكسامين المستخدم في علاج اضطراب الوسواس القهري والاكتئاب الشديد ومضادات اضطراب النظم مثل ميكسيليتين ، ومضادات الذهان كلوزابين ، وموسعات الشعب الهوائية فيورافيلين والثيوفيلين والمضاد الحيوي كينولون إينوكساسين [13].


أساليب

زراعة الخلايا ومسببات الأمراض والسموم

تم الحصول على خلايا TZM-bl من برنامج الكاشف المرجعي لبحوث الإيدز والمعاهد الوطنية للصحة (Germantown ، MD). تم الحصول على خلايا HepG2 و Hep3B و L و MDCK و Sup-T1 و Vero E6 من مجموعة الثقافة الأمريكية (ATCC Manassas ، VA). تم الحصول على فيروس جدري البقر (سلالة برايتون) ، فيروس الأنف البشري 2 (سلالة HGP) ، فيروس الأنف البشري من النوع 16 (سلالة 11757) ، وشلل الأطفال (سلالة الدردشة) من ATCC. الهربس البسيط نوع الفيروس 1 (KA Strain) تم توفيره من قبل الدكتور David Knipe (جامعة هارفارد). الهربس البسيط نوع الفيروس 2 (186 سلالة) كان هدية من الدكتورة باتريشيا سبير (جامعة نورث وسترن). تم الحصول على فيروس Reovirus 1 (سلالة Lang) من Bernard N. Fields. تمت دراسة فيروس الإيبولا (أنواع زائير ، سلالة Mayinga 1976) وفيروس ماربورغ (سلالة فويج 1967) في منشأة احتواء BSL4 في مراكز السيطرة على الأمراض في أتلانتا ، جورجيا. تم الحصول على ناقل مكوك الفيروسات القهقرية U3neoSV1 [73] من H. Earl Ruley (جامعة فاندربيلت) واستخدم كمطفر إدخال لإعداد مكتبات مصيدة الجينات مع الخلايا الأبوية الحساسة للفيروسات ، كما هو موصوف [18،74-76].

إنتاج خطوط خلوية مكتبة استنساخية لمصيدة الجينات المقاومة للعدوى الفيروسية اللايتية أو التعرض للسموم

الطرق التي تصف تحضير خطوط الخلايا الخلوية لمكتبة الجينات المستنسخة التي تقاوم العدوى اللايتية باستخدام خلايا RIE-1 (فيروس reovirus) و Sup-T1 (HIV-1) وخلايا TZM-bl (فيروس الأنف البشري 2 و 16) وخلايا Vero E6 ( جدري البقر والإيبولا الهربس البسيط تم وصف الفيروس 1 و 2 ، ماربورغ ، وشلل الأطفال سابقًا [18،75-79]. باختصار ، تم توسيع مكتبات مصيدة الجينات ، كل منها يحتوي على ما يقرب من 10 4 أحداث انحباس جيني ، إلى 80-90٪ ملتقى حتى

10 3 خلايا ابنة تمثل كل استنساخ. أصيبت سلالات الخلايا المشار إليها بمستوى منخفض من وزارة الداخلية (المدى = 0.0002-0.01) ، واستمرت العدوى حتى لوحظت تأثيرات اعتلال خلوي بنسبة 90٪ (3-7 أيام). تم تغيير الوسيط كل 2-3 أيام حتى ظهرت الحيوانات المستنسخة الباقية ، والتي لوحظت بشكل عام بعد 2-3 أسابيع في الثقافة. تم توسيع الحيوانات المستنسخة الباقية في آبار مكررة من 24 لوحة منفصلة ، وتم تأكيد المقاومة في الحيوانات المستنسخة من خلال إعادة إصابة 1 من الآبار المكررة عند وزارة الداخلية أعلى بمقدار 10 أضعاف مما تعرضت له مجموعات الخلايا الأصلية. تم اختيار الحيوانات المستنسخة المقاومة التي تظهر بقاء 70 ٪ على قيد الحياة بعد إعادة العدوى للتوسع لتحديد الجينات المحاصرة ، باستخدام الخلايا التي تنمو في الآبار غير المصابة في 24 لوحة جيدة.

