معلومة

أين يمكن أن توجد خميرة الخميرة في أعلى تركيزات في البيئة؟

أين يمكن أن توجد خميرة الخميرة في أعلى تركيزات في البيئة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أعاني من ربو الخبازين على وجه التحديد بسبب الخميرة "Sc" ، وأعلم أن أتجنب المخابز ومصانع الجعة وما إلى ذلك ...

لقد اكتشفت عدم إزعاج أكوام الأوراق المتعفنة ، ونشارة اللحاء المتخمرة. اين أيضا؟

ما هي النسبة المئوية الأعلى للتركيزات في فلوريدا ، على عكس ولاية نيويورك؟


فيما يلي رابط لمقال مثير للاهتمام يقدم تقريرًا عن مسح للعزلات البرية خميرة الخميرة في الصين.

وانج ، تشي مينج ، وآخرون. (2012) مجموعات متباينة بشكل مفاجئ من Saccharomyces cerevisiae في بيئات طبيعية بعيدة عن النشاط البشري. مول ايكول 21: 5404-5417

اقتباس ذو صلة من المقال:

بالإضافة إلى لحاء العنب والبلوط (Quercus spp.) ، تم عزل S. cerevisiae بنجاح من مجموعة متنوعة من الفاكهة التالفة التي تم جمعها في البساتين أو الأسواق في مقاطعات مختلفة من الصين ؛ من لحاء الأشجار المتساقطة المختلفة ؛ تربة الغابات والأخشاب الفاسدة التي تم جمعها في غابات بدائية وثانوية ومزروعة تقع في مناطق مختلفة تغطي المناطق المناخية المعتدلة وشبه الاستوائية والمدارية من شمال إلى جنوب الصين. بشكل غير متوقع ، كان معدل نجاح عزل S. cerevisiae من عينات الفاكهة (6.5٪) أقل من ذلك المأخوذ من لحاء الأشجار (16.5٪) والتربة (10.8٪) وعينات الأخشاب المتعفنة (9.2٪). تم عزل S. cerevisiae بشكل متكرر من عينات تربة الغابات (معدل نجاح 13.7٪) مقارنة بعينات تربة البساتين (معدل النجاح 9.1٪). من بين الثمار التي أعطت عزلة S. cerevisiae موجبة ، أظهرت عينات العنب أقل نسبة نجاح.

الجدول S2 في سجلات المعلومات التكميلية يعزل على النحو التالي:

مواقع المناطق المناخية المعزولة __________________________________ استوائية 5 20 شبه استوائي 2 14 معتدل 13 51

ظاهريًا ، يبدو من هذا أنه من المحتمل أن يكون هناك اختلاف بسيط بين ولاية نيويورك (الرطبة والقارية) وفلوريدا (الرطبة وشبه الاستوائية).


كل شيء عن الميكروبات الصغيرة

الخمائر هي كائنات دقيقة حقيقية النواة مصنفة في المملكة الفطريات ، مع حوالي 1500 نوع موصوف حاليًا أنها تهيمن على التنوع الفطري في المحيطات. تم استخدام أنواع الخميرة Saccharomyces cerevisiae في خبز المشروبات الكحولية وتخميرها منذ آلاف السنين. كما أنه مهم للغاية باعتباره كائنًا نموذجيًا في أبحاث بيولوجيا الخلية الحديثة ، وهو أحد أكثر الكائنات الدقيقة حقيقية النواة التي تم بحثها بدقة.

الخمائر شائعة جدًا في البيئة ،

1) معزول بشكل رئيسي من المواد الغنية بالسكر. تشمل الأمثلة الخمائر التي توجد بشكل طبيعي على قشرة الفاكهة والتوت (مثل العنب أو التفاح أو الخوخ) ، والإفرازات من النباتات (مثل عصارات النباتات أو الصبار). تم العثور على بعض الخميرة مع التربة والحشرات.

2) الوظيفة البيئية والتنوع البيولوجي للخميرة غير معروفين نسبيًا مقارنة بوظائف الكائنات الحية الدقيقة الأخرى.

3) تم العثور على الخمائر بما في ذلك Candida albicans و Rhodotorula rubra و Torulopsis و Trichosporon cutaneum التي تعيش بين أصابع القدم كجزء من فلورا الجلد.

3) توجد الخمائر أيضًا في نباتات أمعاء الثدييات وبعض الحشرات.

4) المعالجة الحيوية للهيدروكربونات. بعض الخميرة لها تطبيقات في مجال المعالجة الحيوية. من المعروف أن إحدى هذه الخميرة ، وهي Yarrowia lipolytica ، تعمل على تحلل النفايات السائلة لمصانع زيت النخيل ، و TNT (مادة متفجرة) وغيرها من المواد الهيدروكربونية مثل الألكانات والأحماض الدهنية والدهون والزيوت. كما يمكن أن تتحمل تركيزات عالية من الملح والمعادن الثقيلة ، ويتم فحصها لاحتمالية كونها مادة ماصة حيوية من المعدن الثقيل.

النفط الخام هو خليط من الهيدروكربونات بأحجام مختلفة. تقوم الكائنات الدقيقة المختلفة بتفكيك الهيدروكربونات ذات الأحجام المختلفة.

استخدم في البيئة المائية

غالبًا ما يستخدم هواة أحواض السمك الخميرة لتوليد ثاني أكسيد الكربون (CO2) لتخصيب النباتات في أحواض السمك المزروعة. يستخدم على نطاق واسع في إعداد محلي الصنع كبديل رخيص وبسيط لأنظمة ثاني أكسيد الكربون المضغوط. تستخدم النباتات ثاني أكسيد الكربون في عملية التمثيل الضوئي ، ومن المهم جدًا نمو النبات. إنه آمن تمامًا للأسماك والحيوانات المائية الأخرى.

استهلاك بشري:

المكملات الطبيعية والبروبيوتيك للاستهلاك البشري تستخدم الخميرة في المكملات الغذائية الشائعة لدى النباتيين وذوي الوعي الصحي ، حيث يشار إليها غالبًا باسم & # 8220 الخميرة الغذائية & # 8221. عادة ما تكون خميرة الخميرة.

إنه مصدر ممتاز للبروتينات والفيتامينات ، وخاصة فيتامينات ب المركب ، التي ترتبط وظائفها بعملية التمثيل الغذائي وكذلك المعادن والعوامل المساعدة الأخرى اللازمة للنمو.

تستخدم بعض مكملات البروبيوتيك الخميرة Saccharomyces boulardii للحفاظ على الفلورا الطبيعية في القناة الهضمية الكبيرة والصغيرة واستعادتها. وقد ثبت أن S. boulardii للحد من أعراض الإسهال الحاد لدى الأطفال ، ومنع الإصابة مرة أخرى من المطثية العسيرة ، وتقليل حركة الأمعاء في حالات الإسهال السائدة في مرضى القولون العصبي ، وتقليل حدوث المضادات الحيوية ، والمسافر & # 8217s ، والإسهال المرتبط بفيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز.


مقدمة

خميرة الخميرة يمكن القول إنه أكثر الكائنات حقيقية النواة التي تمت دراستها بشكل مكثف إلى جانب البشر. جعلت قابليته للتتبع الجيني منه كائنًا نموذجيًا قيمًا لعلم الوراثة وعلم الجينوم وبيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية (مثل Goffeau وآخرون. ، 1996 سبيلمان وآخرون. ، 1998 هارتويل وآخرون. ، 1974). لكن تاريخها الطويل في التدجين البشري يجعلها أقل من مثالية لبحوث البيئة والتطور. غالبًا ما يفضل علماء الأحياء التطورية وعلماء البيئة دراسة الأنواع الأخرى في الجنس السكريات، والتي تضم سبعة أنواع معروفة والعديد من الأنواع الهجينة (الشكل 1). كلها يمكن تتبعها مثل S. cerevisiae في المختبر. عدة ، بما في ذلك S. cerevisiaeالأقرباء ، س. مفارقة، توجد فقط في البرية وليس في التخمير البشري. الجميع السكريات الأنواع لها أشكال متشابهة وأنماط ظاهرية كيميائية حيوية (Vaughan-Martini and Martini ، 2011) ، على الرغم من وجود بعض السمات المهمة بيئيًا التي تختلف بين الأنواع ، على سبيل المثال تحمل درجة الحرارة (Sampaio and Gonçalves ، 2008). معلومات حول السكريات يمكن أن تضع الخمائر S. cerevisiae البيولوجيا الجزيئية في السياق البيئي والتطوري. لقد علمنا هذا الفرع أيضًا دروسًا حول الإيكولوجيا المتخصصة ، والتهجين ، والتدجين ، وعلم الوراثة السكانية والجغرافيا الحيوية التي تتجاوز المقارنات مع S. cerevisiae.

هنا سنراجع استخدام س. مفارقة وأقاربها لفهم تاريخ الخميرة الطبيعي وعلم البيئة والتطور. نحن نركز على س. مفارقة لأنه أفضل دراسة السكريات إلى جانب الخميرة S. cerevisiae. الأدب على السكريات الأنواع التي ليست كذلك س. مفارقة أو S. cerevisiae ينمو بسرعة ، ونقوم بتضمين معلومات عن أخرى السكريات محيط (S. eubayanus, S. uvarum, S. kudriavzevii, S. arboricola و S. mikatae) عندما يكون متاحًا. نوصي بمزيد من الأحدث السكريات المراجعات التي تركز على المقارنات مع S. cerevisiae (ريبانسكي وآخرون. ، 2008) ، والانتواع (Greig ، 2009) وعلم الجينوم التطوري (Hittinger ، 2013) للقراء المهتمين.


نتائج

تم انتشال تسعة أنواع مختلفة من الخمائر من عصير العنب والتخمير الناتج عن ذلك. يبدو أنه حدثت فترتان متميزتان من التمدد الميكروبي: فترة سابقة تشتمل على غير-السكريات وأخرى لاحقة تتكون فقط من S. cerevisiae. لم يمكن الكشف عن S. cerevisiae في اليوم الأول من التخمير ، ولكن بحلول اليوم الحادي عشر كان النوع السائد. من الواضح أن S. cerevisiae كانت نادرة جدًا في البداية ولكنها زادت بكثرة وأزاحت مختلف أنواعالسكريات الأنواع كما فعلت ذلك (الشكل 1): هذا يتوافق مع الملاحظات الديناميكية لمجموعات الخميرة للخميرة التقليدية الأخرى (Pretorius 2000، Xufre et al.2006).

التغيير في تكوين مجتمع الخميرة ودرجة الحرارة وتركيز الإيثانول أثناء تخمير النبيذ التقليدي. الموضح هو التغيير في حجم السكان (وحدات تشكيل مستعمرة ، cfu) لغير -السكريات الخمائر (خطوط سوداء رفيعة متقطعة) و S. cerevisiae (خطوط صلبة سوداء رفيعة) في أربعة براميل منفصلة على مدى 20 يومًا من التخمر. يظهر أيضًا متوسط ​​التغير في درجة الحرارة (الخط الأحمر الثقيل) ومستويات الإيثانول المقدرة من التغير في الثقل النوعي (الخط الأزرق الثقيل) لهذه البراميل الأربعة على مدار الأيام 6-16 من الخميرة.

يعتبر عصير العنب نفسه وسطًا قاسيًا من بين أشياء أخرى ، حيث يحتوي على درجة حموضة منخفضة تبلغ 3.5 ويفرض ضغطًا تناضحيًا لأن السكر عادةً يتراوح بين 200 و 350 جم / لتر (Ribereau-Gayon et al. 2006). من أجل التفريق بين تأثيرات الإيثانول وحده ، أو التفاعل بين الإيثانول والضغوط الأخرى التي يفرضها عصير العنب ، تم اختبار معدلات نمو الأنواع المختلفة من المجتمع في وسط معمل معتدل (YPD) وفي عصير العنب المكمل. مع 0٪ و 3٪ و 9٪ من الإيثانول عند 30 درجة مئوية. ثبت أن معدل النمو يتأثر بشكل كبير بنوع الوسائط ومستوى الإيثانول وأنواع الخميرة وجميع التفاعلات الممكنة لهذه التأثيرات (ANOVA ثلاثي الاتجاهات ، وجميع التأثيرات الرئيسية والتفاعلات المحتملة الناتجة ص & lt 0.001). بقيت أهمية هذه التأثيرات عند تجميع الخمائر في S. cerevisiae وغيرالسكريات الطبقات ، بصرف النظر عن مستوى الإيثانول - تفاعل الوسائط: انخفضت معدلات نمو كلا الفئتين مع ارتفاع مستوى الإيثانول. يوضح الشكل 2 حجم هذه التأثيرات وتفاعلاتها. يظهر ANOVA أن الفرق بين معدل نمو S.السكريات في عصير العنب مع عدم وجود الإيثانول ذو أهمية عالية (ص & lt 0.0001): هنا تتمتع S. cerevisiae بميزة لياقة بدنية تبلغ 4.1٪ لكل ساعة (م = 0.04 ساعة -1). قد لا تبدو هذه الميزة رائعة ، لكنها ستسمح لـ S. cerevisiae بالزيادة من 0.1٪ إلى 99.9٪ من المجتمع في غضون 14 يومًا فقط. الفرق بين S. cerevisiae وغيرالسكريات تظل الأنواع في عصير العنب مهمة عند إضافة 3 ٪ من الإيثانول (ANOVA أحادي الاتجاه ، ص & lt 0.0001). في هذه البيئة ، S. cerevisiae تبلغ نسبة تركيبها 6.2٪ في الساعة (م = 0.06 ساعة −1 10 أيام للانتقال من 0.1٪ إلى 99.9٪): يبدو أن إضافة الإيثانول إلى عصير العنب زاد من الميزة التنافسية لـ S. cerevisiae بنحو النصف مرة أخرى مثل تلك الموجودة في عصير العنب وحده. عند فحص البيانات ، وجدت أنه لا يوجد فرق كبير في معدل النمو بين أي من الأنواع في YPD وحده (ANOVA ، ص = 0.5) ، وأن إضافة 3٪ إيثانول إلى YPD لم يغير ذلك (ANOVA ، ص = 0.1). يُظهر الفحص الدقيق أنه في حين أن معظم الأشخاص غيرالسكريات الأنواع غير قادرة على النمو في YPD بنسبة 9 ٪ من الإيثانول ، ولم يظهر أحد أفراد المجتمع فرقًا معنويًا في النمو مقارنة بـ S. cerevisiae (ص = 0.19). مع تساوي كل شيء آخر ، فإن عزلة Issatchenkia terricola هذه متساوية في المنافسة مثل S. cerevisiae في وجود الإيثانول حتى تركيزات تصل إلى 9٪.

تأثير البيئة وتركيز الإيثانول على معدل نمو الأنواع في مجتمع الخميرة. يوضح الشكل التغيير (يعني ± SE) في معدل النمو (كما هو مقدر بأقصى تغيير في الكثافة الضوئية [OD ، الامتصاصية عند 660 نانومتر] على مدار 24 ساعة) للغيرالسكريات (مثلثات تعني ستة أنواع ، ن = 3 لكل نوع) و S. cerevisiae (مربعات ن = 6) في YPD (1٪ مستخلص الخميرة ، 2٪ ببتون ، 2٪ جلوكوز مفتوح ، خط متقطع) وعصير العنب (رموز صلبة ، خط صلب) مكمل بـ 0٪ ، 3٪ ، و 9٪ حجم / حجم إيثانول.

كان لطبيعة البيئة (العصير مقابل YPD) تأثير كبير وهام على الاختلاف في معدل النمو بين S.السكريات عند 30 درجة مئوية. يبدو من الواضح أن المستويات المنخفضة من الإيثانول لا تسمم بشكل كبيرالسكريات الخميرة في هذا المجتمع ، ويبدو أن البعض يتسامح مع مستويات الإيثانول المرتفعة بشكل معقول. تشير هذه البيانات إلى أن الميزة البيئية لـ S. cerevisiae ترجع إلى حقيقة أنها تتكيف بشكل أفضل مع العصير في حد ذاته عند مقارنتها بالعصير غير.السكريات، ويتفاقم هذا من خلال إضافة الإيثانول. يقدم هذا دليلاً على أن إنتاج الإيثانول ، والتكيف مع النمو الأفضل في وجود الإيثانول ، هو مثال على التغذية المرتدة التطورية من البناء المتخصص. هل هذه الجوانب هي التفسير الكامل للتغيير في تكوين المجتمع؟ بصرف النظر عن الارتفاع الهندسي في مستويات الإيثانول ، هناك على الأقل تغير بيئي آخر يرتبط بانخفاض نسبة الإيثانول.السكريات والزيادة في S. cerevisiae: درجة الحرارة (انظر الشكل 1).

