معلومة

كيف يختلف تسلسل تكرار التيلومير في حقيقيات النوى؟

كيف يختلف تسلسل تكرار التيلومير في حقيقيات النوى؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

سؤال:

كيف يختلف تسلسل التكرار التيلومري في حقيقيات النوى غير الفقارية؟ إذا كنت تعرف التسلسل المتكرر لنوع معين ، سأكون ممتنًا لسماعه.

خلفية:

التيلوميراز هو إنزيم بروتين نووي يضيف تسلسل DNA متكررًا إلى الطرف الثالث من خيوط الحمض النووي في مناطق التيلومير ، والتي توجد في نهايات الكروموسومات حقيقية النواة.

في الفقاريات ، يكون تسلسل التكرار التيلومري المحفوظ هو "TTAGGG".


قاعدة البيانات التي تجيب على السؤال ، ترسم تسلسل تكرار التيلومير لجميع الأنواع المعروفة ، هي: http://telomerase.asu.edu/sequences_telomere.html

على سبيل المثال في الخميرة:


  • تم العثور على تكرار تيلومير TTAGG في العديد من الحشرات. من صحارى وماريك وتراوت (1):

(TTAGG) تم العثور على التيلوميرات المحتوية على n في ثلاثة أنواع من Lepidoptera ، دودة القز Bombyx mori (التي تم فيها اكتشاف تسلسل التيلومير مؤخرًا) ، وعثة الطحين Ephestia kuehniella ، وعثة الشمع Galleria mellonella ، في نوع واحد من Hymenoptera ، العسل. النحل Apis mellifera ، في نوع واحد من غمدية الأجنحة ، وخنفساء اللحاء Ips ، في نوع واحد من Orthoptera ، والجراد الجراد المهاجر ، وفي القشريات ، Amphipod Gammarus pulex

  • ايليجانس لديها تكرار TTAGGC. [2)

  • شكل TTAGGG شائع أيضًا في الفطريات الخيطية ، في حين أن التيلوميرات Saccharomyces cerevisiae لها تكرارات TG (TG) (TG). العديد من النباتات لديها تكرار TTTAGGG. [3)

للحصول على مراجع إضافية ، انظر المقدمة في Wu et al. [4)


البيولوجيا الهيكلية للتيلوميرات والتيلوميراز

التيلوميرات عبارة عن مجمعات بروتينية DNA تحمي نهايات الكروموسوم من الربط والاستئصال غير المشروعين. التيلوميراز هو إنزيم بروتين نووي بروتيني يصنع الحمض النووي التيلومير لمواجهة تقصير التيلومير. تتكون التيلوميرات البشرية من معقدات بين الحمض النووي التيلومري ومركب مكون من ستة بروتينات يعرف باسم المأوى. توفر بروتينات المأوى TRF1 و TRF2 تقاربًا وخصوصية ملزمة للحمض النووي التيلومري مزدوج الشريطة ، في حين أن مجمع المأوى الفرعي POT1-TPP1 يكسو التيلومير أحادي الجديلة المتراكمة الغنية بـ G والتي تتميز بجميع نهايات الكروموسوم لدينا. من خلال تغطية نهايات الكروموسوم ، يحمي المأوى الحمض النووي التيلومري من التدهور غير المرغوب فيه وأحداث الاندماج من طرف إلى طرف. تكشف هياكل بروتينات المأوى البشري عن شبكة من التفاعلات التأسيسية والخاصة بالسياق. تكشف هياكل البروتين والحمض النووي المأخوذ عن أساس كل من التقارب العالي وخصوصية تسلسل الحمض النووي لهذه التفاعلات ، وتشرح كيف يحمي المأوى بكفاءة نهايات الكروموسوم من عدم استقرار الجينوم. تعد العديد من تفاعلات البروتين والبروتين ، التي يوفرها مكون المأوى TIN2 ، ضرورية لدعم وظيفة الحماية النهائية للملاجئ. يكشف مسح لواجهات البروتين والبروتين هذه داخل المأوى عن سلسلة من تفاعلات "المجال الببتيد" التي تسمح بالربط الفعال والقدرة على التكيف مع الوظائف الجديدة. في حين أن الطبيعة المعيارية للملاجئ قد سهلت توصيفها الهيكلي جزئيًا ، إلا أن الترابط بين الوحدات الفرعية داخل التيلوميراز جعل حلها الهيكلي أكثر صعوبة. ومع ذلك ، أدى استغلال العديد من المتجانسات جنبًا إلى جنب مع التطورات الحديثة في قدرات EM cryo إلى زيادة هائلة في معرفتنا بالبيولوجيا الهيكلية التي تقوم عليها وظيفة التيلوميراز. تُظهر متجانسات التيلوميراز من مجموعة واسعة من حقيقيات النوى نواة بروتينية تشبه النسخ العكسي للفيروسات العكسية معززة بعناصر توفر وظائف خاصة بالتيلوميراز بما في ذلك التوظيف في التيلوميرات وعملية إضافة عالية التكرار التيلومير. بالإضافة إلى توفير قالب للنسخ العكسي ، يوفر مكون RNA في التيلوميراز سقالة لوحدات البروتين التحفيزي والإضافي ، ويحدد حدود تسلسل تكرار التيلومير ، ويلعب دورًا حاسمًا في تجميع RNP ، والاستقرار ، والاتجار. في حين أن التعريف عالي الدقة لهيكل التيلوميراز البشري قد بدأ للتو في الظهور ، فإن الوتيرة السريعة للتقدم التقني تتنبأ باختراقات وشيكة في هذا المجال. هنا ، نراجع البيولوجيا الهيكلية المحيطة بالتيلوميرات والتيلوميراز لتقديم وصف جزيئي للحماية النهائية لكروموسوم الثدييات والتكرار النهائي.