تم تحضير خلايا مكتبة الجينات المصيدة التي تقاوم التعرض للسموم الحالة للخلايا على النحو التالي. المطثية العسيرةتم إجراء تجارب سموم TcdB عن طريق الطلاء الأول لخلايا Caco-2 في قوارير مقاس 75 سم 2 واحتضانها بـ U3neoSV1 (تعدد العدوى ، MOI = 0.1) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في وجود 4 ميكروغرام / مل بوليبرين (سيغما) ، وهو بوليمر كاتيوني يستخدم لزيادة كفاءة العدوى [80]. بعد ذلك ، تم طلاء خلايا Caco-2 المحتجزة بالجينات في أطباق بحجم 10 سم وتم تحديها بسموم TcdB الأصلي 15 نانومتر لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية ، وبعد ذلك تم تبادل الوسيط وترك الخلايا لتتعافى لمدة 96 ساعة [22]. ]. المطثية الحاطمة ε سم و المكورات العنقودية الذهبية تم إجراء تجارب سموم ألفا بعد تصفيح خلايا MDCK المنقولة بواسطة ناقل مصيدة الجينات في تسعة أطباق 100 مم (حوالي 3.3 × 10 6 خلايا لكل طبق) ، في وسط Leibovitz L-15. المطثية الحاطمة تمت إضافة سم إلى تركيز نهائي قدره 20 نانومتر ، وحضنت الخلايا المعالجة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة [74]. أصيبت خلايا AZ-521 لمدة ساعة واحدة هيليكوباكتر بيلوري تفريغ السم عند وزارة الداخلية 0.1 في وجود 4 ميكروغرام / مل من البوليبرين. أصيبت خلايا THP-1 ب فرانسيسيلا تولارنسيس في ثلاث قيم مختلفة لوزارة الداخلية. تم الحصول على سم هولوتوكسين الأصلي من الريسين تجاريًا أو تنقيته من مستخلصات النماء الخروع COMMUNIS البذور حسب الإجراءات القياسية باستخدام عمود من Sepharose 6LB المعالج بحمض البروبيونيك ، متبوعًا بشطف محدد من الليكتين السام للخلايا مع 50 ملي N-acetylgalactosamine. تم تحضير متغيرات سلسلة ricin A المؤتلف (على سبيل المثال ، حمل مواقع كبريتات C- الطرفية وتسلسلات الارتباط بالجليكوزيل) عن طريق التعبير عن ricin A chain cDNA في الإشريكية القولونية. بعد احتضان كل نوع من الخلايا بالسم أو البكتيريا المحددة ، تم توسيع الحيوانات المستنسخة المقاومة في آبار منفصلة من الصفائح متعددة الآبار. تم وصف البروتوكولات التفصيلية مسبقًا [18،75-79].

إنقاذ متجه المكوك U3neoSV1 وتسلسله من الحيوانات المستنسخة المقاومة

تم استخراج الحمض النووي الجيني من خطوط الخلايا النسيليّة المقاومة للفيروسات باستخدام QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen ، Inc. ، فالنسيا ، كاليفورنيا). تم استرداد ناقلات المكوك وشظايا الحمض النووي الجينومي التي تحيط بموقع التكامل U3neoSV1 عن طريق هضم الحمض النووي الجيني إما باستخدام BamH1 أو EcoRI ، والربط الذاتي لشظايا الحمض النووي الجينومي الناتجة ، وتحويلها الإشريكية القولونية، واختيار البكتيريا التي تؤوي البلازميدات المقاومة للكاربينيسيلين ، كما هو موصوف [75]. تم تسلسل تسلسل الحمض النووي الذي يحيط بمواقع التكامل U3neoSV1 باستخدام الاشعال الصلب إلى ناقل المكوك U3neoSV1.

تحليل التسلسل

تم تحليل التسلسلات الجينومية التي تم الحصول عليها من الحيوانات المستنسخة من المكوك بواسطة RepeatMasker (//www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker) ، متبوعًا ببحث بلاست النوكليوتيدات النوكليوتيدية مقابل قاعدة بيانات المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov). تقريبًا جميع الجينات التي حددناها متطابقة مع الفئران والمتواليات البشرية مع درجات الاحتمالية (ص) من & lt10 10 و & lt10 20 على التوالي. تم تقديم وصف تفصيلي لهذه العملية مسبقًا [18،22،74،80].

بناء تفاعل بروتيني بشري عالي الجودة

قمنا بتنزيل بيانات تفاعل البروتين البروتين من مختلف المنشورات وقواعد بيانات المعلوماتية الحيوية. نظرًا لأن قواعد بيانات تفاعل البروتين البشري الحالية المتاحة للجمهور لا تزال غير مكتملة ، فقد أنشأنا 5 أرقام PIN بشرية مختلفة ولكنها متكاملة: (1) رقم تعريف شخصي مادي واسع النطاق ، (2) رقم تعريف شخصي هيكلي ثلاثي الأبعاد ، (3) تفاعل كيناز الركيزة شبكة (KSIN) ، (4) رقم تعريف شخصي شامل للمناعة الفطرية ، و (5) رقم تعريف شخصي متنبأ به حسابيًا واسع النطاق ، استنادًا إلى دراساتنا السابقة [25 ، 26]. قمنا بتنفيذ خطوتين لتنظيف البيانات. أولاً ، حددنا التفاعلات عالية الجودة كتلك التي تم التحقق من صحتها تجريبياً في النماذج البشرية من خلال بروتوكول تجريبي محدد جيدًا. تم تجاهل التفاعلات التي لم تستوف هذا المعيار. ثانيًا ، قمنا بتوضيح جميع جينات ترميز البروتين باستخدام معرف Entrez للجين وموقع الكروموسوم ورموز الجينات الرسمية من قاعدة بيانات NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ، كما هو موضح بالتفصيل سابقًا [25 ، 26].