يظهر فحص كيمياء التخمير أن الإيثانول وثاني أكسيد الكربون2 ليست المنتجات الوحيدة: نظرًا لأن التفاعل يكون خارجيًا ، يتم إطلاق الطاقة أيضًا. إطلاق الطاقة النظرية من تحويل محلول واحد متساوي القطب من الجلوكوز: الفركتوز إلى إيثانول وثاني أكسيد الكربون2 هو 104.43 كيلوجول / مول (ويليامز 1982). نظرًا لأن عصير العنب قريب من ضرس جلوكوز واحد: الفركتوز ، فهذا ليس بعيدًا عن الطاقة الكامنة التي يتم إطلاقها أثناء التخمر. يستغرق ∼ 3.43 جول لتسخين 1 مل من عصير العنب بمقدار 1 درجة مئوية. لذلك ، فإن تخمير 1 لتر من الجلوكوز المتساوي: محلول الفركتوز سيحرر 104.43 كيلوجول ، ويمكن أن يؤدي ذلك إلى تسخين عصير العنب بمقدار -30 درجة مئوية. بالطبع ، هذا هو الوضع النظري حيث يكون التحويل فوريًا وفعالًا بنسبة 100٪ ومعزول تمامًا. بينما نادرًا ما يتم استيفاء هذه الشروط ، فمن الواضح ذلك بالإضافة إلى الإيثانول وثاني أكسيد الكربون2، ينتج التخمير كمية كبيرة من الطاقة التي يتم نقلها إلى البيئة. في الواقع ، يمكن أن تتغير درجة حرارة الخميرة بشكل كبير مع استمرارها (Ribereau-Gayon et al.2006). أجريت الخميرة المتبعة في نهر كوميو في غرفة مكيفة ولكنها استمرت في الارتفاع من -15 درجة مئوية إلى -25 درجة مئوية (انظر الشكل 1): يرتبط هذا الارتفاع بزيادة تواتر S. cerevisiae. ليس من غير المعقول أن نفترض أن الارتفاع في درجة الحرارة يرجع إلى الإجراءات التخمرية لل S. cerevisiae.

نظرًا لتغير درجة الحرارة أثناء التخمير ، كنت مهتمًا بمعرفة ما إذا كان هذا قد لعب أي دور في التغيير في تكوين المجتمع الذي لوحظ. كيف تختلف معدلات النمو لمختلف أعضاء مجتمع الخميرة مع درجة الحرارة؟ تم تحديد الملف الحراري لمجموعة فرعية من الأنواع في المجتمع في YPD وعصير العنب لفحص التفاعل المحتمل بين البيئة ودرجة الحرارة. تأثر الحد الأقصى لمعدل النمو بشكل كبير بالبيئة (YPD أو عصير العنب) ، وأنواع الخميرة ، ودرجة الحرارة ، وبجميع التفاعلات الممكنة لهذه التأثيرات (كما هو موضح في ANOVA ثلاثي الاتجاهات ، وجميع التأثيرات الرئيسية والتفاعلات الممكنة الناتجة ص & lt 0.0001). يوضح الشكل 3 حجم التفاعل بين البيئة ودرجة الحرارة وأنواع الخميرة. من الواضح أن S. cerevisiae لديها ميزة معدل نمو على غيرالسكريات الأنواع فقط في عصير العنب الذي تبلغ درجة حرارته 20 درجة مئوية: هنا تتمتع S. cerevisiae بمتوسط ​​ميزة لياقة بنسبة 7.3٪ في الساعة (م = 0.07 تسعة أيام للانتقال من 0.1٪ إلى 99.9٪). لا تظهر ميزة S. cerevisiae أقل من 20 درجة مئوية في عصير العنب ولا عند أي درجة حرارة في وسط YPD (لا يوجد فرق كبير بين S.السكريات في YPD بشكل عام ص = 0.06 الهامشي ص القيمة ترجع إلى معدل النمو الأكبر لغيرالسكريات الأنواع عند 30 درجة مئوية). أحد الأسباب المحتملة لتأثير درجة الحرارة في العصير يرجع إلى التفاعل بين درجة الحموضة المنخفضة ودرجة الحرارة لأن كلاهما يؤثر على سلامة غشاء الخلية: يبدو أن S. cerevisiae تتكيف بشكل أفضل مع هذه الظروف من خلال التغذية المرتدة التطورية من البناء المناسب.

تأثير البيئة ودرجة الحرارة على معدل نمو الأنواع في مجتمع الخميرة. التغيير (يعني ± SE) في معدل النمو (كما هو مقدر بأقصى تغير في الكثافة الضوئية [OD ، الامتصاصية عند 660 نانومتر] في الساعة) للغيرالسكريات (مثلثات أربعة أنواع ، ن = 3 لكل منهما) و S. cerevisiae (مربعات أربع عزلات ، ن = 3 لكل منهما) في YPD (رموز مفتوحة ، خط متقطع) وعصير العنب (رموز صلبة ، خط متصل) عبر مجموعة من درجات الحرارة.


نتائج

استخدمنا الوسائل والتباينات المبلغ عنها من التنميط الظاهري المورفولوجي الكمي لـ 4718 سلالة فردية من YKO [17] لتحديد المكثفات المظهرية. تعريفنا العملي للمكثف هو منتج جيني يسبب تباينًا كبيرًا في العديد من الأنماط الظاهرية غير المتكررة عند حذفه. لتحديد منتجات الجينات التي تستوفي هذا المعيار ، يجب التغلب على ثلاثة عوائق: (1) يجب إنشاء مقياس التباين الذي لا يعتمد على المتوسط ​​حتى لا يتم الخلط بين التغييرات في التباين مع التغيرات في متوسط ​​النمط الظاهري [18] (2) ) يجب استبعاد الطرز الظاهرية الزائدة عن الحاجة بيولوجيًا أو فيزيائيًا (تقليل الأبعاد) و (3) يجب إنشاء درجة قوية للتباين الكلي في الطرز المظهرية المتعددة.

لقد تناولنا العقبة الأولى بالتخطيط ، لكل نمط ظاهري ، الانحراف المعياري مقابل متوسط ​​كل YKO ، مع ملاءمة انحدار منخفض (مرجح محليًا) لكل قطعة ، وحساب المسافة المتبقية لكل نقطة من الانحدار (الشكلان 1B و S1 ). تم توحيد هذه المخلفات من الانحراف المعياري ، والتي تمثل مقياسًا للتباين المتحكم فيه للمتوسط ​​، لوزن كل نمط ظاهري بالتساوي.

لتقليل الأبعاد ، استخدمنا التقسيم حول المتوسطات (PAM) ، وهو متغير قوي من k-mean clustering. من خلال تحليل متوسط ​​عرض الصورة الظلية ، وهو مقياس لفصل المجموعات ، قدرنا أنه يمكن تقليل 220 نمطًا ظاهريًا أصليًا إلى 70 نمطًا ظاهريًا تمثيليًا ("الوسطيات") (الشكل S2).

لتوليد مقياس واحد للتباين الظاهري العام عند حذف الجين ، قمنا بحساب متوسط ​​أعلى 35 (من 70) من مخلفات الانحراف المعياري لكل YKO (الجدول S1). كانت هذه الدرجة ، التي نطلق عليها اسم إمكانات النمط الظاهري ، قوية للغاية حتى بالنسبة للتغييرات الكبيرة في إجراء التجميع والمتوسط ​​ولم يبدو أنها متحيزة بتأثيرات الحافة المحتملة في الإجراء المنخفض (الأشكال S3-S6).

لتحديد الجينات ذات الدرجات المحتملة للنمط الظاهري أعلى بكثير مما كان متوقعًا بالصدفة ، قمنا بمقارنة توزيع درجات جميع YKOs بالتوزيعات التي تم إنشاؤها عندما يتم تبديل القيم داخل كل نمط ظاهري أولاً. بناءً على تحليل التقليب هذا ، تم تحديد الجينات 502 ذات أعلى إمكانات النمط الظاهري كمكثفات نمطية مفترضة مع معدل اكتشاف خاطئ مقدر (FDR) يبلغ 0.34 (الشكل 1C). يزيد FDR هذا العدد المقدر للإيجابيات الحقيقية (الشكل S7 وانظر المواد والأساليب). لذلك نقدر أن 333 جينًا من إجمالي 502 جينة تم تحديدها هي إيجابيات حقيقية ، مع إمكانات نمطية أعلى مما يمكن توقعه بالصدفة. لتحليل المصب ، تم فصل أفضل 502 جينًا إلى ثلاث فئات.يُطلق على أهم 60 جينة عالية الثقة (FDR = 0) ، والجينات الـ 206 التالية ذات الثقة المتوسطة (قطع FDR = 0.10) ، والجينات الـ 266 التالية منخفضة الثقة (قطع FDR = 0.34) "C1 ،" C2 ، " و "C3" على التوالي.

التحقق من صحة المكثفات المظهرية

لقد تحققنا من تحديدنا للمكثفات من خلال تكرار التنميط الظاهري لـ 50 سلالة C1 و 50 سلالة تحكم في مختبرنا. تم تمرير المسوخات Haploid في مكتبة YKO المستخدمة في التنميط الظاهري الأصلي لعدد غير معروف من الأجيال. نظرًا لأن بعض الضربات القاضية قد تزيد من معدلات الطفرات وبالتالي تسبب تقلبًا ظاهريًا لا يرتبط بفقدان التخزين المؤقت البيئي ، فقد استخدمنا بدلاً من ذلك مكتبة YKO ثنائية الصبغية أحادية الزيجوت قابلة للتحويل [19] واحتفظنا بعدد الأجيال بين التبويض والتثبيت بحد أقصى ∼50. أظهرت سلالات C1 تقلبًا ظاهريًا أكثر من سلالات التحكم (الشكلان 2 و S8). يبدو أيضًا أن الأنماط الظاهرية غير متجانسة للغاية بين سلالات C1 ، مما يشير إلى أن الضربات القاضية لا تؤدي جميعها إلى تعطيل عدد صغير من العمليات عالية المستوى التي تؤدي إلى مجموعة محدودة من الأنماط الظاهرية. باستخدام متوسطات النمط الظاهري والانحرافات المعيارية عن السلالات المائة المحولة أحادية الصيغة الصبغية فقط ، كررنا حساب إمكانات النمط الظاهري كما هو موصوف أعلاه ، باستخدام 70 نموذجًا ظاهريًا تم تحديده بالفعل (الشكل 2 ، أسفل اليمين). كان توقعنا أن هذا التحليل المتكرر من شأنه أن يقلل من الطاقة لأن العدد الكبير نسبيًا من سلالات C1 التي تظهر تباينًا مرتفعًا من شأنها أن تحيز الانحدار المنخفض لتقليل حجم المخلفات. حتى مع هذا القيد ، وجدنا أن الدرجات المحتملة للنمط الظاهري أعلى بشكل واضح في سلالات C1 (ص & lt 9.8 × 10 10 ، اختبار ويلكوكسون مان ويتني). للحصول على مقياس أقل تحفظًا لإمكانات النمط الظاهري ، قمنا بأخذ عينات من البيانات من سلالات المكثف والتحكم في نسبة تقريبية لأعدادها في التحليل الأصلي (من خمسة إلى 42) ، وحساب الدرجات على 1000 عينة متكررة ، ومتوسطها عبر جميع العينات البالغ عددها 1000 لحساب النهائي. إمكانات النمط الظاهري (الشكل S9). في حين أن هذا التحليل لا يزال يؤدي إلى تحيز متحفظ بسبب تقليل المخلفات عند حواف الانحدار المنخفض بسبب نقاط بيانات أقل ، فإن المكثفات تظهر إمكانات نمطية أعلى بمقدار ضعف من عناصر التحكم (ص & lt 2.7 × 10 10 ، اختبار ويلكوكسون مان ويتني). الاستثناء الملحوظ هو RAD27 ، الذي يتمتع بإمكانية نمط ظاهري أقل من جميع سلالات التحكم باستثناء ثلاث سلالات في التحليل الأول الأكثر تحفظًا وكلها باستثناء تسعة في تحليل أخذ العينات الأقل تحفظًا. يتسبب حذف RAD27 في ظهور نمط ظاهري متحور تلقائي قوي [20] ، مما يشير إلى أن التباين الظاهري المرتفع الذي لوحظ في YKO الأصلي قد يكون ناتجًا عن تراكم الطفرات. قمنا أيضًا بأخذ عينات من عشرة مكثفات في فئتي C2 أو C3 وأظهرت هذه أيضًا درجات أعلى بكثير من إمكانات النمط الظاهري من سلالات التحكم (ص & lt 0.002 ، اختبار ويلكوكسون مان ويتني).

يتم عرض الصور المجهرية التمثيلية من أمثلة مكثف النمط الظاهري المفترض (HPR1 ، KEM1 ، SWI6 ، BEM2 ، CLA4 ، DIA2 ، RAD52) وسلالات التحكم (YDR279W و YCR100C). الخلايا ملطخة بـ FITC-concanavalin A (أخضر) ، رودامين phalloidin (أحمر) ، و DAPI (أزرق). أسفل اليمين: رسم بياني لإمكانيات النمط الظاهري للتحكم (أسود) ومكثف النمط الظاهري (أحمر) YKOs لسلالات ثنائية الصبغيات متغايرة الصبغيات المحولة.

كتحقق إضافي ، بحثنا عن أدلة في أدبيات المكثفات التي تسبب زيادة في التباين من خلية إلى أخرى. في الواقع ، لقد ثبت أن الضربات القاضية للمكثفات CCR4 و CLN3 و SWI6 تؤدي إلى زيادة التباين في حجم الخلية ثنائية الصبغيات في الوسائط السائلة [21]. الضربة القاضية لـ CCR4 تتسبب أيضًا في تشكل مستعمرة غير منتظمة على وسط صلب ، وهو اكتشاف يتوافق مع التباين المتزايد من خلية إلى أخرى [22]. تم تحديد عضوين آخرين من المجمع الأساسي CCR4-NOT ، وهما NOT5 و POP2 ، كمكثفات في شاشتنا مما يشير إلى أن تعطيل هذا المجمع التنظيمي النسخي من المحتمل أن يؤدي إلى عدم التجانس الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، اثنان من ثلاثة بالضربة القاضية تزيد من ضوضاء التعبير الجوهري لمروج PHO5 هما المكثفات ARP8 و SNF6 [23]. أخيرًا ، ثبت أن الضربة القاضية للمكثف FUS3 تزيد من التباين من خلية إلى أخرى استجابة لإشارة فرمون [24].

يتم إثراء المكثفات المظهرية في العديد من فئات علم الوجود الجيني

قمنا بعد ذلك بالتحقيق في المجموعة الكاملة المكونة من 502 مكثفًا للتخصيب في شروط المعالجة الجينية (GO http://www.geneontology.org/) (الجدول S2). يتم إثراء المكثفات المظهرية بشكل كبير في العديد من العمليات ، والتي يمكن تصنيف معظمها على نطاق واسع في صيانة وتنظيم الحمض النووي ، ودورة الخلية وتنظيم الخلية ، والاستجابة للمنبهات مثل الإجهاد ، واستطالة الحمض النووي الريبي ، أو تعديل البروتين. من المحتمل أن تمثل هذه المجموعة المتنوعة من المصطلحات الغنية عمليات يمكن أن تؤدي إلى تغييرات خلوية واسعة عند التعطل.