الكلمات الدالة: ATM ATR استجابة تلف الحمض النووي إصلاح الحمض النووي حماية نهائية نهاية النسخ المتماثل Shelterin Telomerase Telomeres.

الأرقام

تخطيطي يوضح تكوين ...

رسم تخطيطي يوضح تكوين المجمعات المشاركة في حماية نهاية الكروموسوم ونهايته ...

مخططات المجال لستة ...

مخططات المجال لبروتينات مأوى الإنسان الستة. تشير نقطة اتصال DC إلى امتداد…

الأساس الهيكلي للكروموسوم أحادي الجديلة ...

الأساس الهيكلي لحماية طرف الكروموسوم الذي تقطعت بهم السبل. أ) اليسار: هيكل TEBP-α-β ...

الهياكل البلورية لمجالات TPP1 ...

الهياكل البلورية لمجالات TPP1 وواجهات البروتين البروتين ذات الصلة. أ) الهيكل البلوري ...

البيولوجيا الهيكلية لـ TRF1 ، TRF2 ، ...

البيولوجيا الهيكلية لـ TRF1 و TRF2 وشركاء ملزمون. أ) نطاق Myb الخاص بـ TRF1 ...

الهياكل البلورية لمجالات التيلوميراز ...

الهياكل البلورية لمجالات التيلوميراز والواجهات ذات الصلة. أ) مخطط مجال hTERT. ...

الهياكل الإنزيمية الإنزيمية التيلوميراز. أ)…

الهياكل الإنزيمية الإنزيمية التيلوميراز. أ) ال تريبوليوم كاستانيوم حلقة TERT مرتبطة بـ ...


التيلوميرات والتيلوميرات: التنوع البنيوي لنفس الدور

7.2 طبيعة أطراف الكروموسوم

التيلوميرات لها تنوع هيكلي كبير وفقًا للكائنات الحية [FUL 14]. في حقيقيات النوى ، يتم الحفاظ على الهيكل جيدًا (الشكل 7.1 (أ)). وهي تتألف من منطقة ذات حبلا مزدوجة وامتداد أحادي الخيط على الجانب 3 ، يسمى G-overhang. يختلف طول منطقة الخيط المزدوج ومنطقة الخيط المفرد وفقًا للأنواع ونوع الخلية والكروموسومات المختلفة. في البشر ، يتراوح طول التيلوميرات بين 2 و 15 كيلو بايت لمنطقة الخيط المزدوج وبين 150 و 300 قاعدة للمنطقة أحادية الخيط. في بعض الفيروسات والبكتيريا ذات الصبغيات الخطية وفي الميتوكوندريا ، توجد هياكل متنوعة للغاية ، مع منطقة مزدوجة الخيط تنتهي إما بمنطقة 3 أو 5 بوصات أحادية الخيط ، مع بنية دبوس شعر مرتبطة تساهميًا أو بروتين مرتبط تساهميًا .