بناء التفاعل الجيني الدوائي

تم الحصول على تفاعلات الجينات الدوائية (DGI) من قاعدة بيانات DrugBank (الإصدار 3.0) [81] ، وقاعدة بيانات الهدف العلاجي (TTD ، الإصدار 4.3.02) [55] ، وقاعدة بيانات PharmGKB (30 ديسمبر 2014) [56] . تم تجميع الأدوية باستخدام أكواد نظام تصنيف ATC وتم شرحها باستخدام عناوين الموضوعات الطبية (MeSH) ومفردات نظام اللغة الطبية الموحدة (UMLS) (1 نوفمبر 2014) [82]. تم تعيين جميع الجينات والتعليق عليها باستخدام معرف الجين Entrez ID ورموز الجينات الرسمية الموجودة في قاعدة بيانات NCBI. تمت إزالة جميع أزواج DGI المكررة. في المجموع ، حصلنا على 17،490 زوجًا من DGI التي تربط 4،059 دواءً معتمدًا أو قيد الاختبار من قِبل إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) و 2746 منتجًا جينيًا.

فئات مجموعات الجينات المرضية المختلفة

الجينات المسببة للسرطان.

تم اختيار مجموعة من 384 جينًا تم تحورها بشكل كبير في السرطان من العديد من مشاريع التحليل الجينومي للسرطان واسعة النطاق [83-86].

جينات السرطان الأخرى.

تم اختيار جينات السرطان الإضافية لتحليل المعلومات الحيوية من المصادر التالية. أولاً ، تم تنزيل 560 جينة سرطانية تم التحقق من صحتها تجريبياً في 18 ديسمبر 2015 من التعداد الجيني للسرطان [87] وتم الإشارة إليها على أنها جينات CGC. قمنا أيضًا بجمع 4050 جينة سرطانية تم تجميعها في دراسة سابقة [25] ، يشار إليها هنا بالفهرس الشامل لجينات السرطان ، مجموعة CCG. توفر هذه الموارد معًا جينات السرطان المرشحة المتداخلة والمتكاملة.

جينات مرض مندل (MDGs).

تم تنزيل مجموعة من 2714 هدفًا من الأهداف الإنمائية للألفية من قاعدة بيانات Mendelian Inheritance in Man (OMIM) [88] في ديسمبر 2012. احتوت قاعدة بيانات OMIM على 4132 زوجًا من رابطة الأمراض الجينية تربط 2716 جينًا مرضيًا في 3294 من الأمراض أو الاضطرابات المندلية (ديسمبر 2012).

الجينات الطافرة المسببة للأمراض اليتيمة (ODMGs).

جمعنا 2123 ODMG من دراسة سابقة [89]. يُعرِّف قانون الأمراض النادرة في الولايات المتحدة لعام 2002 المرض بأنه مرض يتيم يصيب أقل من 200000 فرد في الولايات المتحدة ، أي ما يعادل 6.5 شخصًا لكل 10000 [90].

الجينات الأساسية.

تم تجميع الجينات الأساسية (2719) من قاعدة بيانات OGEE [24].

جينات دورة الخلية.

تم جمع جينات دورة الخلية البشرية المضيفة (986 جينًا) التي تنظم تحولات طور G0 / 1 و S و G2 من دراسة سابقة تم تحديدها بواسطة فحص RNAi على مستوى الجينوم [35].

الجينات المناعية الفطرية.

تم جمع جينات المناعة الفطرية للإنسان (971) التي تلعب دورًا حاسمًا في الاستجابة المناعية الفطرية من InnateDB [27].

حساب الضغط الانتقائي ومعدلات التطور

حسبنا dN / dS النسب [91] لفحص الضغوط الانتقائية على الجينات. في البداية ، تم استخدام الجينات المتعامدة للفأر البشري للحساب dN و دي اس معدلات الاستبدال باستخدام بيانات تسلسل الفأر البشري لـ 16854 جينًا متوفرة في قاعدة بيانات Ensemble BioMart (http://useast.ensembl.org/biomart/martview/). بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد نسب معدل التطور ، كما هو موضح في دراسة سابقة [92]. تم توفير تفاصيل البيانات والتحليلات في منشورنا السابق [25].