على وجه التحديد ، تحتوي المكثفات على 123 من 565 ORFs مشروحة بـ "تنظيم الكروموسوم والتكوين الحيوي" و 80 من 275 ORFs مشروحة بمصطلح ابنتها ، "تنظيم التيلومير والتكوين الحيوي" (ص & lt 2.9 × 10 −27 و ص & lt 2.1 × 10 25 ، على التوالي ، التوزيع الهندسي الفائق مع تصحيح Bonferroni). يتضمن ذلك جميع الجينات المشروحة مع نشاط إعادة التركيب ، ومجمع الإنزيم الإنزيم تيلوميراز بأكمله ، ومجمع RecQ هيليكس توبو III بالكامل ، وجميع الجينات باستثناء جين واحد من وحدة إعادة التركيب المتماثل ، وجميع الجينات المشاركة في إصلاح ما بعد النسخ ، ومجمع CTF18m بأكمله المتضمن في التماسك الكروماتيد الشقيق وإشارة نقطة فحص تكرار الحمض النووي ، يعتقد أن وحدة MMS22m بأكملها متورطة في إصلاح كسر الخيط المزدوج ، وكلا الجينات من وحدة HEX3m [25]. ومع ذلك ، فإن الوحدات الأخرى التي من المحتمل أن تسبب عدم استقرار الحمض النووي غائبة ، بما في ذلك وحدة إصلاح استئصال النوكليوتيدات ، ووحدة نقطة تفتيش الحمض النووي RAD9m ، والوحدة MUS81m المشاركة في شق الحمض النووي المتفرّع ، ووحدة TOF1m المشاركة في تعزيز التماسك الكروماتيد الشقيق إصلاح تلف الحمض النووي [25].

تشتمل المكثفات أيضًا على 28 منظمًا للنسخ العديد من منتجات الجينات المشاركة في إنتاج الرنا المرسال العالمي ، بما في ذلك جميع أعضاء مجمع كيناز بروتين المجال الكاربوكسي الطرفي ، والذي يُعتقد أنه يقرن استطالة النسخ مع استقلاب الرنا المرسال وتصدير العديد من المسام النووية- البروتينات المرتبطة ، بما في ذلك كل من أعضاء مجمع تصدير الرنا المرسال SAC3 / THP1 ، ما لا يقل عن سبعة منتجات جينية متورطة في ربط الرنا المرسال ما يقرب من نصف منتجات الجينات المشروحة بجينات الجسم لمعالجة الرنا المرسال السيتوبلازمي (P) المشاركة في نقل البروتين وتدهوره ، بما في ذلك ثلاثة أعضاء من مركب جولجي alpha-1،6-mannosyltransferase المترجم وثمانية منتجات جينية تشارك في تحمض الفجوات والجينات المشاركة في التحكم في تنظيم الأكتين (تسعة جينات) والأنابيب الدقيقة (12 جينًا) وفي ظهور البراعم أو الانتقاء.

من المحتمل أن تكون المكثفات المظهرية بمثابة محاور للشبكة

تحتوي شبكات التفاعل بين البروتين والبروتين (PPI) والتفاعل المميت الصناعي (SLI) على عدد صغير من العقد (المحاور) شديدة الارتباط والعديد من العقد غير المتصلة بشكل جيد [26،27]. في شبكات PPI ، من المرجح أن يكون حذف المحور مميتًا أكثر من حذف العقد الأخرى [26]. تشير هذه النتيجة إلى أن الخصائص الجينية ، على الأقل جزئيًا ، يمكن إرجاعها إلى بنية الشبكة العالمية. أشارت عمليات المحاكاة الرقمية الخاصة بنا لشبكات النسخ إلى أن القوة من المحتمل أن تكون خاصية ناشئة للشبكات المعقدة ، وأن بنية الشبكة في بعض الحالات تقيد الخصائص الوظيفية والتطورية [15 ، 16 ، 28]. توقع آخرون أن SLIs ضرورية لفهم التخزين المؤقت [29] أو أن المكثفات المظهرية من المحتمل أن تكون محاور [30 ، 31]. وبالتالي ، سألنا هنا عما إذا كانت إمكانات النمط الظاهري للجين يمكن عزوها إلى موضع الشبكة.

أولاً ، استخدمنا شبكات مستمدة من الاستشهادات الأدبية المنسقة [32] ومن المجموعة الكاملة تقريبًا من تفاعلات قياس الطيف الكتلي لالتقاط التقارب [33،34] لتحديد ما إذا كان متوسط ​​درجة PPI (عدد التفاعلات) للمكثفات مختلفًا عن ذلك من الجينات الأخرى. وجدنا أن المكثفات لديها تفاعلات فيزيائية أكثر من غيرها من المنتجات الجينية غير الأساسية ولكن أقل من منتجات الجينات الأساسية (الشكل 3 أ). نظرًا لأنه يتم إثراء المكثفات في فئات GO محددة ، فإن أحد التفسيرات المحتملة لدرجة عالية من المكثفات هو أنها تقع في فئات GO التي يميل أعضاؤها إلى الارتباط بشكل كبير. ومع ذلك ، في معظم الحالات ، يكون للمكثفات تفاعلات أكثر بكثير من الجينات غير الأساسية المطابقة لـ GO (الشكل S10). يبدو أن الاستثناءات من هذه القاعدة تحدث في الغالب في فئات GO حيث لا تختلف الجينات الأساسية وغير الأساسية في درجة PPI.

(أ) متوسط ​​عدد التفاعلات الفيزيائية عالية (C1 ، أزرق داكن) ، وسط (C2 ، أزرق) ، ومنخفض (C3 ، أزرق فاتح) مكثفات النمط الظاهري للثقة مقابل جميع الجينات غير الأساسية (رمادي فاتح) أو الجينات الأساسية (رمادي غامق) باستخدام جميع التفاعلات الفيزيائية في شبكة BioGRID المنسقة بالأدب (أشرطة صلبة) أو فقط تفاعلات قياس الطيف الكتلي لالتقاط التقارب (خطوط قطرية).

(ب) متوسط ​​إمكانات النمط الظاهري لجميع الجينات غير الأساسية (المربعات الزرقاء) أو الجينات غير الأساسية التي لم يتم تصنيفها على أنها مكثف نمط ظاهري (مثلثات سوداء) مرتبكة بعدد مؤشرات قياس الطيف الكتلي الخاصة بها.

(C) متوسط ​​عدد SLIs باستخدام جميع التفاعلات المشروحة في شبكة BioGRID المنسقة في الأدب (أشرطة صلبة) ، والتفاعلات المشتقة فقط من تجارب SGA مع الأخذ في الاعتبار الجينات المستخدمة كطعم فقط (خطوط قطرية) ، والتفاعلات المشتقة فقط من تجارب SGA مع الأخذ في الاعتبار الجينات فقط لا تستخدم كطعم (خطوط أفقية).

(د) متوسط ​​إمكانات النمط الظاهري لجميع الجينات غير الأساسية (المربعات الزرقاء) أو غير الأساسية (مثلثات سوداء) التي تم إهمالها من خلال عدد المربعات ذات الاقتباسات الأدبية.

(E) متوسط ​​معدلات النمو لكل من KO أحادي الصيغة الصبغية (القضبان الصلبة) ، و KO (خطوط قطرية) متغايرة الصبغية ، وسلالات KO ثنائية الصبغيات متماثلة اللواقح (خطوط أفقية). القيم متعلقة بالنوع البري.

(F) متوسط ​​إمكانات النمط الظاهري لجميع الجينات غير الأساسية (المربعات الزرقاء) أو غير الأساسية (مثلثات سوداء) التي تم إهمالها بمعدلات نموها أحادية العدد. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. الجميع ص- القيم هي مقارنة بالجينات غير الأساسية ، اختبار ويلكوكسون-مان-ويتني: * ، ص & lt 0.05 ** ، ص & lt 0.001 *** ، ص & lt 1 × 10 −5 **** ، ص & lt 1 × 10 −10.

تُظهر قطعة من إمكانات النمط الظاهري مقابل درجة PPI المحظورة أن المنتجات الجينية ذات الاتصال العالي لديها في المتوسط ​​إمكانات نمطية أعلى (الشكل 3 ب) هذه العلاقة يمكن تفسيرها بالكامل تقريبًا من خلال زيادة نسبة المكثفات في الصناديق شديدة الارتباط (الشكل S11). ومن المثير للاهتمام ، أن نسبة المكثفات تنخفض بشكل حاد عند درجات PPI أعلى من 30 ، بنسب مماثلة في أعلى (& gt80 PPI) وأدنى (& lt3 PPI). الغالبية العظمى من الجينات في هذا الصندوق الأعلى لها نسخة مكررة في الجينوم ، بما في ذلك 28 بروتينًا ريبوزميًا ، وثلاثة هيستونات ، وجدير بالذكر ، متماثلات Hsp90: HSP82 و HSC82. على الرغم من الدهشة ، فإن اكتشاف أن متماثلات Hsp90 لا تعمل كمكثفات في S. cerevisiae وفقًا لتعريفنا يتوافق مع دراسة سابقة وجدت أن نشاط Hsp90 ، وليس الضعف ، سمح للطفرات الجديدة بأن يكون لها نتيجة نمطية فورية [35]. ومع ذلك ، نجد متماثلًا لـ chaperone Hsp70 ، SSE1 ، ليكون مكثفًا في الخميرة ، بما يتفق مع الدراسات التي أجريت على أفراد عائلة Hsp70 الآخرين [36].

بعد ذلك ، استخدمنا جميع SLIs من الاستشهادات الأدبية المنسقة [32] ، ومرة ​​أخرى ، وجدنا أن المكثفات لديها درجة أعلى من الجينات غير الأساسية الأخرى (الشكل 3C ، الأشرطة الصلبة). نظرًا لأن مقايسات SLI على نطاق الجينوم قد اكتملت فقط لمجموعة فرعية من الجينات (∼267 تستخدم كطعم في تجارب المصفوفة الوراثية الاصطناعية [SGA]) ، فإن أحد التفسيرات المحتملة لارتفاع درجة المكثفات SLI هو أنها كانت أكثر احتمالًا لاستخدامها كطعم. للتحكم في هذا الاحتمال ، أنشأنا شبكة فرعية مشتقة فقط من تجارب SGA وقسمنا الجينات في هذه الشبكة إلى تلك التي تم استخدامها كطعم وتلك التي لم يتم استخدامها. لكل فئة ، وجدنا أن المكثفات لديها درجة SLI أعلى من الجينات غير الأساسية الأخرى (الشكل 3C ، الأشرطة المخططة). يتم الاحتفاظ بدرجة SLI الأعلى من المكثفات حتى عندما يتم التحكم في عدد التفاعلات الفيزيائية للجين (الشكل S12) أو عند مقارنة المكثفات بالجينات غير الأساسية الأخرى ضمن فئات GO (الشكل S13). تُظهر قطعة من إمكانات النمط الظاهري مقابل درجة SLI (الشكل ثلاثي الأبعاد) أن الجينات ذات الاتصال العالي لديها في المتوسط ​​إمكانات نمطية أعلى هذه العلاقة يمكن تفسيرها بالكامل تقريبًا من خلال زيادة نسبة المكثفات في الصناديق شديدة الارتباط (الشكل S11).

آثار الضربة القاضية للمكثفات المظهرية على معدل النمو

لقد أظهرنا أن المكثفات من المحتمل أن تكون PPI و / أو محاور SLI ، وأنها قد تكون أقل احتمالًا لأن تكون زائدة عن الحاجة وظيفيًا تمامًا ، وأنها تشارك في عدد من العمليات المركزية في الخلية. في هذه المرحلة ، قد يتساءل المرء عما إذا كان لاضطراب وظيفة المكثف تأثير كبير جدًا على اللياقة البدنية بحيث لا يلعب دورًا في التكيف. للتحقيق في هذا الاحتمال ، سألنا عما إذا كانت المكثفات أقل قابلية للاستغناء عن الجينات غير الأساسية الأخرى من خلال مقارنة معدلات نمو الطفرات أحادية الصيغة الصبغية [37] أو ثنائية الصبغيات [38]. في حين يبدو أن المكثفات ليس لها أي تأثير على معدل النمو في ثنائي الصبغيات غير المتجانسة ، إلا أنها أقل قابلية للاستغناء عنها في الضربات القاضية أحادية الصيغة الصبغية والمتماثلة اللواقح ، مع انخفاض معدل أكبر في أحادي الصيغة الصبغية (الشكل 3E). يتم الحفاظ على هذا التأثير حتى عندما نتحكم في درجة PPI (الشكل S12) أو عندما تمت مقارنة المكثفات بالجينات غير الأساسية الأخرى ضمن فئات GO (الشكل S14). الضربات القاضية الجينية التي تؤدي إلى انخفاض معدلات النمو بشكل كبير (أقل من 70 ٪ من النوع البري) في المتوسط ​​لها إمكانات نمطية أعلى (الشكل 3 و) يمكن تفسير هذه العلاقة تمامًا من خلال زيادة نسبة المكثفات التي تسبب معدلات نمو منخفضة (الشكل S11). ومع ذلك ، في معظم الحالات ، تسبب المكثفات انخفاضًا في معدل النمو ليس شديدًا ، مع 79 ٪ و 95 ٪ من مكثف YKOs التي يزيد معدل نموها عن 0.80 من النوع البري في أحادي الصبغية ومتماثلة اللواقح ثنائية الصبغيات ، على التوالي. في الواقع ، 124 مكثف YKOs لديهم معدل نمو متزايد على النوع البري.

المكثفات المكررة والمفردة لها أنماط مختلفة من التكرار الوظيفي

يشير اكتشاف أن العديد من محاور PPI الأكثر ارتباطًا هي مكررة ولكن ليست مكثفات (الشكل 3 ب) إلى وجود علاقة بين التكرار الوظيفي والتخزين المؤقت. لقد بحثنا في هذا الأمر أكثر عن طريق التساؤل عن كيفية توزيع جينات المكثف بين 1425 نسخة مكررة لا لبس فيها و 2375 مفردة لا لبس فيها تم تحديدها في جينوم الخميرة [39-41]. وجدنا أن جينات المكثف من المرجح أن تكون مفردة أكثر من الجينات غير الأساسية الأخرى (الجدول 1 ، ص & lt 0.026 ، اختبار G). تميل مكثفات الفردي والمكثفات المكررة إلى الإثراء في فئات عمليات GO المختلفة. يتم إثراء المكثفات المفردة في فئات صيانة الحمض النووي وتنظيمه ، والاستجابة للمنبهات ، ونسخ الحمض النووي الريبي وتوطينه (الجدول S3). مكثف مكثف ، على الرغم من أنه غير متجانسة بشكل عام ، تميل إلى أن تكون أكثر إثراء في فئات التمثيل الغذائي للبروتين والبطانة. قمنا بعد ذلك بالتحقيق فيما إذا كانت أحاديات المكثف تختلف عن مكثف مكثف في أي شبكة أو خصائص قابلية الاستغناء. تميل كل من جينات المكثف المضاعفة والمفردة إلى أن يكون لها عدد كبير من SLIs وتسبب انخفاضًا في معدل النمو عند خروجها في الصيغة الصبغية أحادية الصيغة الصبغية أو ثنائية الصبغيات متماثلة اللواقح (الشكل S15). ومع ذلك ، تميل مكثفات المكثفات فقط إلى أن تكون محاور PPI (الشكل 4 أ).

عدد المفردات أو التكرارات في أصناف الجينات المختلفة

(أ) متوسط ​​عدد تفاعلات قياس الطيف الكتلي لالتقاط التقارب لجميع الجينات غير الأساسية (الرمادي) ، وجميع الأحاديات غير الأساسية (الأخضر الفاتح) ، والمكثف الفردي (الأزرق الفاتح) ، وجميع التكرارات غير الأساسية (الأخضر الداكن) ، والمكثفات المكررة (الأزرق الداكن) ).

(B) Ks (يسار) وتشابه التعبير (يمين) بين أزواج مكررة تحتوي على جين أساسي واحد على الأقل (رمادي غامق) ، مكثف واحد على الأقل (أزرق غامق صلب) ، جينات غير أساسية فقط غير مكثف (رمادي فاتح صلب) ، في منتج جيني واحد على الأقل يحتوي على أكثر من 19 PPIs مشروحة في شبكة BioGRID المنسقة بالأدب ومكثف واحد على الأقل (خطوط زرقاء داكنة) ، ومنتج جيني واحد على الأقل يحتوي على أكثر من 19 PPI ولا مكثفات أو جينات أساسية (خطوط رمادية فاتحة).

(C) وفرة mRNA (يسار) ، ووفرة البروتين (وسط) ، ودرجة SLI (يمين) للمكثفات مع نظير واحد فقط في الجينوم (أزرق) ومشابهاتها (أخضر).

(د) الإمكانات المظهرية للمكثفات مع نظير واحد فقط في الجينوم (الأزرق) ، ومشابهاتها (الأخضر) ، وجميع الجينات غير الأساسية (الرمادي). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. ما لم يتم وضع علامة على خلاف ذلك ، ص- القيم هي مقارنة بالمكثفات المكررة ، اختبار Wilcoxon-Mann-Whitney: * ، ص & lt 0.05 ** ، ص & lt 0.001 *** ، ص & lt 1 × 10 −5 **** ، ص & lt 1 × 10 −10.