الشكل 7.1. التركيب (أ) والتسلسلات التيلوميرية (ب) للعديد من الكائنات حقيقية النواة

في معظم الخلايا حقيقية النواة ، يتكون الحمض النووي التيلومري من تكرارات ترادفية قصيرة ، تسلسل غير مشفر ، يختلف من نوع إلى آخر. غالبًا ما يكون هذا التسلسل غنيًا بالجوانين على الخيط الموجه من 5 إلى 3 ثوانٍ باتجاه الطرف الصبغي ، ولكن تم العثور أيضًا على تسلسلات غنية بـ G + T (الشكل 7.1 (ب)). يمثل تسلسل 5’TTAGGG3 "أقصى حد لكروموسوم الفقاريات تم تحديد تسلسلات تيلوميرية أخرى في البروتوزوا والخمائر والنباتات العليا (الشكل 7.1 (ب)). تم تمييز شكل التيلومير الأول TTGGGG في الهدبية رباعي الغشاء ثيرموفيلا بقلم إي. بلاكبيرن [BLA 78]. يوضح تسلسل الحمض النووي التيلومري في الأنواع المختلفة أن تسلسل الحمض النووي على أطراف الكروموسوم محفوظ جيدًا نسبيًا (تسلسل إجماع نوع TxAyGz) يمثل تسلسل TTAGGG التسلسل الأساسي لمعظم حقيقيات النوى. كما هو الحال مع حقيقيات النوى ، في بعض الفيروسات والبكتيريا وفي الميتوكوندريا ، يمكن أن يتكون الحمض النووي التيلومري من تكرارات ترادفية قصيرة أو تكرار طويل لتسلسلات مقلوبة تسمى TIR (التكرار المقلوب التيلومير). في دروفسيلا ، تشكل العناصر القابلة للنقل التيلوميرات (باستثناء حقيقيات النوى ، والتي لم نناقشها في هذا الفصل).


نتائج

جمع العينات وتحليلها من تيلوميرات الطحالب

لتغطية عينة واسعة من الطحالب من الناحية التطورية ، قمنا بزراعة 48 سلالة طحلبية من مجموعات الاستنبات (الجدول التكميلي S1 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت) ، بما في ذلك أعضاء كلوروبلاستيدا (كلوروفيتا وستربتوفيتا) ، رودوفيتا ، جلوكوفيتا ، هابتوفيتا ، ألفيولاتا ، أوكروفيتا و Eustigmatophyceae) و Euglenozoa (الجدول التكميلي S1 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). قمنا بفحص جميع سلالات الطحالب لنشاط التيلوميراز بواسطة مقايسة TRAP (الشكل التكميلي S2A ، المواد التكميلية عبر الإنترنت) واستنسخنا منتجات TRAP من 31 سلالة لتحديد تسلسل الحمض النووي الذي يشكل نهايات الكروموسومات (أي التسلسل الذي يتم تصنيعه بواسطة التيلوميراز) (الجدول 1 والشكلان التكميليان 2 و 3 الشكل التكميلي S2 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). جاءت سلالات الطحالب المستخدمة في هذه الدراسة من مجموعات حيث يمكن افتراض تسلسل التيلومير من البيانات المنشورة ومن المجموعات التي لم يتم وصف تسلسل التيلومير فيها بعد. في الحالات الأخيرة ، تم استخدام مجموعة من متواليات التمهيدي العكسي البديلة مع ثلاثة بادئات أساسية مختلفة لتجنب النتائج السلبية الكاذبة. في مجموعة فرعية من سلالات الطحالب (32 في المجموع) ، تم فحص حدوث التكرارات التيلوميرية المتغيرة للأقمار الصناعية الصغيرة عن طريق التهجين الجنوبي (التهجين النقطي و / أو تحليل جزء التقييد الطرفي [TRF] الشكل 4 والشكل التكميلي S3 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت) باستخدام مجسات أليغنوكليوتيد التيلومير (الجدول التكميلي S2 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). تم اختبار الموضع النهائي للتسلسلات التيلوميرية المرشحة عن طريق هضم نوكلياز BAL31 والتهجين الجنوبي في ثمانية أنواع من الطحالب (عينات تمثيلية موضحة في الشكل 5 ، التين التكميلي S3 والبيانات التكميلية ، المواد التكميلية عبر الإنترنت).