استنتاج الأصول التطورية للبروتين

يشير الأصل التطوري للبروتين إلى التاريخ التقريبي الذي نشأ فيه البروتين ويمكن الاستدلال عليه من تحليل النشوء والتطور. استخدمنا بيانات أصل البروتين من ProteinHistorian [93]. بشكل خاص ، تم تقدير أصل (عمر) البروتين من خلال مراعاة 3 عوامل: شجرة الأنواع ، وقاعدة بيانات عائلة البروتين ، وخوارزمية إعادة بناء عائلة الأجداد. علاوة على ذلك ، تم حساب المسافات التطورية من خلال مقارنة التسلسلات البشرية مع متواليات تقويم العظام من الحيوانات الأخرى ، كما هو موصوف [92].

التحديد الحسابي للمؤشرات الجديدة المضادة للفيروسات للأدوية الموجودة

قمنا بجمع تواقيع الجينات الدوائية من خريطة التوصيل (CMap ، البناء 02) [20]. يتكون CMap من أكثر من 7000 ملف تعريف للتعبير الجيني من خطوط الخلايا البشرية المستزرعة والتي تم معالجتها بجزيئات صغيرة نشطة بيولوجيًا (إجمالي 1،309) بتركيزات مختلفة ، تغطي 6100 حالة فردية. وبالتالي يوفر CMap مقياسًا لمدى التعبير التفاضلي لمجموعة مسبار معينة. السعة (أ) تم تعريفه على النحو التالي: حيث t هي قيمة الفرق المتوسطة والعتبة لمجموعة العلاج بالعقاقير و c هي قيمة متوسط ​​الفرق العتبة للمجموعة الضابطة. وبالتالي ، يشير a = 0 إلى عدم وجود تعبير تفاضلي ، ويشير a & gt 0 إلى زيادة التعبير (التنظيم الأعلى) عند العلاج ، ويشير a & lt 0 إلى انخفاض التعبير (التنظيم السفلي) عند العلاج. على سبيل المثال ، تمثل السعة 0.67 استقراءًا مزدوجًا. تم تعريف توقيعات جينات الدواء ذات السعات & gt 0.67 على أنها أزواج جينات دوائية منظمة ، وانعكست السعات & lt-0.67 أزواج الجينات الدوائية الخاضعة للتنظيم السفلي. لبناء تفاعل كامل مع مضيف للفيروس ، قمنا بدمج 712 جينًا مضيفًا تم تحديده في دراسة مصيدة الجينات مع 2449 جينة مضيفة تم استخلاصها من الأدبيات بناءً على تجارب على 54 فيروسًا باستخدام RNAi. تم توفير معلومات البيانات التفصيلية في الجدول S1. بعد إزالة البيانات المكررة ، حصلنا عليها

2600 جين مضيف ، والتي تم استخدامها بعد ذلك لبناء تفاعل عالمي لمضيف الفيروس. ثم قمنا بتعيين مجموعات المسبار في التفاعل التفاعلي العالمي لمضيف الفيروس. في المجموع ، قمنا بتجميع

500000 زوج من الجينات الدوائية من CMap تربط 1309 دواء و 2600 جين مستهدف للفيروس.

لكل زوج من فيروسات الدواء ، قمنا بحساب عدد الجينات المضيفة التي يستهدفها فيروس معين ، تلك التي يتم تنظيمها صعودًا أو هبوطًا بواسطة العلاجات الدوائية ، بالإضافة إلى أزواج متداخلة أو متنافية (الشكل 1E). بعد ذلك ، حسبنا ص القيم من خلال اختبار فيشر الدقيق المصحح ص القيم باستخدام اختبار المقارنة المتعددة من Bonferroni في حزمة R لكل زوج من الفيروسات المخدرة. ثم استخدمنا ف & lt 0.1 كقطع لتحديد الأزواج المهمة لفيروسات الأدوية من أجل إعادة وضع الأدوية المضادة للفيروسات.

قياسات طوبولوجيا الشبكة

تقترح نظرية الشبكة أن هناك عنصرين مهمين للشبكات ، وهما العقد والحواف. لقد درسنا الشبكات ثنائية الجزء المضيف للفيروس ، حيث تمثل العقد الفيروسات والجينات الخلوية المضيفة ، والحواف تدل على التفاعلات التي وجدها المصيدة الجينية. بالنسبة لدراسات PIN ، كانت العقد تتكون من بروتينات واستندت الحواف إلى التفاعلات الفيزيائية المعروفة ، ودليل بنية البروتين ، والفسفرة. حسبنا قيم الاتصال (الدرجة) باستخدام Cytoscape v3.0.1. تم تعريف المحاور على أنها عقد مصنفة ضمن أفضل 20٪ في توزيع الاتصال ، بناءً على دراستين سابقتين [25 ، 26].


شاهد الفيديو: التفاعلات الدوائية على تطبيق Medscape (أغسطس 2022).