تقدم النتيجة المذكورة أعلاه تناقضًا واضحًا: ترتبط درجة PPI العالية ارتباطًا وثيقًا بهوية المكثف في التكرارات (الشكل 4 أ) ، لكن العديد من التكرارات شديدة الارتباط ليست مكثفات (الشكل 3 ب). يبدو أن حل هذا التناقض هو أن أزواج مكثفات مكررة أقدم ولديها تكرار وظيفي أقل من الأزواج المكررة المحورية الأخرى. باستخدام معدل الاستبدال المرادف (Ks) بين أعضاء زوج مكرر كتقدير تقريبي لعمر حدث الازدواج [39،42] ، وجدنا أن الأزواج المكررة التي تحتوي على مكثف واحد على الأقل تكون في المتوسط ​​أقل أقدم من الأزواج المكررة التي تحتوي على جين أساسي واحد على الأقل ويبدو أنها أقدم من الأزواج المكررة التي تحتوي فقط على جينات غير أساسية غير مكثفة (الشكل 4 ب). نظرًا لأن معدلات الاستبدال ترتبط سلبًا بمستوى تعبير الجين [43،44] ، فإن أحد التفسيرات للاختلافات في K هو أن التكرارات التي تحتوي على مكثف واحد على الأقل لها توزيع مختلف لمستويات التعبير عن الأزواج المكررة الأخرى. ومع ذلك ، وجدنا أن النمط يستمر حتى عندما نتحكم في مستوى تعبير mRNA (الشكل S16). يبدو أن متوسط ​​فرق العمر بين أزواج مكثفات مكررة وأزواج مكررة غير أساسية يرجع إلى التكرارات الحديثة (Ks & lt 1) ، والتي يوجد منها عدد أقل من أزواج مكثفات مكررة من الأزواج المكررة غير الأساسية (ص & lt 0.002 ، اختبار G ، الشكل S17). تنطبق نفس العلاقة عند مقارنة أزواج المحور المكررة فقط ، والتي حددناها على أنها أزواج مكررة حيث يكون لدى نظير واحد على الأقل درجة PPI ≥ 20. لحساب هذا الاختلاف ، قمنا بفصل أزواج المحور المكرر إلى تلك التي تحتوي على مكثف واحد على الأقل وتلك التي تحتوي على مكثف واحد على الأقل. لاتفعل. متوسط ​​درجة PPI للمنتجات الجينية في هاتين الفئتين هو نفسه تقريبًا (ص = 0.53 ، اختبار Wilcoxon-Mann-Whitney).بمقارنة هاتين الفئتين ، وجدنا أن مكثفات المحور تبدو أقدم في المتوسط ​​بسبب غياب أحداث الازدواجية الأخيرة. يزيد متوسط ​​عمر الأزواج المكررة من المكثفات من احتمالية أن تكون في الغالب من الأنوولوجيات ، وتتبع أصلها إلى ازدواج الجينوم الكامل في الخميرة ∼ 100 مليون سنة مضت [45]. ومع ذلك ، لم نجد أن الأنوولوجيات ممثلة تمثيلا زائدا بين مكثفات مكررة بالنسبة للتكرارات غير المكثفات (ص = 0.47 ، اختبار G). لا يبدو أن الاختلاف الأكبر في الموقع المرادف لأزواج مكثفات مكررة يقابله تباعد أكبر ، كما تم قياسه بواسطة معدل الاستبدال غير المجهول (كا). من أجل هذه المقارنة ، قمنا بتقييد تحليلنا على ohnologs للتحكم في الاختلافات في وقت الازدواجية التي قد تؤدي إلى حدوث أخطاء في Ka / Ks. تحتوي مكثفات ohnologs على قيم Ka التي لا تختلف اختلافًا كبيرًا عن ohnologs غير الأساسية ، بينما تظهر ohnologs الأساسية تباعدًا أكبر بشكل هامشي (الشكل S18).

كان الاختلاف اللافت للنظر بين أزواج مكثفات مكررة وأزواج مكررة أخرى واضحًا في الارتباطات في التعبير بين المتماثلات عبر العديد من الظروف التجريبية [39]. الأزواج المكررة التي تحتوي على مكثف واحد على الأقل لها تشابه تعبير أقل في المتوسط ​​من الأزواج المكررة التي تحتوي على جين أساسي أو أزواج مكررة غير أساسية (الشكل 4 ب). الأزواج المكررة Hub التي تحتوي على مكثف واحد على الأقل لها تشابه تعبير أقل من الأزواج المكررة غير الأساسية الأخرى. تشير هذه النتائج إلى أن أزواج مكثفات مكررة أقل وظيفيًا من الأزواج المكررة الأخرى. لمزيد من تشريح هذا الاختلاف في التعبير المترابط ، قمنا بفحص 64 زوجًا مكثفًا يحتوي على مكثف حيث يكون لكل من الزوجين نظير واحد فقط في الجينوم. من هذه الأزواج ، استبعدنا زوجين حيث تقوم كلتا النسختين بترميز المكثفات (بروتينات الريبوسوم RPL8A و RPL8B و mannotransferases HOC1 و OCH1) وزوجين حيث يتم إقران جين مكثف بجين أساسي (cyclins CDH1 و CDC20 و UDP- فسفوريلاز الجلوكوز YHL012W و UGP1) ، ينتج عنه 60 جينًا مكثفًا مقترنًا بجين غير مكثف غير أساسي. بمقارنة هذه المكثفات الستين فقط بمثيلاتها ، وجدنا أنه من المحتمل أن يكون للمكثف مرنا أعلى ووفرة البروتين من نسخته غير المكثفة (الشكل 4 ج).

ربما بسبب هذه الاختلافات في ملف تعريف التعبير ، يمتلك جين المكثف في المتوسط ​​ما يقرب من ثلاثة أضعاف عدد SLIs مثل نظيره (الشكل 4C). يشير التعبير الأعلى للمكثف في الزوج إلى أنه ربما يكون للمكثف غير المكثف تأثير أيضًا على المتانة ولكن تأثير أصغر لم يتجاوز عتبة تحديد المكثف. ومع ذلك ، فإن paralogs noncapacitor ليس لديها إمكانات النمط الظاهري مرتفعة عند مقارنتها بجميع الجينات غير الأساسية (الشكل 4 د ، ص = 0.38 ، اختبار Wilcoxon-Mann-Whitney). في الواقع ، يشير تحليل الضوضاء في وفرة البروتين [46] إلى أن المتماثلات غير المكثفة قد تكون أهدافًا وليس مصادر للتخزين المؤقت: التكرارات غير الأساسية لها في المتوسط ​​تنوع أكبر في وفرة البروتين من الأحاديات غير الأساسية (ص & lt 2.2 × 10 3 ، اختبار ويلكوكسون مان ويتني الشكل S15). قد يؤدي التكرار الزائد جزئيًا (جين المكثف) إلى منع هذا التباين ، في حين أن حذفه قد يعرض هذا التباين على مستوى النمط الظاهري.

إذا افترض المرء أن التكرار الوظيفي غير المكتمل يتسبب أيضًا في تقلبات نمطية عالية في حالة المكثفات المفردة المحذوفة ، فإن فهم آلية هذه العملية يمثل تحديًا أكبر لأنه لا توجد جينات مرشحة واضحة تتداخل مع الوظيفة المفردة. إحدى الفرضيات هي أن التكرار لا يتحقق على مستوى الجين الفردي كما هو الحال في التكرارات ، بل على مستوى وحدة البروتين. في الواقع ، تعد العديد من المكثفات المفردة جزءًا من وحدات متداخلة وظيفيًا في شبكة تكامل الحمض النووي [25]. لاختبار الفرضية القائلة بأن هذه خاصية أكثر عمومية للمكثفات المفردة ، قمنا بفحص خصائص شبكتها بشكل أكبر. معامل التجميع هو مقياس للتوصيل البيني للشبكة المحلية. تحتوي مكثفات Singleton في المتوسط ​​على معاملات تجميع أعلى في شبكة PPI مقارنة بجميع الأحجام الفردية غير الأساسية ، مما يشير إلى أنها تتفاعل مع مجموعات أكثر تماسكًا من البروتينات التي قد تمثل وحدات وظيفية (الشكل 5 أ). على الرغم من الاتصال المحلي العالي ، تشغل المفردات المكثفة مناصب مركزية أقل في شبكة PPI الإجمالية مقارنةً بالأفراد الفرديين غير الأساسيين ، كما تم قياسها من خلال مركزية بينية (الشكل 5 أ). هذا في تناقض صارخ مع مكثفات مكررة ، والتي تميل إلى أن تكون أكثر مركزية عند مقارنتها بالتكرارات غير الأساسية الأخرى (الشكل S15).


نتائج

موقف السلالات النشوء والتطور

استخدمنا تسلسل الجينوم الكامل لأربع سلالات ، تظهر مستويات مختلفة من تحمل الإيثانول (Arroyo-L & # x00F3pez et al. ، 2010) ، لاستقصاء العلاقة بين الاختلافات الجينية وتحمل الإيثانول. سمح لنا خط أنابيب التجميع والشرح الخاص بنا باستخراج حوالي 6000 تسلسل ترميز لكل جينوم ، منها 2115 تسلسلًا جينيًا متسلسلًا مشتركًا مع 38 سلالة أخرى (الجدول التكميلي S1) ، ممثل لسلالات نقية مختلفة موصوفة لـ S. cerevisiae (Liti et al. ، 2009) ، لإعادة بناء نسالة متعددة المواقع ML (الشكل 1). عند النظر إلى موضع سلالاتنا ، لاحظنا أن Temohaya-MI26 لا يبدو أنه يتجمع داخل أي من المجموعات التي اخترناها ، ويظهر موقعًا مركزيًا في الشجرة. قد تكون هذه السلالة من سكان أمريكيين مختلفين لم يتم اعتبارهم هنا ، مثل السكان الإكوادوريين الموصوفين مؤخرًا (Peter et al. ، 2018). سلالات النبيذ (T73 والاثنان فلور سلالات) متجمعة مع سلالات نبيذ / أوروبية ، ولكن ضمن شقيقتين. وبشكل أكثر تحديدًا ، فإن ملف فلور مجموعة سلالات GBFlor-C و CECT10094 مع EC1118 و T73 في الكليد الآخر الذي يحتوي على سلالات النبيذ. يتوافق موضع EC118 مع النتائج السابقة (Coi et al. ، 2017) التي تصف إجهاد مجموعات EC1118 مع فلور السلالات التي تشكل مجموعة سكانية فرعية بين سلالات النبيذ / الأوروبية. نظرًا لأن EC1118 كان مرتبطًا ارتباطًا وثيقًا بالسلالات عالية التحمل للإيثانول ، وأظهر تحملاً وسيطًا ، فقد استخدمنا البيانات الجينية المنشورة لهذه السلالة لمزيد من التحليل.

شكل 1. نسالة S. cerevisiae سلالات من أصول مختلفة. شجرة احتمالية متعددة البؤرة القصوى من 47 سلالة ممثلة لكتل ​​مختلفة. الأصفر: آسيوي / ساكي ، أخضر: أمريكي / بلوط ، بني: غرب أفريقي ، برتقالي: ماليزي ، أزرق: نبيذ / أوروبي ، أحمر: مختبر. يمكن العثور على مراجع السلالة في الجدول التكميلي S1.

تختلف مستويات تغاير الزيجوت بين السلالات

تواتر التكاثر الجنسي والتهجين في S. cerevisiae له تأثير كبير على مستويات تغاير الزيجوت ، مما قد يشير إلى اختلافات في نمط الحياة بين السلالات. قمنا بتقييم مستويات تغاير الزيجوت هنا بحساب عدد المواضع المتغايرة الزيجوت في مناطق الترميز للسلالات المدروسة. تم العثور على اختلافات عالية بين السلالات (الجدول التكميلي S2). يحتوي Temohaya-MI26 على أقل تغاير الزيجوت مع 2433 موضعًا غير متجانسة في الجينوم. يحتوي T73 و GBFlor-C على 4586 و 3094 موقعًا متغاير الزيجوت ، على التوالي. ومع ذلك ، فإن EC1118 و CECT10094 لهما أعلى مستويات تغاير الزيجوت مع 12983 و 13789 تعدد الزيجوت متغاير الزيجوت في الجينوم ، على التوالي ، والتي تمثل متوسط ​​تعدد تعدد الأشكال لكل جين في جينوماتهم. ومن المثير للاهتمام ، أنه لا توجد علاقة بين تحمل الإيثانول والاختلافات في تغاير الزيجوت.

بشكل عام ، كانت SNPs متغايرة الزيجوت موجودة بشكل موحد على طول الجينوم ، على الرغم من ملاحظة العديد من أحداث فقدان الزيجوت غير المتجانسة (LOH) (الشكل 2 والشكل التكميلي S1). أثرت هذه الأحداث على أجزاء كبيرة من الكروموسوم ، بما في ذلك في الغالب نهايات الكروموسوم.

الشكل 2. بنية الجينوم للسلالات. اللوحة اليسرى: ترددات SNP على طول الجينوم. يُظهر توزيع التردد الأشكال المختلفة واختلال الصيغة الصبغية الموجودة. اللوحة اليمنى: اقرأ العمق بواسطة الكروموسومات ، تم تنعيمها بالمتوسط ​​في نوافذ 10 كيلو بايت ، لتأكيد اختلال الصيغة الصبغية للكروموسوم الثالث في كل من GBFlor-C و CECT10094 وتثلث الصبغي XII في CECT10094.

لتحديد الجينات المحتملة المشاركة في تحمل الإيثانول ، قمنا بفحص تعدد الأشكال غير المترادفة الثابتة فقط في كل من السلالات شديدة التحمل للإيثانول CECT10094 و GBFlor-C. بسبب تغاير الزيجوت والعلاقة التطورية التي تتمتع بها هذه السلالات مع EC1118 ، تم إصلاح سبعة تغييرات فقط في الأحماض الأمينية وحصرية لكلتا السلالتين (الجدول 1). توجد هذه في بروتينات مشفرة بستة جينات: كوز 1, GCY1, RPN7, كار 3, DPB2 ، و ATG13. فيما عدا كوز 1 و GCY1 ، كانت هذه الجينات موجودة على الذراع اليمنى للكروموسوم السادس عشر ، والتي تأثرت بحدث LOH المشترك بين CECT10094 و GBFlor-C. ومن المثير للاهتمام، كوز 1 و RPN7 هما جينان مرتبطان بمسارات اليوبيكويتين والبروتوزوم ، وهما عمليتان مهمتان في الحفاظ على توازن البروتين وتحلل البروتينات غير المطوية. يمكن أن ترتبط كلتا العمليتين بوجود اختلالات في الصيغة الصبغية في السلالات المدروسة وتحملها للإيثانول ، كما هو موضح أدناه.

الجدول 1. الجينات المتأثرة بالتغييرات غير المترادفة باستثناء CECT10094 و GBFlor-C.

تشترك السلالات شديدة التحمل في الكروموسوم الثالث في اختلال الصيغة الصبغية

معظم سلالات S. cerevisiae هي ثنائية الصبغيات ، ولكن ثبت أن السلالات الصناعية ، المرتبطة بالبيئات ذات الصلة بالإنسان ، تقدم مستويات مختلفة من الصبغيات (Gallone et al. ، 2016 Peter et al. ، 2018). قمنا بتقييم سلالاتنا & # x2019 ploidy عن طريق قياس التدفق الخلوي ، ووجدنا أن T73 و CECT10094 و EC1118 و Temohaya-MI26 كانت ثنائية الصبغيات. كان متوسط ​​القياس الخلوي لثلاث نسخ مقارنة مع ثنائي الصبغة معروف على التوالي: 2.117 & # x00B1 0.029 ، 2.200 & # x00B1 0.030 ، 2.196 & # x00B1 0.029 ، 2.218 & # x00B1 0.027 (الجدول التكميلي S3). على النقيض من ذلك ، تم العثور على GBFlor-C ليكون سلالة ثلاثية الصبغيات (3.510 & # x00B1 0.055) (الجدول التكميلي S3).