تم التحقيق في نشاط التيلوميراز في Archaeplastida بواسطة مقايسة TRAP. نشاط التيلوميراز في سلالات الطحالب التمثيلية لـ Glaucophyta (أ، هاتف 195 غلا. nostochinearum) ، رودوفيتا (ب، هاتف 213 R. ماكولاتا) ، الكلوروفيتا (ج، TEL211 تي تشوي د، هاتف 121 Dictyochloropsis غير منتظم ه، هاتف 94 بوتريويدس Pseudendocloniopsis و TEL124 باسيلينس الكاذب) و Streptophyta (F، هاتف 198 Mesotaenium endlicherianum جي، TEL97 Klebsormidium subtilissimum، TEL100 K. تشريح، هاتف 101 ك. flaccidum، هاتف 103 K. نيتينز، هاتف 187 K. crenulatum) مجمعة وفقًا لمصدرها النشئي (المشار إليه أعلاه) ، يظهر النشاط باستخدام مجموعات من الركيزة والبادئات العكسية- GG (21) و HUTC (التمهيدي من النوع البشري) (أ) ، 47F و TELPR30-3A (أرابيدوبسيس-نوع) (ب, ج, F) أو pSSyF و TELPR30-3A (د, ه). توليف التيلوميرات المتكررة المقابلة لنوع الإنسان و أرابيدوبسيسلوحظ تسلسل من النوع (قارن مع الجدول 1) في Glaucophyta (أ) وثلاث فئات من الطحالب الخضراء (ج، Chlorodendrophyceae د، Trebouxiophyceae F، Zygnematophyceae) ، على التوالي. تم الحصول على نتائج سلبية في Rhodophyta (ب) و Ulvophyceae (ه). عينات Klebsormidiophyceae (جي) تخليق نوعين مختلفين من التيلومير تركيبات بديلة من الركيزة التمهيدي TS21 و كلاميدوموناس- النوع التكرار التمهيدي العكسي (CHTTRAPRev1) ، أو من الركيزة التمهيدي pSSyF و TTTTAGG من النوع التكراري التمهيدي العكسي (T4AG2-C) ، التوليف المعروض من 7 أو 8-nt دورية من منتجات TRAP (الأسهم) بواسطة تيلوميراز من K. subtilissimum (TEL97) أو غيرها كليبسورميديوم النيابة ، على التوالي (الجدول 1). تم توثيق الاختلافات في كفاءة تنقية التيلوميراز أثناء التحضير من مستخلصات البروتين في العينات الموضحة على ج, د, F، و جي (تم تلخيصه في الجدول التكميلي S3 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). تشير المثلثات إلى كميات مختلفة من البروتين الكلي (0.1 و 1 ميكروغرام) في مستخلص البروتين دون ترسيب PEG (الخام ، كر) ، في كسور غير مترسبة (طاف ، sup) وترسبت بواسطة PEG (مستخلص تيلوميراز ، على سبيل المثال) ، باستثناء TEL94 (ه: 0.1 ، 0.2 ميكروغرام) ، TEL124 (ه: 0.1 ، 0.5 ميكروغرام) ، TEL97 (جي: 0.1 ، 0.8 ميكروغرام) ، TEL100 (جي: 0.1 ، 0.3 ميكروغرام) ، و TEL101 (جي: 0.1 ، 0.4 ميكروجرام). عند الإشارة إلى عينة واحدة ، تم استخدام 1 ميكروغرام أو كمية أعلى من إجمالي البروتين المذكور سابقًا ، باستثناء TEL121 (د: الكل 0.5 ميكروغرام) ، TEL211 (ج: sup 0.5 ميكروغرام) ، TEL94 (ه: سجل تجاري. 0.1 ، sup 0.3 ميكروغرام) ، و TEL101 (جي: sup 0.4 ميكروغرام). المستخلصات المخصبة بالتيلوميراز (50 نانوغرام من البروتين الكلي) من كلاميدوموناس هيدرا (TTTTAGGG) ، نبات الأرابيدوبسيس thaliana الشتلات (TTTAGGG) ، و يوجلينا ستيلاتا تم استخدام (TTAGGG) كعنصر تحكم في نمط سلم دورية 8 و 7 و 6 نانومتر ، على التوالي تحكم سلبي (-) ، بدون مستخلص.

