معلومة

ما هي الأسباب الشائعة لمنتجات الربط غير المتوقعة؟

ما هي الأسباب الشائعة لمنتجات الربط غير المتوقعة؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد هضمت اثنين من البلازميدات ، أحدهما يحتوي على EcoRI و AgeI والآخر باستخدام EcoRI و XmaI. بدت الملخصات كما هو متوقع ، لذلك قمت بتنقية الأجزاء المعنية وأعدت ربط T4 DNA (مواقع AgeI و XmaI متوافقة).

بعد تحول الإشريكية القولونية وثقافتها و miniprep من 12 من الثقافات الناتجة ، قمت بهضم العزلة من minipreps باستخدام BclI للتأكد من أن لدي المنتج الصحيح (لأنه كان هناك موقع BclI واحد في الملحق وآخر في 1.4 كيلوبايت على بعد العمود الفقري). تظهر نتائج هذا الملخص بوضوح أن هناك نوعين مختلفين من منتجات الربط: أربعة ممرات تشترك في نمط نطاقات واحد بينما تشترك الثمانية الأخرى في نمط مختلف عنه.

لقد تحققت من كلا البلازميدات بحثًا عن مواقع تقييد أخرى للإنزيمات المستخدمة والتي أغفلتها من قبل ، لكنني لم أجد أيًا منها. نظرًا لأن مواقع EcoRI و XmaI / AgeI تختلف اختلافًا جذريًا (AATT مقابل CCGG) ، فإنني سأستبعد إمكانية ربط الملحق في اتجاه عكسي.

هل هناك أي أسباب شائعة لمتغيرات الربط غير المتوقعة إلى جانب مواقع التقييد غير الملحوظة والربط العكسي؟


يمكن إدخال البلمرة. إذا كان لديك امتداد الحمض النووي الخاص بك مثل هذا:

(5 ') - AATTagctagcatcgtgatcgacg- (3') |||||||||||||||| (3 ') - tcgatcgtagcactagcagcGGCC- (5')

وأنت تأخذ ذلك ، اقلبه ، سوف يرتبط بنفسه ، مثل هذا:

(5 ') - AATTagctagcatcgtgatcgacg- (3') (5 ') - CCGGcgacgatcacgatgctagct- (3') |||||||||||||| |||||||||||||كومة. ||| (3 ') - tcgatcgtagcactagcagcGGCC- (5') (3 ​​') - gctgctagtgctacgatcgaTTAA- (5')

هذا سهل بما يكفي للتحقق منه. فقط احسب حجم الأجزاء التي تتوقعها من متجه مع إدراجين (سيكون هناك موقع قطع BcII إضافي الآن ، ومن المحتمل أن يكون الجزء الإضافي هو حجم الملحق). إذا كان هذا بدافع الفضول فقط ، وكان أحد الأشياء الخاصة بك هو الحجم الصحيح ، فسأتجاهل الأشياء التي لم تنجح وأمضي قدمًا في الأشياء التي فعلت.

إذا كانت لديك مشكلة في ذلك ، أو كنت تحصل على بلمرة جميع النسخ المستنسخة ، فيمكنك معالجة الإدخال الخاص بك باستخدام الفوسفاتيز القلوي. سيؤدي ذلك إلى تآكل الفوسفات (5 بوصات) الذي يحتاجه الليجاز للالتصاق بالهيدروكسيل (3 بوصات). والنتيجة هي أن الإدخال غير قادر على الارتباط بإدخال آخر ، ولكن بمجرد العثور على متجه ، سيكون قادرًا على الربط:

أدخل للإدراج: AATTagctagctagcgtgatcgacg- (3 ') :( CCGGcgacgatcacgatgctagct- (3') |||||||||||||||| |||||||||| ||||||| (3 ') - tcgatcgtagcactagcagcGCC :( (3') - gctgctagtgctacgatcgaTTAA إدراج إلى المتجه: ... ctagct- (3 ') AATTagctagcatcgtgatcgacg- (3') (5 ') ... |||||| ||||||||||||||كومة ||| | |||| ') -gctgc ...

ستكون هناك شقوق في أعلى اليسار وأسفل اليمين ، لكن الخطأ الذي تضعه فيه يجب أن ينظفها لك. يمكنك الحصول على الفوسفاتيز القلوي بسعر رخيص إلى حد ما من العديد من الأماكن ، يعتبر NEB دائمًا رهانًا آمنًا.


أشار تحقيق ثانٍ إلى أن منتج الربط المعني كان بالفعل الناقل ، بدون إدخال مُربَط!

احتوى المتجه أيضًا على موقع BamHI بالقرب من موقع XmaI ، لذلك في ملخص لاحق مع EcoRI و BamHI ، كنت أتوقع رؤية نفس أحجام النطاق التي ربطتها معًا في المقام الأول.

احتوت جميع المستعمرات على بلازميدات أنتجت النطاق الطويل (المتجه) ، وأنتجت نفس المستعمرات الثمانية التي كانت من قبل الفرقة الأقصر (المدرجة) أيضًا. ومع ذلك ، فإن تلك الأربعة التي كانت منحرفة في التجربة السابقة كانت هذه المرة تفتقر إلى النطاق الأقصر.

هذا يعني أن المستعمرات الثماني ذات العصابات احتوت على منتج الربط المطلوب ، بينما احتوت الأربعة الأخرى على بلازميد تم تقييده في موقع واحد (كان من الممكن أن ينتج عن عدم هضمه ثلاث نطاقات مثل عنصر التحكم).

نظرًا لأن موقع BamHI كان متجهًا ولم يتم لمسه طوال العملية بأكملها ، فقد استنتجت أن هؤلاء الأربعة كانوا يفتقدون إلى موقع EcoRI ، والذي كان يجب تجديده أثناء الربط ، وبالتالي يجب أن يكون موقع EcoRI وموقع XmaI مرتبطين بدون أدخل بطريقة أو بأخرى.

قصة طويلة قصيرة

هذا يعني ذلك أيضًا

  • نوكلياز خارجي هضم الأطراف اللزجة للناقل بعيدًا ، أو
  • النهايات اللزجة تتحلل ببساطة عن طريق الصدفة

مما يؤدي إلى إعادة ربط غير حادة للناقل دون إدخال وبالتالي فقد موقع EcoRI.

أعتقد أن هذه أشياء مهمة جدًا يجب مراعاتها عند الاستنساخ - في التجارب اللاحقة ، كان لدي العديد من المستعمرات التي تنمو على لوحات تحكم سلبية (أي المستعمرات التي تحولت بربط تحكم لا يحتوي على إدراج) ، وكلها ربما كانت بسبب فقدان اللزوجة النهايات والارتباطات الحادة ، مما ينتج عنه بلازميدات وظيفية تمنح مقاومة الأمبيسلين على الرغم من احتوائها على بلازميد غير مرغوب فيه.