طريقة أخرى لتأكيد حالة ploidy هي استخدام توزيع تردد SNP متغاير الزيجوت على طول الجينوم (الشكل 2 ، اللوحة اليسرى). أظهرت السلالات ثنائية الصبغيات وغير المتجانسة توزيع تردد SNP حوالي 0.5 ، مما يؤكد حالتها ثنائية الصيغة الصبغية. بنفس الطريقة ، أظهر GBFlor-C ، وهو ثلاثي الصبغيات ، توزيع تردد SNP نموذجي حول 0.33 و 0.66. نظرًا لأن Temohaya-MI26 متماثل الزيجوت تمامًا ، لم يكن من الممكن تأكيد حالته المتجانسة بهذه الطريقة.

يمكن أن يكون الدافع وراء التكيف السريع مع البيئة المجهدة هو إعادة ترتيب الجينوم على نطاق واسع. من بين هؤلاء ، تحظى اختلالات الصيغة الصبغية باهتمام كبير كمحرك محتمل للتكيف مع الأهمية الصناعية في S. cerevisiae (جورتر دي فريس وآخرون ، 2017). لقد تحققنا من وجود اختلال الصيغة الصبغية بطريقتين: التغييرات في عمق القراءة بين الكروموسومات والتغيرات في تواتر تعدد الأشكال متغاير الزيجوت مقارنةً بالتوزيع العام لتردد الجينوم (الشكل 2). ومن المثير للاهتمام ، أن أعلى السلالات التي تتحمل الإيثانول ، CECT10094 و GBFlor-C كانت عبارة عن اختلال في الصيغة الصبغية. كان لدى CECT10094 نسخة إضافية من الكروموسومات XII و III ، وأظهر GBFlor-C أيضًا نسخة إضافية من الكروموسوم الثالث. نظرًا لأنه تمت مشاركة شلل الكروموسوم الثالث بين هاتين السلالتين في خلفيات بلاويد مختلفة ، فقد بحثنا بشكل أكبر إذا كان هذا يمكن أن يكون ذا أهمية لشرح تحمل الإيثانول العالي.

يزيد التعبير عن الكروموسوم الثالث مع إجهاد الإيثانول

يرتبط عدد أكبر من نسخ الكروموسوم بتعبير أعلى عن الجينات في هذا الكروموسوم (توريس وآخرون ، 2007). سألنا عما إذا كان التعبير الأعلى للكروموسوم الثالث في هذه الحالة يمكن أن يكون مرتبطًا بتسامح الإيثانول. استخدمنا بيانات النسخ من دراسة سابقة (Navarro-Tapia et al. ، 2016) لإلقاء الضوء على أهمية تعبير الكروموسومات في تحمل الإيثانول. باختصار ، تم اختيار السلالة ذات الحد الأدنى والأعلى لتحمل الإيثانول لمجموعة من السلالات من مصادر عزل متنوعة (Temohaya-MI26 و CECT10094 ، على التوالي) وتم استخراج الحمض النووي الريبي الخاص بهم بعد 1 أو 10 ساعات من النمو في حالتين: بعد 10٪ إيثانول صدمة أو بدون إجهاد. تم تجميع الجينات حسب الكروموسومات لإظهار المساهمة العالمية لهذه الجينات في ملف تعريف التعبير للظروف المختلفة (الشكل 3). كانت مساهمة كل كروموسوم في النسخة الكاملة لكل سلالة مختلفة ولكننا ركزنا هنا على الكروموسوم الثالث بسبب اختلال الصيغة الصبغية في السلالات شديدة التحمل للإيثانول. بدون إجهاد الإيثانول ، أظهر الكروموسوم الثالث تعبيرًا أعلى بشكل ملحوظ عند 1 ساعة من النمو مقارنة بالكروموسومات الأخرى في CECT10094 ولكن ليس في Temohaya-MI26. في 10 ساعات من النمو ، يتم تنظيم التعبير العالمي للكروموسوم الثالث في كلا السلالتين وفي كل من ظروف النمو. بعد ساعة واحدة من إجهاد الإيثانول ، يتم تنظيم الكروموسوم الثالث بشكل كبير في كل من Temohaya-MI26 و CECT10094. في Temohaya-MI26 ، يعتبر الكروموسوم الثالث هو الكروموسوم الأكثر إفراطًا في التعبير في الجينوم بعد التعرض القصير للإيثانول. وبالتالي ، يمكن أن يكون نمط التعبير الذي لوحظ هنا مرتبطًا بتعبير أعلى في CECT10094 بسبب عدم توازن الصبغيات. علاوة على ذلك ، فإن التغيير في مساهمة التعبير عن الكروموسوم الثالث في Temohaya-MI26 بعد صدمة الإيثانول يتوافق مع وجود العديد من الجينات في الكروموسوم الذي يساهم في استجابة إجهاد الإيثانول ، حتى في السلالة المنخفضة التي تتحمل الإيثانول.

الشكل 3. استجابة نسخية للإيثانول على مستوى الكروموسومات. (أ) تغيير أضعاف التعبير لـ CECT10094 مقارنةً بالمسبح عند نمو 1 و 10 ساعات مع إجهاد إيثانول 0 و 10٪. (ب) تغيير أضعاف التعبير عن Temohaya-MI26. اختبار الإحصاء Wilcoxon بين جميع المجموعات: ns: ص > 0.05 ، & # x2217 ص & # x003C 0.05 ، & # x2217 & # x2217 ص & # x003C 0.01 ، & # x2217 & # x2217 & # x2217 ص & # x003C 0.001 ، & # x2217 & # x2217 & # x2217 & # x2217 ص & # x003C 0.0001. يتم تلوين رموز الأهمية باللون الأحمر إذا كان الكروموسوم منظمًا ولون الأزرق إذا كان غير منظم.

يؤثر اختلال الصيغة الصبغية للكروموسوم الثالث على نمو الإيثانول في خلفيات مختلفة

أظهرت العديد من الدراسات أن اختلال الصيغة الصبغية يمكن أن يكون ذا أهمية في ظروف معينة (Gorter de Vries et al. ، 2017). على وجه الخصوص ، ارتبط تباين رقم نسخة الكروموسوم الثالث بتحمل أعلى للحرارة (Yona et al. ، 2012) وتم تكراره في تجارب التكيف مع الإيثانول (Voordeckers et al. ، 2015). في دراسة حديثة (Peter et al. ، 2018) ، أكثر من 1000 S. cerevisiae تم تسلسل السلالات وتنميطها ظاهريا في عدة ظروف. استخدمنا هنا النمط الظاهري على إجهاد الإيثانول بنسبة 15 ٪ ومعلومات البلويدية واختلاف الصيغة الصبغية ، وقمنا بتجميع السلالات للبحث عن الاختلافات في تحمل إجهاد الإيثانول في مجموعة خلفية وراثية أوسع (الشكل 4 والشكل التكميلي S2). لم تُظهر معظم أعداد نسخ الكروموسومات والكروموسوم اختلافات كثيرة مقارنة بالسلالات ثنائية الصبغيات التي تظهر كلاً من euploidy مثاليًا. نظرًا لأن المجموعات ذات أحجام مختلفة والعديد من العوامل تشارك في تحمل الإيثانول ، فمن الصعب رؤية الاختلافات. ومع ذلك ، أظهر عدد نسخ الكروموسوم الثالث في ثنائي الصبغيات اتجاهًا محددًا (الشكل 4). كانت السلالات التي تفتقر إلى إحدى نسخ الكروموسومات أسوأ بكثير من السلالات ثنائية الصبغيات التي تنمو على 15 ٪ من الإيثانول فيما يتعلق بحالة التحكم. كلما زاد عدد نسخ الكروموسوم الثالث ، زاد معدل النمو النسبي المعروض. كانت السلالات التي تحتوي على نسخة إضافية أفضل من سلالات euploids بنسختين ، وهذه أفضل من السلالات أحادية الذرة ، مع كروموسوم واحد واحد III.

الشكل 4. معدل النمو النسبي 1011 سلالة على 15٪ إيثانول. معدل النمو النسبي هو النسبة بين نمو الضغط على YPD عند 30 & # x00B0C والنمو على الإيثانول بنسبة 15 ٪. يتم تجميع السلالات حسب بلاديها ووجود اختلالات مختلفة في الصيغة الصبغية. في هذا الشكل ، يتم تقديم ثنائي الصبغيات فقط ، ويتم عرض جميع الأشكال الأخرى في الشكل التكميلي 2. يحتوي Chr III +1 و Chr III +2 و Chr III-1 الموسوم على نسخة إضافية ونسختين إضافيتين ونسخة واحدة أقل من الكروموسوم الثالث ، على التوالي ، ويمكن أن تظهر اختلال الصيغة الصبغية الأخرى. & # x201COther Aneuploidies & # x201D group هي سلالات لها نوع مختلف من اختلال الصيغة الصبغية ولكن ليس على الكروموسوم الثالث ، و & # x201CEuploids & # x201D ليس لها اختلال في الصيغة الصبغية. الأهمية هي ويلكوكسون مقترنًا بسلالات ثنائية الصبغيات كمرجع (ns: ص > 0.05 ، & # x2217 ص & # x003C 0.05 ، & # x2217 & # x2217 ص & # x003C 0.01 ، & # x2217 & # x2217 & # x2217 ص & # x003C 0.001 ، & # x2217 & # x2217 & # x2217 & # x2217 ص & # x003C 0.0001). تم الحصول على البيانات الأصلية من Peter et al. (2018).

تؤثر إزالة النسخة الإضافية من الكروموسوم 3 بشدة على تحمل الإيثانول

للتأكد من أن اختلال الصيغة الصبغية على الكروموسوم الثالث قد أثر بشكل مباشر على تحمل الإيثانول للسلالات ، أزلنا النسخة الإضافية من الجينوم (انظر قسم المواد والطرق) ، وأعيد السلالات إلى حالة euploid. لسوء الحظ ، لم نتمكن من الحصول على أي سلالة معدلة من CECT10094 و GBFlor-C مع النهج التجريبي المستخدم. لذلك استخدمنا سلالة متطورة في المختبر (2-200-2) حصلنا عليها بواسطة Voordeckers et al. (2015). طور هؤلاء المؤلفون ستة بدائية ، متجانسة المنشأ S. cerevisiae سلالات مختلفة من ploidy (1n ، 2n ، و 4 n) ، تم إنشاؤها جميعًا من سلالات FY5 المشتقة من S288C أحادية الصيغة الصبغية ، في مواد كيميائية مع زيادة تركيزات الإيثانول (تصل إلى 12٪) خلال 200 جيل. أظهرت الخطوط أحادية الصيغة الصبغية ورباعية الصيغة الصبغية تقاربًا سريعًا نحو حالة ثنائية الصبغيات ، وفي نهاية التجربة ، كانت جميع الحيوانات المستنسخة المتطورة شديدة التحمل للإيثانول ، وشارك معظمها في الحصول على نسخة إضافية من الكروموسوم الثالث ، على الرغم من اختلالات الصبغيات الأخرى المحددة. كانت موجودة أيضًا في بعض الحيوانات المستنسخة. الاستنساخ المتطور 2-200-2 هو ثنائي الصبغة مشتق من الكروموسوم مع تثلث الصبغي الثالث. نظرًا لأن هذا الاستنساخ المعملي المتطور شارك هذه الميزة الجينومية مع فلور سلالات ، تم استخدامه في تجربة لاختبار ما إذا كان قد تم عكس تحمل الإيثانول بعد إزالة نسخة الكروموسوم الثالث الإضافية ، باستخدام تكامل علامة الاختيار / الاختيار المضاد.

حددنا أولاً رقم نسخة الكروموسوم الثالث في السلالة 2-200-2 والسلالة المعدلة 2-200-2-S4 بواسطة qPCR لتأكيد إزالة النسخة الإضافية. استخدمنا بادئات لثلاثة جينات منتشرة على طول الكروموسوم وقارننا جرعة الكروموسوم باستخدام الجينات المرجعية قانون 1 و YFR057W من الكروموسوم السادس. أظهرت النتائج أن 2-200-2-S4 فقد نسخة إضافية من الكروموسوم الثالث لكل واحد من الجينات المختبرة مما أدى إلى رقم نسخة جينية قريبة من 2 (1.99 & # x00B1 0.31 لـ ARE1، 2.14 & # x00B1 0.28 من أجل YCL001W-A و 2.06 & # x00B1 0.20 من أجل POF1).

بعد إزالة النسخة الإضافية من الكروموسوم III ، اختبرنا نمو السلالات 2-200-2 و2-200-2-S4 على GPY بتركيزات إيثانول مختلفة (الشكل 5). السلالة 2-200-2 ، التي تحتوي على ثلاث نسخ من الكروموسوم الثالث ، كانت قادرة على النمو حتى في تركيز الإيثانول بنسبة 14٪. 2-200-2-S4 ، التي تمت إزالة نسخة إضافية من الكروموسوم الثالث ، لم تكن قادرة على النمو على وسط إيثانول بنسبة 10٪.

الشكل 5. إزالة اختلال الصيغة الصبغية على الكروموسوم الثالث يقلل من تحمل الإيثانول. مقايسات اختبار السقوط للسلالات 2-200-2 و2-200-2-S4 في ألواح الإيثانول.تم تحضين اللوحات لمدة 10 أيام عند 28 & # x00B0C. 2-200-2 ثلاث نسخ من الكروموسوم الثالث و2-200-2-S4 من نسختين. تؤثر إزالة اختلال الصيغة الصبغية على تحمل الإيثانول.


شكر وتقدير

نشكر Stefania Kapsetaki و Guy Cooper و Jacobus Boomsma واثنين من المراجعين المجهولين للتعليق.

قائمة المصطلحات

عندما تكون عدة خلايا فردية على اتصال. وهذا يشمل الخلايا التي تلتصق ببعضها البعض بشكل عابر من خلال إنتاج مادة لزجة ، ومجموعات منسقة من الخلايا تظهر سلوكيات تعاونية مثل إنتاج السلع العامة ، ومجموعات ملزمة من الخلايا تشكل كائنات متعددة الخلايا كما نراها في الحيوانات والنباتات.

عندما تكون الخلايا الفردية بشكل إلزامي جزءًا من جسم متعدد الخلايا ، ولا يمكنها البقاء والتكاثر خارج الجسم متعدد الخلايا. يتم تحديد التعددية الخلوية الملزمة من الناحية التنموية ، وليس استجابة للظروف البيئية.

عندما تصبح الخلايا الفردية جزءًا من جسم متعدد الخلايا استجابة للظروف البيئية ، ثم يمكن أن تعود إلى كونها أحادية الخلية مرة أخرى. لا تعتمد على كونها متعددة الخلايا من أجل البقاء والتكاثر. تشمل التعددية الخلوية الاختيارية كلا الشكلين البسيطين ، حيث تلتصق الخلايا ببعضها البعض لتشكيل كتلة (على سبيل المثال بعض الأغشية الحيوية البكتيرية) إلى أشكال أكثر تعقيدًا مع خلايا متمايزة (مثل قوالب الوحل والأهداب).

يحدث تحول تطوري رئيسي في الفردية عندما تتعاون الوحدات الفردية (مثل الجينات أو الخلايا أو الأفراد) وتشكل فردًا جديدًا أكثر تعقيدًا ، والذي لا يمكن أن يتكاثر بعد ذلك إلا ككل.

نوع إلزامي متعدد الخلايا شهد تحولًا تطوريًا رئيسيًا في الفردية.


تنظيم التمثيل الغذائي الثانوي

كحول فوسل

الكحولات الفوسل هي أكثر المكونات المتطايرة وفرة التي يتم إنتاجها أثناء التخمير وتساهم في الروائح والنكهات الأساسية في المشروبات والأطعمة المخمرة (Hazelwood et al. 2008). تشتمل كحول الفوسل على بروبانول ، كحول أيزو أميل ، أيزوبيوتانول ، كحول أميل نشط ، 2-فينيل إيثانول ، وتيروسول (Swiegers and Pretorius 2005). تتشكل كحول فوسل من خلال مسار إيرليش أو عن طريق التمثيل الغذائي للكربون المركزي (الشكل 2 أ). الخطوة الأولى في مسار إيرليش هي تفاعل انتقال بين حمض أميني و 2 أوكسوجلوتارات (سينتشانموجاناثان 1960). تقوم خطوة التحويل بتحويل الحمض الأميني إلى حمض ألفا كيتو ، والذي يمكن أيضًا توفيره عن طريق التمثيل الغذائي للكربون المركزي (Sentheshanmuganathan 1960). بعد ذلك ، تحفز أزمات الكربوكسيل المتعددة من البيروفات تحويل حمض α-keto إلى ألدهيد متفرع السلسلة (Sentheshanmuganathan 1960). أخيرًا ، يحفز نازعة الهيدروجين الكحولي الخطوة النهائية المعتمدة على NADH التي تقلل الألدهيد إلى كحول فيوزيل (الشكل 2 أ) (Hazelwood et al. 2008). ليست كل الإنزيمات المشاركة في تحفيز هذا المسار معروفة. تتمثل إحدى الصعوبات في توضيح بروتينات معينة ضرورية لإنتاج كحول fusel في درجة كبيرة من التكرار في جينوم الخميرة. يفرض وجود العديد من جينات نازعة الأمين ، ديكاربوكسيلاز ، وكحول ديهيدروجينيز تحديات في الأساليب الجينية التقليدية لدراسة إنتاج fusel.