تم التحقيق في نشاط التيلوميراز في Archaeplastida بواسطة مقايسة TRAP. نشاط التيلوميراز في سلالات الطحالب التمثيلية لـ Glaucophyta (أ، هاتف 195 غلا. nostochinearum) ، رودوفيتا (ب، هاتف 213 R. ماكولاتا) ، الكلوروفيتا (ج، TEL211 تي تشوي د، هاتف 121 Dictyochloropsis غير منتظم ه، هاتف 94 بوتريويدس Pseudendocloniopsis و TEL124 باسيلينس الكاذب) و Streptophyta (F، هاتف 198 Mesotaenium endlicherianum جي، TEL97 Klebsormidium subtilissimum، TEL100 K. تشريح، هاتف 101 ك. flaccidum، هاتف 103 K. نيتينز، هاتف 187 K. crenulatum) مجمعة وفقًا لمصدرها النشئي (المشار إليه أعلاه) ، يظهر النشاط باستخدام مجموعات من الركيزة والبادئات العكسية- GG (21) و HUTC (التمهيدي من النوع البشري) (أ) ، 47F و TELPR30-3A (أرابيدوبسيس-نوع) (ب, ج, F) أو pSSyF و TELPR30-3A (د, ه). توليف التيلوميرات المتكررة المقابلة لنوع الإنسان و أرابيدوبسيسلوحظ تسلسل من النوع (قارن مع الجدول 1) في Glaucophyta (أ) وثلاث فئات من الطحالب الخضراء (ج، Chlorodendrophyceae د، Trebouxiophyceae F، Zygnematophyceae) ، على التوالي. تم الحصول على نتائج سلبية في Rhodophyta (ب) و Ulvophyceae (ه). عينات Klebsormidiophyceae (جي) تخليق نوعين مختلفين من التيلومير تركيبات بديلة من الركيزة التمهيدي TS21 و كلاميدوموناس- النوع التكرار التمهيدي العكسي (CHTTRAPRev1) ، أو من الركيزة التمهيدي pSSyF و TTTTAGG من النوع التكراري التمهيدي العكسي (T4AG2-C) ، التوليف المعروض من 7 أو 8-nt دورية من منتجات TRAP (الأسهم) بواسطة تيلوميراز من K. subtilissimum (TEL97) أو غيرها كليبسورميديوم النيابة ، على التوالي (الجدول 1). تم توثيق الاختلافات في كفاءة تنقية التيلوميراز أثناء التحضير من مستخلصات البروتين في العينات الموضحة على ج, د, F، و جي (تم تلخيصه في الجدول التكميلي S3 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). تشير المثلثات إلى كميات مختلفة من البروتين الكلي (0.1 و 1 ميكروغرام) في مستخلص البروتين بدون ترسيب PEG (الخام ، كر) ، في كسور غير مترسبة (طاف ، sup) وترسبت بواسطة PEG (مستخلص تيلوميراز ، على سبيل المثال) ، باستثناء TEL94 (ه: 0.1 ، 0.2 ميكروغرام) ، TEL124 (ه: 0.1 ، 0.5 ميكروغرام) ، TEL97 (جي: 0.1 ، 0.8 ميكروغرام) ، TEL100 (جي: 0.1 ، 0.3 ميكروغرام) ، و TEL101 (جي: 0.1 ، 0.4 ميكروجرام). عند الإشارة إلى عينة واحدة ، تم استخدام 1 ميكروغرام أو كمية أعلى من إجمالي البروتين المذكور سابقًا ، باستثناء TEL121 (د: الكل 0.5 ميكروغرام) ، TEL211 (ج: sup 0.5 ميكروغرام) ، TEL94 (ه: سجل تجاري. 0.1 ، sup 0.3 ميكروغرام) ، و TEL101 (جي: sup 0.4 ميكروغرام). المستخلصات المخصبة بالتيلوميراز (50 نانوغرام من البروتين الكلي) من كلاميدوموناس هيدرا (TTTTAGGG) ، نبات الأرابيدوبسيس thaliana الشتلات (TTTAGGG) ، و يوجلينا ستيلاتا تم استخدام (TTAGGG) كعنصر تحكم في نمط سلم دورية 8 و 7 و 6 نانومتر ، على التوالي تحكم سلبي (-) ، بدون مستخلص.

تم فحص نشاط التيلوميراز في الطحالب خارج الأركابلاستيدا بواسطة مقايسة TRAP. نتائج فحص نشاط التيلوميراز من عينات تمثيلية لسلالات الطحالب مع التيلوميراز الذي يصنع النوع البشري (أ، Euglenophyceae ، Haptophyta) و أرابيدوبسيس-نوع (ب، Xanthophyceae ، Alveolata) تسلسل تيلومري ، وتلك التي لها نشاط تيلوميراز سلبي (ج، Bacillariophyceae ، Eustigmatophyceae). سلم منتجات TRAP الإيجابية (أ, ب) يتوافق مع 6 أو 7 نترات دورية لعينات التحكم (بشري و أرابيدوبسيسالنوع ، على التوالي). تمت مراقبة كفاءة تنقية التيلوميراز أثناء التحضير في مستخلص البروتين (تم تلخيصه في الجدول التكميلي S3 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت) (أ, ب) بدون ترسيب PEG (الخام ، cr.) ، وفي الكسور غير المترسبة (طاف ، sup) وترسبت بواسطة PEG (مستخلص التيلوميراز ، على سبيل المثال) ، تم استخدام مستخلصات البروتين التي تحتوي على 100 نانوغرام و / أو 1 ميكروغرام من البروتين الكلي. نتائج سلبية (ج) باستخدام كميات مختلفة من البروتين الكلي (المشار إليه بالمثلث) من Phaeodactylum tricornutum (TEL231 1 ، 0.5 ، 0.1 ميكروغرام) ، Vischeria punctata (TEL201 ، 0.5 ميكروغرام) ، و Eustigmatos polyphem (TEL133 ، 1 ، 0.1 ميكروغرام على اليسار و 0.5 ميكروغرام على اللوحة الوسطى) ومجموعات مختلفة من البرايمر (موضحة تحت الألواح). مجموعات من الركيزة التمهيدي GG (21) و تكرار التمهيدي العكسي من النوع البشري HUTC (أ, ج) أو من الركيزة التمهيدي 47F و أرابيدوبسيس-نوع كرر التمهيدي العكسي TELPR30-3A (ب, ج) استخدمت. المستخلصات المخصبة بالتيلوميراز (50 نانوغرام من البروتين الكلي) من كلاميدوموناس هيدرا (TTTTAGGG) ، نبات الأرابيدوبسيس thaliana الشتلات (TTTAGGG) ، و يوجلينا ستيلاتا تم استخدام (TTAGGG) كعنصر تحكم في نمط سلم دورية 8 و 7 و 6 نانومتر ، على التوالي تحكم سلبي (-) ، بدون مستخلص.