المسارات الأيضية التي تؤدي إلى تكوين مركبات عطرية (Carrau et al.2005) التي ينتجها خميرة الخميرة أثناء التخمير. (أ) مسار الكحول fusel (عبر مسار إيرليش) يحول حمض أميني إلى كحول في خطوات متعددة. تشمل الأحماض الأمينية في هذا المسار ليسين (L) ، فالين (V) ، إيزولوسين (I) ، فينيل ألانين (F) ، التيروزين (Y) ، وتريبتوفان (W). (ب, ج) يتطلب تكوين الإسترات الكحول. يمكن أن يكون الكحول إما إيثانول أو كحول فوسل. (ب) مسار استر الأسيتات. (ج) مسار تخليق الإيثيل إستر. (د) في تخليق monoterpenes في الجسم الحي من خلال مسار الميفالونات. الصناديق الحمراء: مركبات عطرية متطايرة.

يمكن أن يكون للكحول الفوسل تأثيرات حسية إيجابية أو سلبية ، اعتمادًا على تركيزها. قد ينتج عن تركيزات كحول فوسل البالغة 400 ملجم / لتر أو أكثر رائحة نفاذة شبيهة بالمذيبات في النبيذ ، في حين أن التركيزات التي تقل عن 300 ملجم / لتر غالبًا ما توصف بأنها تضفي خاصية الفواكه المرغوبة (Swiegers and Pretorius 2005). في عصير التفاح ، تعتبر التركيزات العالية من كحول الفيوزل ، وخاصة 2-فينيل إيثانول ، مساهمين مهمين في نكهة عصير التفاح النموذجية (Beech 1972). يوصف البروبانول والبيوتانول والإيزوبوتانول برائحة كحولية ، بينما يوصف كحول الأميل النشط وكحول الأيزو أميل بأن لهما رائحة شبيهة بالمرزبانية أو رائحة الموز (Lambrechts and Pretorius 2000). يعطي Tyrosol و 2-phenylethanol روائح شبيهة بالعسل والزهور ، على التوالي (Lambrechts و Pretorius 2000). في التركيزات المناسبة ، تضفي الكحولات fusel تعقيدًا مفيدًا وتعمل أيضًا كسلائف لتشكيل إسترات الأسيتات.

أسيتات وإيثيل إسترات

تساهم الإسترات في خصائص الأزهار والفواكه المرتبطة بالنبيذ والبيرة وتتولد عن طريق أسترة الكحول والأحماض عند درجة حموضة منخفضة (Saerens et al. 2010). يتطلب التفاعل جزيء كحول ، أسيتيل- CoA ، إنزيم توليف استر ، وثلاثي فوسفات الأدينوزين (ATP الشكل 2B و 2 C) (Saerens et al. 2010). يتم تنظيم كل من إنتاج وتدهور الإسترات بإحكام.

نوعان الإستر المنتجان أثناء التخمير هما أسيتات وإسترات إيثيل. استرات خلات ناتجة عن أسترة الأسيتيل- CoA وكحول (الشكل 2 ب). تشتمل هذه الأسيتات على أسيتات إيثيل ، وخلات أيزو أميل ، وخلات 2 ميثيل بيوتيل ، وخلات فينيل إيثيل ، ويتم وصفها على أنها تحتوي على الموز والتفاح والفاكهة والحلاوة العطرية ، على التوالي (Saerens et al. 2010). يعتبر أسيتات الإيثيل أكثر إستر الأسيتات شيوعًا في عمليات التخمير ، ويرجع ذلك أساسًا إلى الكميات الكبيرة من الإيثانول في عمليات التمثيل الغذائي هذه والطبيعة الأكثر تفاعلية للكحولات الأولية (Saerens et al. 2010).

يتم التحكم في تنظيم إنتاج إستر الأسيتات بشكل أساسي من خلال التعبير عن اثنين من ترانسازات أسيتيل الكحول (AATase) ، Atf1p و Atf2p (الشكل 2B) (Yoshimoto et al. 1998). Atf1p لديه أكبر نشاط AATase يقدم نسخًا متعددة من ATF1 في السلالات المختبرية يؤدي إلى زيادة إنتاج إسترات الأسيتات (Verstrepen et al. 2003). في المقابل ، يؤدي حذف Atf1p إلى تقليل تركيز إستر الأسيتات بشكل كبير (Verstrepen et al. 2003). يعتمد إنتاج إسترات الأسيتات أيضًا على الركيزة ، حيث يعتمد على توفر الكحوليات المنصهرة (Lilly et al.2006).

تتكون المجموعة الثانية ، استرات الإيثيل ، من الإيثانول وحمض دهني متوسط ​​السلسلة (MCFA) (الشكل 2 ج) (Saerens et al. 2010). تشمل إسترات الإيثيل إيثيل البوتانوات ، وإيثيل هيكسانوات ، وإيثيل أوكتانوات ، وإيثيل ديكانوات (Saerens et al. 2010). تختلف استرات الإيثيل هذه في سماتها الحسية ، لكن الأوصاف تشمل التفاح والفواكه والفراولة والكمثرى واليانسون (Saerens et al. 2010). خلال مرحلة النمو الأسي المتأخر ، يتم إطلاق وسيطة MCFA قبل الأوان من مركب سينثاز الأحماض الدهنية السيتوبلازمية (FAS) ، وهذا الإصدار يؤدي إلى تخليق الإستر (Taylor and Kirsop 1977). يتم تنشيط MCFAs بواسطة الإنزيم المساعد A ويتم استراتها بالتزامن مع ATP والإيثانول والإنزيمات (الشكل 2C) (Saerens et al. 2010).

تشير الأدلة التجريبية إلى ثلاثة مسارات تنظيمية مسؤولة عن إطلاق MCFAs والإنتاج اللاحق لإسترات الإيثيل: (1) انخفاض نشاط acetyl-CoA carboxylase (2) تنظيم جينات التخليق الحيوي للأحماض الدهنية FAS1 ، FAS2 ، EEB1، و EHT1 و (3) تركيزات MCFAs (Saerens et al. 2006 ، Dufour et al. 2008). يؤدي تثبيط أسيتيل CoA carboxylase إلى إطلاق MCFAs من مجمع FAS (Dufour et al.2008). حذف EEB1 و EHT1 يقلل من إنتاج استرات الإيثيل ، ومع ذلك ، فإن الإفراط في التعبير عن كلا الإنزيمين لا يؤدي إلى زيادة في هذه الإسترات (Saerens et al.2006). هناك العديد من الجينات المتورطة في إنتاج وتحلل الإسترات ، ومع ذلك ، لم يتم بعد تحديد الروابط المباشرة بين السلائف ، ونشاط الإنزيم ، وتركيز الركيزة ، وإنتاج الإستر ، لا سيما بالنسبة لإسترات الإيثيل.

كاربونيل: ثنائي أسيتيل

يوصف ثنائي الأسيتيل بأنه يحتوي على رائحة دافئة ، ورائحة الحلوى ، والجوز ، ولكن بتركيزات عالية ، تنبعث منه رائحة الزبدة الفاسدة (Swiegers and Pretorius 2005). قد تصنع خلايا الخميرة ثنائي الأسيتيل أثناء التخمير في النبيذ ، ومع ذلك ، ينتج ثنائي الأسيتيل في الغالب عن طريق بكتيريا حمض اللاكتيك (Laurent et al. 1994). يتكون ثنائي الأسيتيل خارج الخلية عن طريق نزع الكربوكسيل الذي يحركه كيميائيًا لمادة ألفا أسيتولاكتات. يتم تصنيع α-Acetolactate كوسيط في مسار 2-ketoisovalerate أو يتم إنتاجه من acetaldehyde بواسطة Ilv2p (الشكل 1) (Suomalainen and Ronkainen 1968). يتم تحويل ثنائي الأسيتيل بعد ذلك إلى أسيتوين ، متبوعًا بتحويل الأسيتوين إلى 2،3-بيوتانيديول ، وكلاهما لهما عتبة حسية أعلى وبالتالي تأثير حسي أقل (Swiegers and Pretorius 2005).

مركبات الكبريت

المركبات المحتوية على الكبريت لها عتبة اكتشاف حسية منخفضة للغاية وغالبًا ما توصف بأنها تحتوي على ملفوف أو بيضة فاسدة أو رائحة بصل (Rauhut 1993). هناك خمس فئات من مركبات الكبريت: الكبريتيدات ، polysulfides ، thiols ، thioesters ، والمركبات الحلقية غير المتجانسة (Rauhut 1993). تنشأ مركبات الكبريت العطرية من مبيدات الفطريات المحتوية على الكبريت أو من تحلل الأحماض الأمينية المحتوية على الكبريت أثناء التخمير ، ومع ذلك ، لم يتم توضيح المسارات المسؤولة عن هذه العمليات بشكل كامل (Rauhut 1993).

كبريتيد الهيدروجين (H2S) في أحد نواتج الكبريت الأولية التي يتم إنتاجها أثناء التخمير بواسطة مسار تسلسل اختزال الكبريتات. في هذا المسار ، يتم أخذ الكبريتات من الوسط الخارجي عبر نفاذية الكبريتات (Sul1p أو Sul2p) وتختزل إلى كبريتيد ثم إلى كبريتيد عبر Met5p و Met10p ، على التوالي (Rauhut 1993 ، Spiropoulos و Bisson 2000). في وجود تركيزات غير محدودة من السيستين أو الميثيونين ، يتحد الكبريتيد مع ا-اسيتيل سيرين أو ا- أسيتيل هوموسرين لتشكيل الهوموسيستين (Swiegers and Pretorius 2005). تحت ظروف ميثيونين وسيستين محدودة ، ا-اسيتيل سيرين و ا- أسيتيل هوموسرين محدود أيضًا ، مما يؤدي إلى زيادة الكبريتيد التي يتم تحويلها إلى H22S (Thomas and Surdin-Kerjan 1997).

يمكن أن يؤثر الاستخدام الزراعي للكبريت العنصري ونقص البانتوثينات والتركيزات العالية من ثريونين أيضًا على H2إنتاج S أثناء التخمير (Spiropoulos and Bisson 2000). كبريتيد الهيدروجين شديد التفاعل ، وغالبًا ما ينتج عنه ملاحظات إضافية في النبيذ. واحدة من أكثر الأوراق النقدية شيوعًا التي يتم إنتاجها كنتيجة لـ H.2تفاعل S هو إيثانثيول ، والذي يتشكل عندما H2يتفاعل S مع الإيثانول (Spiropoulos و Bisson 2000). يمكن إزالة كبريتيد الهيدروجين من النبيذ عن طريق تجريد النحاس أو تهوية النيتروجين ، ولكن هذه العلاجات قد تزيل أيضًا مركبات عطرية قيّمة (Swiegers and Pretorius 2005).

على عكس مركبات الكبريت الأخرى ، فإن الثيول المتطاير له خصائص رائحة مفيدة. توصف روائح الثيول المتطايرة بأنها خشب البقس أو فاكهة العاطفة أو الكشمش الأسود أو الجريب فروت (Tominaga et al.1998). غالبا ما تكون هذه المركبات س-السيستين- أو الجلوتاثيون المرتبط بالعنب أو القفزات ويتم إطلاقه أثناء التخمير (Tominaga et al.1998). يشق Irc7p و Str3p رابطة الكربون والكبريت بين السيستين والثيول لتحرير الرائحة (الشكل 1) (Tominaga et al. 1998).

أكثر ثلاثة أنواع من الثيول المتطايرة تأثيرًا هي 4-مركابتو-4-ميثيل بنتان-2-واحد (4MMP) ، و 3-مركابتوهكسان-1-أول (3MH) ، و 3-مركابتوهيكسيل أسيتات (3MHA). هارش وآخرون (2013) حدد (E) -2-hexenal والكحول المقابل له ، (E) -2-hexen-1-ol ، كسلائف لتشكيل 3MH (Harsch et al. 2013). أنشأ هذا العمل إمكانية تعزيز 3MH و 3 MHA في وجود مانح الكبريت و (E) -2-hexenal و (E) -2-hexen-1-ol ، مما فتح الباب أمام إمكانية استخدام الخميرة لتعزيز الإنتاج من رائحة الثيول الإيجابية (الشكل 3) (Harsch et al. 2013).

المسار المتوقع المؤدي إلى إنتاج رائحة ثيول 3-مركابتوهكسان -1-أول (3-ماه) و 3-مركابتوهيكسيل أسيتات (3-مها) (مقتبس من Harsch et al. 2013). عندما السلائف ستة الكربون (C6) ، (E) -عبر-2-هيكسين-1-رأ و (ه) -عبر-2-hexanal له نسبة نسبية أكبر من واحد ومانح الكبريت موجود ، التفاعل مدفوع لإنتاج 3-MH و 3-MHA. عندما يبدأ التخمير ، تطلق خلايا الخميرة رائحة ثيول 3-MH acetylation من 3-MH ينتج عنه 3-MHA.

تربينويدس

التربينويدات هي فئة من المركبات العطرية التي تحدد الخصائص المتنوعة في الفاكهة والقفزات ، وتنتج روائح توصف بأنها الورد ، وإبرة الراعي ، والزهور (Swiegers and Pretorius 2005). تعتبر التربينويدات من مكونات النكهة الأساسية في العديد من المنتجات التجارية ، بما في ذلك النبيذ والبيرة والمضافات الغذائية والعطور ومستحضرات التجميل. يعد تحسين إنتاج التربينات المتطايرة أثناء تخمير الخميرة هدفًا رئيسيًا في التخمير الصناعي.

يتم إنتاج Monoterpenoids بواسطة سلف جيرانيول بيروفوسفات (GPP) في النباتات وبعض الفطريات (King and Richard Dickinson 2000). كرمة العنب الاوروبي (العنب) و حمال الذئبة (القفزات) تقوم بتجميع أحاديات التربينويدات مثل جيرانيول ولينالول ونيرول وسيترونيلول (Swiegers and Pretorius 2005). تم العثور على Terpenoids في كل من الأشكال الحرة والمقيدة ، مع كون الشكل المرتبط أكثر انتشارًا (Swiegers and Pretorius 2005). تطلق إنزيمات الخميرة جليكوزيداز هذه المركبات العطرية وتتطاير أثناء التخمير (الشكل 1) (Gunata وآخرون ، 1988).

إن الإطلاق الأنزيمي للمونوتربين هو عملية من خطوة واحدة أو خطوتين ، اعتمادًا على السكر المرتبط بالسلائف الجلوكوزيد (أي ، أحادي أو ثنائي السكاريد) (Gunata et al. 1988). بالنسبة لجليكوسيدات السكاريد ، تتضمن الخطوة الأولى إطلاق السكر النهائي عبر أرابينوفورانوسيداز ، أو رهامنوبرانوسيداز ، أو أبيوفورانوسيداز ، متبوعًا بانقسام بيتا جلوكوزيداز الذي يطلق مادة التربينويد (جوناتا وآخرون ، 1988). تنتج سلالات النبيذ التي تفرط في التعبير عن بروتين جدار الخلية Exg1p مستويات مرتفعة من التربينات في كل من الوسائط الاصطناعية ويجب أن العنب (Gil et al. 2005).

يُعزى إنتاج التربينويد في المقام الأول إلى التحلل المائي للروابط الجليكوسيدية ، S. cerevisiae قادر على إنتاج monoterpenes من خلال مسار حمض الميفالونيك (الشكل 2 د). كارو وآخرون (2005) أظهر ذلك S. cerevisiae و Hanseniaspora uvarum يمكن أن تنتج التربينات في وسط محدد كيميائيًا يفتقر إلى عصير العنب والتربينات والجليكوكونجوغات. كشف هذا العمل أن اللينالول و ألفا تربينول تم إنتاجهما بواسطة S. cerevisiae تحت ظروف النيتروجين الميكروية وعالية الاستيعاب في الوسائط الاصطناعية. كارو وآخرون (2005) تنبأ مسارًا بديلًا لتخليق المونوتربين (الشكل 2 د) في هذا المسار ، تتشكل المونوتربينات دي نوفو في الميتوكوندريا وترتبط بتقويض ليسين وسينثيز GPP الجديد. تمت دراسة الارتباط بين هدم الليوسين واستقلاب الأيزوبرينويد في الفطر. نيدولانس الرشاشيات، وتوفير الأسبقية لهذا المسار البديل (Rodríguez et al. 2004).


نتائج ومناقشة

إنشاء مسار استخدام الزيلوز في سلالة دهنية منتجة للكحول

من أجل إنتاج 1-هيكساديكانول القائم على الزيلوز ، أدخلنا أولاً مسار استخدام الزيلوز الفطري [29] في مادة 1-هيكساديكانول S. cerevisiae سلالة ، XF3 [10] (الشكل 1). تم اختيار مسار استخدام الزيلوز من دراستنا السابقة [29] ، والتي تضمنت XR من المبيضات شحاتي، XDH من المبيضات الاستوائية و XKS من بيتشيا باستوريس. أنتجت سلالة XF3 1-هيكساديكانول بأكثر من 1.1 جم / لتر من الجلوكوز في S. cerevisiae كما ورد في دراستنا السابقة [10]. تم تحقيق إنتاج 1-hexadecanol في XF3 من خلال التعبير بشكل غير متجانس عن FAR من بومة الحظيرة ، والإفراط في التعبير عن acetyl-CoA carboxylase (ACC1 جين) ، مما يؤدي إلى القضاء على منظم سلبي ، RPD3 الجين ، في تخليق الفوسفوليبيد ، والإفراط في التعبير عن ليات سيترات ATP (ACL1 جين و ACL2 جين) من يارويا ليبوليتيكا لتعزيز إمداد الأسيتيل الخلوي CoA (الشكل 1 أ). من خلال إدخال مسار استخدام الزيلوز الفطري في سلالة XF3 ، نجحنا في إنشاء ملف S. cerevisiae سلالة (XF3XP) لإنتاج 1-هيكساديكانول من الزيلوز كمصدر وحيد للكربون عند 0.4 جم / لتر (الجدول 2). كان عيار الكحول الدهني القائم على الزيلوز أقل من عيار 1-هيكساديكانول القائم على الجلوكوز [10] وتم استهلاك 15 جم / لتر فقط من الزيلوز لإنتاج 1-هيكساديكانول ، مما يشير إلى أن استخدام الزيلوز يمكن أن يكون خطوة تحديد معدل للكحول الدهني إنتاج. قدمنا ​​أيضًا مسارًا آخر من الزيلوز الفطري حيث تم تحسين قوة المروج لـ XR و XDH و XKS مسبقًا لزيادة إنتاج الإيثانول القائم على الزيلوز (XF3XPi ، الجدول 2). وجدنا أنه على الرغم من أنه يمكن زيادة إنتاج 1-هيكساديكانول إلى 0.48 جم / لتر ، إلا أن استخدام الزيلوز كان أسوأ من المسار من النوع البري مع استهلاك أقل من 5 جم / لتر من الزيلوز. ربما هذا يرجع إلى حقيقة أن الآلية التنظيمية التي اعتمدتها S. cerevisiae للسيطرة على إنتاج الكحول الدهني القائم على الزيلوز كان مختلفًا عن ذلك للتحكم في إنتاج الإيثانول القائم على الزيلوز. لذلك ، فإن هندسة التمثيل الغذائي S. cerevisiae لإنتاج الوقود الحيوي هو الهدف المحدد.

هندسة المروج لتحسين إنتاج 1-هيكساديكانول من الزيلوز

من أجل زيادة تحسين إنتاج 1-hexadecanol ، طبقنا منهجًا في البيولوجيا التركيبية يسمى التحسين المخصص للمسارات الأيضية بواسطة هندسة النسخ التوافقية (COMPACTER) [28] للتحكم بدقة في مستويات التعبير الجيني لـ XR و XDH و XKS. في الأساس ، اخترنا ثلاثة مروجين أساسيين ، PPDC1، صTEF1، و صENO2 للتعبير عن جينات XR و XDH و XKS ، على التوالي. لكل من المروجين التأسيسي ، قمنا بتحويل المروجين الأصليين لإنشاء مكتبة مروج بقوى متفاوتة. ثم اخترنا المروجين ذوي القوة العالية والمتوسطة والمنخفضة (ملف إضافي 1: الشكل S2) لـ P.PDC1، صTEF1، و صENO2، على التوالي ، وشيدت بالكامل 27 مسارًا زيلوزًا صناعيًا (3 × 3 × 3 = 27) في S. cerevisiae مع كل تركيبات المروج لـ PPDC1، صTEF1، و صENO2 بقوى مختلفة (الشكل 1 ب الجدول 1). قمنا بعد ذلك بمقارنة معدلات النمو و 1-hexadecanol titers لكل المؤتلف S. cerevisiae سلالات لسلالات التحكم ، XF3XP (الشكل 2). تجدر الإشارة إلى أن الغرض من فحص المروج الاندماجي هو العثور على السلالة ذات أعلى إنتاج للكحول الدهني من الزيلوز بدلاً من أفضل سلالة لاستخدام الزيلوز. لذلك ، لم نقيس معدلات استخدام الزيلوز هنا. لقد وجدنا أن معدلات نمو معظم السلالات المهندسة بالمحرض قد انخفضت إلى حد ما ، ولم يتحسن إنتاج 1-هيكساديكانول لمعظم السلالات المؤتلفة بشكل ملحوظ. ومع ذلك ، أنتجت السلالة XF3X07 و XF3X25 1-هيكساديكانول عند 171 و 140٪ أعلى من سلالات التحكم مع معدلات نمو متوفاة قليلاً (0.073 ساعة -1 و 0.080 ساعة -1) مقارنة مع معدل نمو سلالة التحكم (0.093) ح −1). استخدم كل من XF3X07 و XF3X25 مروج TEF1 عالي المستوى للتعبير عن XDH ومروج ENO2 منخفض المستوى للتعبير عن XKS.ومع ذلك ، استخدم XF3X07 مروج PDC1 منخفض المستوى للتعبير عن XR بينما استخدم XF3X25 مروج PDC1 عالي المستوى. يتوافق هذا الاكتشاف مع الدراسات السابقة التي أظهرت أن إنزيمات XDH كانت خطوات تحد من المعدل في تحويل الزيلوز إلى الكتلة الحيوية والإيثانول [30 ، 31]. ومن المثير للاهتمام ، أنه على الرغم من ارتفاع عيار 1-هيكساديكانول في XF3X07 مقارنة بـ XF3XPi ، فإن عوائد 1-هيكساديكانول المستندة إلى الزيلوز كانت متشابهة في XF3XP07 و XF3XPi (ص & GT 0.1). يشير هذا إلى أن هندسة المروج الاندماجي حسنت بشكل أساسي معدل امتصاص الزيلوز بدلاً من تحسين مسارات المضيف لتحسين تحويل الزيلوز إلى 1-هيكساديكانول.

1-هيكساديكانول ينتج ومعدلات نمو هندسية S. cerevisiae سلالات عن طريق هندسة المروج. تمت زراعة جميع السلالات في وسط SC-xylose (4٪) لمدة 48 ساعة. ال قضبان ذات لون أفتح كانت قيم سلالة التحكم (أي XF3XP) مع مسار استخدام الزيلوز باستخدام المروجين الأصليين

لقد ربطنا قوى المروجين لـ XR و XDH و XKS بالمعلمات المقاسة ، تركيزات 1-hexadecanol ومعدلات النمو (ملف إضافي 1: الشكل S3). لم يلاحظ أي ارتباط بين قوة المروج وتركيزات 1-هيكساديكانول. كما لم نجد العلاقة بين قوة المروج ومعدلات النمو. لقد ربطنا أيضًا تركيزات 1-هيكساديكانول ومعدلات النمو ، لكننا لم نجد أي ارتباط بينهما (ملف إضافي 1: الشكل S4). لذلك ، من غير المجدي استخدام نتائج فحص المروج فقط لعمل تنبؤات بشأن اختيار المروجين التي يجب استخدامها لإنتاج 1-هيكساديكانول القائم على الزيلوز. وذلك لأن إدخال مسارات الزيلوز سيؤدي إلى إعادة الأسلاك الأيضية العالمية ، كما وجدنا سابقًا عند التحقيق في الاستجابات الأيضية لمسارات استخدام الزيلوز المختلفة عبر تحليل التدفق الأيضي 13 درجة مئوية [32]. تتضمن عملية إعادة التوصيل الأيضية العالمية هذه إعادة برمجة ليس فقط مسار الزيلوز نفسه ولكن أيضًا مسارات المصب ، مما جعل استقلاب الزيلوز معقدًا للغاية بحيث لا يمكن ربطه بنشاط مسار استخدام الزيلوز نفسه.

الهندسة التطورية لتحسين إنتاج 1-هيكساديكانول من الزيلوز

اخترنا بعد ذلك XF3X07 و XF3X25 كسلالات مستهدفة لمزيد من الهندسة التطورية لتحسين إنتاج 1-هيكساديكانول. تم استخدام الهندسة التطورية على نطاق واسع لتحسين استخدام البنتوز وإنتاج الإيثانول القائم على الزيلوز في S. cerevisiae بنجاح [33-35]. بالنظر إلى ضعف امتصاص الزيلوز في سلالاتنا المهندسة ، قمنا بتنفيذ الهندسة التطورية لمعرفة ما إذا كان إنتاج الكحول الدهني مرتبطًا بالنمو ، وإذا كان الأمر كذلك ، لزيادة تحسين إنتاج الكحول الدهني القائم على الزيلوز. على غرار دراسة فحص المروج الاندماجي ، فإن هدفنا من الهندسة التطورية هو البحث عن سلالة خميرة يمكنها إنتاج الكحوليات الدهنية من الزيلوز قدر الإمكان. لذلك ، لم نقيس معدلات استخدام الزيلوز. بشكل عام ، نقوم بنقل السلالة XF3X07 و XF3X25 بشكل تسلسلي إلى وسط صناعي مع 40 جم / لتر زيلوز مرتين. وبالتحديد ، كانت السلالة المُحسَّنة هي الجيل الثاني الذي تطور من سلالة من النوع البري. وجدنا أن معدلات نمو سلالتين زادت تدريجياً (

35٪) لكل جولة كما هو متوقع. ومع ذلك ، ارتبطت هذه الزيادة بانخفاض إنتاج 1-هيكساديكانول. على سبيل المثال ، تم الوصول إلى أعلى معدل نمو لكل من XF3X07 و XF3X25 مع أقل عيار 1-هيكساديكانول في الجولة الثانية (الشكل 3). تمت زيادة معدلات نمو السلالات المتطورة في الجولة الأخيرة بشكل كبير لـ XF3XP07 و XF3XP25 (ص & lt 0.05). ومع ذلك ، لم تتغير إنتاجات 1-هيكساديكانول بشكل كبير (ص & GT 0.05). يشير هذا التناقض إلى أن 1-هيكساديكانول ، على عكس الإيثانول ، لم يكن منتجًا مرتبطًا بالنمو. نظرًا لأن الهندسة التطورية تختار سلالة متحولة ذات معدل نمو أعلى ، فقد فشل إنتاج 1-هيكساديكانول في مزيد من التحسين عبر التطور التكيفي بسبب فك الاقتران بين معدل نمو الخلية وإنتاج الكحول الدهني. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطبيق تحليل توازن التدفق لحساب تخليق ATP و NADH و NADPH ضمن إنتاجات 1-hexadecanol مختلفة (ملف إضافي 1: الشكل S5). وجدنا أن تخليق NADPH و ATP كانا مرتبطين بشكل إيجابي بإنتاج 1-hexadecanol ، في حين أن تخليق NADH لم يتغير كثيرًا مع تخليق 1-hexadecanol. بشكل عام ، سيكون نهج الهندسة التطورية مفيدًا في تحسين نمو الخلايا والمنتجات المرتبطة بالنمو مثل الإيثانول ، ولكن ليس للمنتجات المرتبطة بعدم النمو مثل المواد الكيميائية المشتقة من الأحماض الدهنية.

الهندسة التطورية لـ XF3X07 و XF3X25. إنتاج 1-هيكساديكانول (أ) ومعدلات النمو (ب) من XF3X07 و XF3X25 في كل جولة مع عيار 1-hexadecanol ومعدلات نمو XF3X07 و XF3X25 في الجولة صفر ، على التوالي

التخمير على دفعات وتغذية على دفعات لإنتاج 1 هيكساديكانول

مع XF3XP07 كأفضل سلالة لدينا لإنتاج 1-هيكساديكانول القائم على الزيلوز ، قمنا بعد ذلك بتمييز إنتاج 1-هيكساديكانول باستخدام التخمير على دفعات ودُفعات التغذية. في التخمير الدفعي ، وجدنا أنه تم إنتاج 0.79 جم / لتر 1-هيكساديكانول من 7.8 جم / لتر زيلوز ، بمعدل نمو خلية عند 0.073 ساعة (الجدول 2). يعتبر عيار 1-hexadecanol لـ XF3XP07 أعلى بكثير من عيار XF3XP و ​​XF3XPi (ص & lt 0.05). الأكثر إثارة للاهتمام ، بمقارنة امتصاص xylose لـ XF3XP و ​​XF3XPi ، وجدنا أن سلالة XF3XP استهلكت ثلاثة أضعاف الزيلوز أكثر من سلالة XF3XPi. تم استخدام هذا الزيلوز الإضافي بشكل أساسي لإنتاج المزيد من الإيثانول في سلالات XF3XP (الجدول 2). بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بقياس تراكم 1-هيكساديكانول داخل الخلايا ، والذي كان أقل من 5 ٪ من التركيز خارج الخلية لـ 1-هيكساديكانول من الطبقة العضوية. يتوافق هذا التراكم المنخفض مع العديد من الدراسات السابقة عندما تمت زراعة الخميرة بطبقة عضوية [36] ، على الرغم من أنه تم الإبلاغ أيضًا عن أن S. cerevisiae يمكن أن تتراكم السلالات كمية كبيرة من الكحولات الدهنية داخل الخلايا عندما تُزرع بدون الطبقة العضوية [37].

في التخمير المغذي ، استخدمنا خلايا الراحة للتخمير ، أي ، تم الاحتفاظ بكثافة الخلية على مستوى عالٍ لمنع استخدام الزيلوز لإنتاج الكتلة الحيوية. على الرغم من أن التخمير عند كثافة الخلايا العالية قد يحد من إمداد الأكسجين للتخمير ، وهو عامل مهم للتعبير الأمثل عن جينات مسار الزيلوز [38] ، إلا أن معدل النمو الصافي الهامشي لخلايا الخميرة يمكن أن يكون أكثر أهمية في الدُفعة الغذائية التخمير لأنه وجد في هذه الدراسة أن إنتاج الكحول الدهني لم يكن مرتبطًا بالنمو ، وبالتالي عن طريق إزالة إنتاج الكتلة الحيوية ، يمكن أن تعمل خلايا الخميرة كمحفزات حيوية لتحويل الزيلوز إلى 1-هيكساديكانول بكفاءة عالية. وجدنا أن مرحلة تأخر طويلة تدوم حوالي 40 ساعة في تخمير دفعة التغذية ، والتي يمكن أن تكون بسبب قمع الجلوكوز المتبقي من اللقاح منذ أن قمنا بتربية XF3XP و ​​XF3XP07 مع 20 جم / لتر جلوكوز قبل نقل الخلايا إلى الوسط. مع الزيلوز ، وبالتالي احتاجت الخلايا إلى وقت طويل لتعتاد على الزيلوز من الجلوكوز (الشكل 4). بالنسبة لسلالة XF3XP ، تم إنتاج 1-هيكساديكانول بسرعة مع انخفاض استهلاك الزيلوز ، وتم تحقيقه

0.6 جم / لتر من 1-هيكساديكانول عند 48 ساعة (الشكل 4 أ). بالنسبة لسلالة XP3XP07 ، بعد مرحلة التأخر الطويل ، تم إنتاج 1-هيكساديكانول بسرعة مع زيادة امتصاص الزيلوز ووصل إلى أعلى عيار 1-هيكساديكانول عند 1.2 جم / لتر عند 69 ساعة (الشكل 4 ب). ومع ذلك ، عند الاستمرار في تخمير دفعة التغذية لكلتا السلالتين ، تم تقليل كل من تركيزات 1-هيكساديكانول ومعدلات امتصاص الزيلوز. معدل استهلاك الزيلوز المنخفض الملحوظ مصحوبًا بانخفاض OD600 اقترح الجوع بسبب عدم القدرة على امتصاص الركيزة الكربونية والقيود المحتملة بالمغذيات الأخرى مثل النيتروجين والفوسفات بعد 50 ساعة من التخمير. في دراستنا السابقة [10] ، وجدنا أنه يمكن تناول الكحوليات الدهنية S. cerevisiae ، والذي يمكن أن يكون سبب انخفاض إنتاج الكحول الدهني عندما أصبح استخدام الزيلوز محدودًا.

التخمير الفيدرالي دفعة لإنتاج 1-هيكساديكانول القائم على الزيلوز بواسطة أ XF3XP و ب XF3XP07. تم الكشف عن الإيثانول باعتباره المنتج الثانوي الوحيد بخلاف 1-هيكساديكانول. مربع أسود تركيز 1-هيكساديكانول مثلث أزرق يستهلك الزيلوز نقطة حمراء التطوير التنظيمي600

بمقارنة إنتاج الكحول الدهني القائم على مادة الزيلوز بالإنتاج المعتمد على الجلوكوز في الدراسة السابقة ، تمت ملاحظة العيار المماثل للكحول الدهني الناتج عن تخمير دفعة التغذية ، مما يدل على التكامل الناجح لمسار استخدام الزيلوز ومسار إنتاج الكحول الدهني. ومع ذلك ، كانت محصول الكحولات الدهنية القائمة على الزيلوز في كل من الدُفعة (0.10 ± 0.02 جم / جم) والتخمير على دفعات التغذية (0.08 ± 0.01 جم / جم) أعلى بكثير من تلك التي تحتوي على الجلوكوز (

0.03 و lt0.01 جم / جم) ، على التوالي. كانت الغلة النظرية القصوى من خلال مسار الإنتاج هذا من الزيلوز والجلوكوز

0.35 (جم / جم) على التوالي. في هذه الحالة ، وصل العائد من الزيلوز إلى ما يقرب من ثلث العائد النظري ، بينما وصل العائد من الجلوكوز إلى أقل من 10٪ فقط من الناتج النظري. من المحتمل أن يُعزى تجاوز إنتاج الإيثانول عند إطعام الزيلوز بدلاً من الجلوكوز إلى الإنتاجية العالية لـ 1-هيكساديكانول القائم على الزيلوز ، والذي يمكن أن يحول المزيد من الكربون لاستخدامه في إنتاج الكحول الدهني بدلاً من إنتاج الإيثانول.


مقدمة ل خميرة الخميرة

خميرة الخميرة (المعروف باسم خميرة الخباز ورسكووس) هو حقيقيات النوى أحادية الخلية التي تستخدم بشكل متكرر في البحث العلمي. S. cerevisiae هو كائن نموذجي جذاب نظرًا لحقيقة أن جينومه قد تم تسلسله ، ويمكن التلاعب بجيناته بسهولة ، ومن السهل جدًا الحفاظ عليه في المختبر. نظرًا لأن العديد من بروتينات الخميرة متشابهة في التسلسل والوظيفة لتلك الموجودة في الكائنات الحية الأخرى ، يمكن أن تساعدنا الدراسات التي أجريت على الخميرة في تحديد كيفية عمل جين أو بروتين معين في حقيقيات النوى الأعلى (بما في ذلك البشر).

يقدم هذا الفيديو مقدمة لبيولوجيا هذا الكائن الحي النموذجي ، وكيف تم اكتشافه ، ولماذا اختارته المختبرات في جميع أنحاء العالم كنموذجهم المفضل. تمت أيضًا مناقشة الدراسات السابقة التي أجريت في S. cerevisiae والتي ساهمت في فهمنا للعمليات الخلوية المهمة مثل دورة الخلية والشيخوخة وموت الخلايا. أخيرًا ، يصف الفيديو بعض الطرق العديدة التي يتم من خلالها استخدام خلايا الخميرة في البحث العلمي الحديث ، بما في ذلك تنقية البروتين ودراسة آليات إصلاح الحمض النووي والعمليات الخلوية الأخرى المتعلقة بأمراض الزهايمر ورسكووس وباركنسون ورسكووس.

إجراء

خميرة الخميرة، والمعروفة باسم خميرة الخباز ورسكووس ، هي واحدة من العديد من الكائنات الحية النموذجية التي تمت دراستها في المختبرات في جميع أنحاء العالم. نظرًا لأنه تم تسلسل جينوم rsquos ، يمكن التلاعب بالجينات الخاصة به بسهولة ، ومن السهل الحفاظ عليه في المختبر ، فقد كان هذا النوع من الخميرة موردًا لا يقدر بثمن في فهم العمليات الخلوية الأساسية مثل انقسام الخلايا وموت الخلايا. سيعطيك هذا الفيديو لمحة عامة عن هذا الكائن النموذجي ومجموعة واسعة من التطبيقات في البحوث البيولوجية والطبية الحيوية.

تنتمي الخميرة إلى مجال Eukaryota ، والذي يتكون من كائنات حية ذات نوى مرتبطة بالغشاء ، يشار إليها باسم حقيقيات النوى. جنبا إلى جنب مع الفطر والعفن ، S. cerevisiae ينتمي إلى مملكة الفطريات نظرًا لوجود جدار خلوي مصنوع من مادة الكيتين ، وهو بوليمر متعدد السكاريد لا يوجد فقط في الفطريات ، ولكن أيضًا في الهياكل الخارجية للحشرات والقشريات.

ومن المثير للاهتمام ، أن العديد من البروتينات الموجودة في الخميرة تشترك في تسلسلات مماثلة مع البروتينات من نظرائها من حقيقيات النوى. غالبًا ما تكون هذه البروتينات متجانسة ، وتشير تسلسلاتها المتشابهة إلى أن الكائنات الحية تشترك في سلف مشترك. من خلال التحقيق في وظيفة بروتين معين في الخميرة ، يكتسب الباحثون نظرة ثاقبة لوظيفة البروتين و rsquos في حقيقيات النوى الأعلى ، مثل البشر.

في الطبيعة، S. cerevisiae يوجد في البيئات الدافئة والرطبة ، مع وجود مصدر للسكر في متناول اليد. واحدة من الأماكن المفضلة للتسكع هي كرم العنب ، حيث يسكن على جلد العنب.

S. cerevisiae له شكل بيضاوي مستدير إلى بيضاوي الشكل ويبلغ قطره عادةً 5-10 ميكرومتر عند تصويره باستخدام مجهر مجال ساطع.

عندما تنقسم معظم الخلايا حقيقية النواة عبر الانقسام الخلوي والانقسام الخلوي ، يكون هناك فصل متساوٍ بين المادة الوراثية والسيتوبلازم في الخلايا الوليدة. من ناحية أخرى، S. cerevisiae يخضع لانقسام الخلية من خلال عملية تسمى التبرعم.

يتضمن هذا الشكل من التكاثر اللاجنسي تكوين برعم مركب حديثًا من الخلية الأم ، والذي ينمو في الحجم طوال دورة الخلية حتى الانقسام الخلوي. على عكس الانقسام النموذجي للخلايا حقيقية النواة ، لا تتساوى الخليتان في الحجم بعد الانقسام الفتيلي.

الآن بعد أن تعلمنا قليلاً عن S. cerevisiae ككائن حي ، دعونا نناقش ما يجعله نظامًا نموذجيًا رائعًا للبحث.

أولاً ، تنمو خلايا الخميرة بسرعة وتنقسم كل 90 دقيقة تقريبًا. ثانيًا ، من السهل نموها ، ولا تحتاج إلا إلى تقنية وأدوات بسيطة للتكاثر. ثالثًا ، كونه أول كائن حقيقي النواة يتم تسلسل جينومه بالكامل ، S. cerevisiae لديها جميع تسلسل الجينات الخاصة بها متاحة للجمهور عبر قاعدة بيانات جينوم الخميرة.

يعتبر التلاعب الجيني للخميرة أيضًا عمليًا للغاية. عظم S. cerevisiae النواقل ، ناقلات تسلسل الحمض النووي ذات الأهمية ، هي نواقل مكوكية. عادة ما تكون نواقل المكوك بلازميدات يمكن أن تنتشر في نوعين مختلفين ، مثل الإشريكية القولونية و S. cerevisiae. يسمح هذا بالاستنساخ الجزيئي ليتم إجراؤه في E. coli ، على سبيل المثال لدمج الجين الخاص بالبروتين الفلوري الأخضر من قنديل البحر في ناقل مكوك ، والذي يمكن إدخاله في الخميرة لجعلها تتوهج.

إن بلازميد الخميرة التكاملي هو نوع من ناقلات المكوك الذي يسمح بدمج الحمض النووي الأجنبي في جينوم الخميرة من خلال عملية تسمى إعادة التركيب المتماثل. إعادة التركيب المتماثل هو تبادل للحمض النووي بين متواليات مطابقة أو متشابهة ينتج عنها تقاطع جيني بين الحمض النووي الجيني الناقل والمضيف. يمكن أن يتسبب هذا في إقصاء أحد الجينات ، أو تبديل جين بآخر. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن إعادة التركيب المتماثل يؤدي إلى الاندماج في جينوم المضيف ، يستمر التغيير الجيني بعد انقسام خلية الخميرة.

الآن بعد أن عرفت ما الذي يجعل الخميرة مناسبة جدًا للدراسة ، دعنا نلقي نظرة على سبب أهمية هذه المخلوقات الصغيرة علميًا. منذ زمن بعيد ، في أوائل الألفية السادسة قبل الميلاد ، كانت الخميرة متورطة في تخمير العنب لصنع النبيذ. لعبت الخميرة فيما بعد دورًا في خبز الخبز في مصر القديمة.

لم يحدد لويس باستور ذلك حتى عام 1856 S. cerevisiae كميكروب رئيسي لصنع النبيذ وخبز الخبز. صنف الخميرة على أنها لاهوائية اختيارية ، والتي ، في غياب الأكسجين ، تتحول إلى التخمر ، وهي عملية تسمح للخميرة باستقلاب السكريات وإنتاج الكحول كمنتج ثانوي. في هذه العملية ، يتم تقليل البيروفات ، الذي ينتج عن تحلل السكر ، إلى أسيتيل ألدهيد ، والذي يتم بعد ذلك ، بفضل تحويل NADH إلى NAD + ، تقليله إلى الإيثانول ، المكون المحدد في النبيذ.

بالانتقال إلى القرن العشرين ، اكتشف هارتويل وممرض اكتشاف البروتينات التي تنظم دورة الخلية في الخميرة.

دورة الخلية عبارة عن سلسلة من الأحداث الخلوية التي تتضمن التكرار الصحيح وفصل الحمض النووي قبل انقسام الخلية. إن تحديد بروتين السيكلين والكيناز المعتمد على السيكلين ، إلى جانب التغيير في وفرته النسبية من خلال الطور البيني والانقسام الفتيلي ، يشير إلى أن هذه البروتينات هي منظمات رئيسية لانقسام الخلايا. إن الطبيعة المحفوظة للغاية لهذه البروتينات تجعل دراستها في الخميرة ذات قيمة لفهم دور الكينازات المعتمدة على السيكلين في الكائنات متعددة الخلايا ، مثل خلل تنظيم دورة الخلية ، مما قد يؤدي إلى انقسام الخلايا غير المنضبط ، أو السرطان.

تقدمًا بعد 15 عامًا ، قام بلاكبيرن وجريدر وسزوستاك بإجراء دراسات متقدمة في فهم التيلوميرات وكذلك اكتشاف التيلوميرات. التيلوميرات هي سلاسل متكررة من الحمض النووي في نهاية الكروموسوم تمنع الحمض النووي الجيني من التدهور. تتم إضافة هذه التسلسلات المتكررة بواسطة التيلوميراز في الطرف 3 & rsquo المجاور للكروموسوم ، ويتبع تكملة النيوكليوتيدات بوليميريز الحمض النووي في الشريط المتأخر. التيلوميرات لها آثار على الشيخوخة حيث أن شرائح الحمض النووي هذه تصبح أقصر طوال عمر الكائن الحي و rsquos.

وفي الآونة الأخيرة ، في عام 1992 ، اكتشف أوسومي وزملاؤه الجينات التي تنظم الالتهام الذاتي ، وهو نوع من إعادة تدوير الخلايا. أثناء تجويع المغذيات ، تبتلع العضيات المستهلكة بواسطة البلعمة الذاتية. سوف يندمج جسيم البلعمة بعد ذلك مع الليزوزوم ، من أجل زيادة تكسير البروتينات العضوية إلى أحماض أمينية ضرورية لصنع بروتينات جديدة. يشارك الالتهام الذاتي في الآليات الخلوية المهمة التي تحمي من غزو مسببات الأمراض ونمو الورم.

هناك مجموعة واسعة من التطبيقات لدراسة الخميرة. يمكن استخدام الخميرة ، على سبيل المثال ، لدراسة الميتوفاجي ، وهو إزالة الميتوكوندريا التالفة عن طريق البلعمة الذاتية. هذه العملية لها آثار في أمراض مثل الزهايمر و rsquos و Parkinson & rsquos. في هذا الفيديو ، يتم إحداث الالتهام الذاتي في خلايا الخميرة مع إضافة وسط تجويع النيتروجين. بعد ذلك ، يتم تحضير الخلايا للفحص المجهري الفلوري ، من أجل مراقبة التفتل في الخلايا المتعطشة للنيتروجين.

S. cerevisiae للتعبير عن كميات كبيرة من البروتينات وتنقيتها ، على سبيل المثال البروتين التنظيمي للتوصيل عبر الغشاء التليف الكيسي. في هذا الفيديو ، نمت خلايا الخميرة الحاملة لبلازميد CFTR في مزارع كبيرة. بعد ذلك ، يتم إجراء الطرد المركزي للخلايا من أجل فصل الميكروسومات. الميكروسومات هي أوعية مصنوعة من الشبكة الإندوبلازمية عندما تتعطل الخلايا. سيسمح عزل وتنقية CFTR من الميكروسومات للعلماء بدراسة بنية البروتين باستخدام طرق مثل علم البلورات بالأشعة السينية.

يمكن أيضًا استخدام الخميرة كنظام نموذجي للدراسات الجينية لبروتينات إصلاح الحمض النووي البشري. تقوم هذه البروتينات باكتشاف وإصلاح الحمض النووي التالف من أجل منع تكاثر الخلايا التي تحمل جينومًا معيبًا ، مثل الخلايا السرطانية. هنا ترى المؤلفين يقومون بطلاء خلايا الخميرة ببروتين إصلاح الحمض النووي المحول ، WRN ، على ألواح وسائط انتقائية. يمكن تصور مورفولوجيا الخلية للطفرات الخاصة بـ WRN باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، ويتم الكشف عن هذا البروتين في محلول الخلية عن طريق تشغيل هلام بروتين لتحليل Western Blot.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE & rsquos عن S. cereviae. استعرضنا في هذا الفيديو: التاريخ ، والبيولوجيا الخلوية والجزيئية ، والتطبيقات الطبية الحيوية لـ S. cerevisiae. نأمل أن تكون قد استمتعت بالفيديو الخاص بنا ، ونشجعك على مشاركته مع الأصدقاء.


شاهد الفيديو: Fermentation in Yeast Experiment (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Mibei

    أيضا أننا سنفعل بدون عبارة الرائعة

  2. Calles

    عجيب ، هي عبارة القيمة

  3. Rani

    اتبع نبض المدونات على مدونات Yandex؟ اتضح أن يوم تاتيانا سيأتي قريبًا.

  4. Edlin

    نعم ، الحياة شيء خطير

  5. Matei

    أسلوب مألوف.

  6. Shaktiran

    في رأيي لم تكن على حق. أنا متأكد. دعونا نناقشها.

  7. Maeret

    أعتذر لأنني أقاطعك ، لكنني أقترح أن أذهب بطريقة مختلفة.



اكتب رسالة