تم فحص نشاط التيلوميراز في الطحالب خارج الأركابلاستيدا بواسطة مقايسة TRAP. نتائج فحص نشاط التيلوميراز من عينات تمثيلية لسلالات الطحالب مع التيلوميراز الذي يصنع النوع البشري (أ، Euglenophyceae ، Haptophyta) و أرابيدوبسيس-نوع (ب، Xanthophyceae ، Alveolata) تسلسل تيلومري ، وتلك التي لها نشاط تيلوميراز سلبي (ج، Bacillariophyceae ، Eustigmatophyceae). سلم منتجات TRAP الإيجابية (أ, ب) يتوافق مع 6 أو 7 نترات دورية لعينات التحكم (بشري و أرابيدوبسيسالنوع ، على التوالي). تمت مراقبة كفاءة تنقية التيلوميراز أثناء التحضير في مستخلص البروتين (تم تلخيصه في الجدول التكميلي S3 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت) (أ, ب) بدون ترسيب PEG (الخام ، cr.) ، وفي الكسور غير المترسبة (طاف ، sup) وترسبها PEG (مستخلص التيلوميراز ، على سبيل المثال) ، تم استخدام مستخلصات البروتين التي تحتوي على 100 نانوغرام و / أو 1 ميكروغرام من البروتين الكلي. نتائج سلبية (ج) باستخدام كميات مختلفة من البروتين الكلي (المشار إليه بالمثلث) من Phaeodactylum tricornutum (TEL231 1 ، 0.5 ، 0.1 ميكروغرام) ، Vischeria punctata (TEL201 ، 0.5 ميكروغرام) ، و Eustigmatos polyphem (TEL133 ، 1 ، 0.1 ميكروغرام على اليسار و 0.5 ميكروغرام على اللوحة الوسطى) ومجموعات مختلفة من البرايمر (موضحة تحت الألواح). مجموعات من الركيزة التمهيدي GG (21) و تكرار التمهيدي العكسي من النوع البشري HUTC (أ, ج) أو من الركيزة التمهيدي 47F و أرابيدوبسيس-نوع كرر التمهيدي العكسي TELPR30-3A (ب, ج) استخدمت. المستخلصات المخصبة بالتيلوميراز (50 نانوغرام من البروتين الكلي) من كلاميدوموناس هيدرا (TTTTAGGG) ، نبات الأرابيدوبسيس thaliana الشتلات (TTTAGGG) ، و يوجلينا ستيلاتا تم استخدام (TTAGGG) كعنصر تحكم في نمط سلم دورية 8 و 7 و 6 نانومتر ، على التوالي تحكم سلبي (-) ، بدون مستخلص.

التهجين النقطي للحمض النووي الجيني باستخدام مجسات التيلومير والأقمار الصناعية الشبيهة بالتيلومير. عينات الحمض النووي الجينومية (1-2 ميكروغرام لكل نقطة) من سلالات الطحالب وعينات التحكم (المدرجة وفقًا لموضع التطور على اليسار) تم تنشيفها وتهجينها باستخدام مجسات قليلة النوكليوتيد ذات علامات إشعاعية تمثل أنواعًا مختلفة من التيلومير وتسلسلات مشتقة (موضحة أعلاه أعمدة نقطية). العينات التي تم فيها الكشف عن نوع التيلومير في تحليل التيلوميراز (الشكلان 2 و 3 ، الجدول 1) المهجنة مع قليل النوكليوتيد المقابل ، ولكن تمت الإشارة أيضًا إلى حدوث سواتل صغيرة أخرى. تهجين مجسات T4AG2 و CHSB عبر التهجين ولا يمكن تمييزها عن طريق التهجين الجنوبي (للحصول على التفاصيل ، انظر المواد التكميلية والمواد التكميلية عبر الإنترنت). أظهر القمر الصناعي الصغير T2CG3 إشارة عبر عينات الطحالب ، ولكن ليس في وضع طرفي (انظر المواد التكميلية ، المواد التكميلية عبر الإنترنت) تم وصف حالة مماثلة في زهرة الآليوم (سيكوروفا وآخرون 2006). تمثل عينات التحكم في الحمض النووي أرابيدوبسيس-نوع (شلوريلا فولغاريس) والتيلوميرات من النوع البشري (الإنسان و Ipheion uniflorum، Alliaceae) أن الحمض النووي للنبات يحتوي أيضًا على جزء من السلف أرابيدوبسيسنوع القمر الصناعي. تم إجراء إعادة التهجين للتحكم في الأغشية باستخدام مسبار rDNA مختلط (انظر المواد والطرق للحصول على التفاصيل) غير متوفر ، لم يتم تحليله.

التهجين النقطي للحمض النووي الجيني باستخدام مجسات التيلومير والأقمار الصناعية الصغيرة. عينات الحمض النووي الجينومي (1-2 ميكروغرام لكل نقطة) من سلالات الطحالب وعينات التحكم (المدرجة وفقًا لموضع التطور على اليسار) تم تنشيفها وتهجينها باستخدام مجسات قليلة النوكليوتيد ذات علامات إشعاعية تمثل أنواعًا مختلفة من التيلومير وتسلسلات مشتقة (موضحة أعلاه أعمدة نقطية). العينات التي تم فيها الكشف عن نوع التيلومير في تحليل التيلوميراز (الشكلان 2 و 3 ، الجدول 1) المهجنة مع قليل النوكليوتيد المقابل ، ولكن تمت الإشارة أيضًا إلى حدوث سواتل صغيرة أخرى. تهجين مجسات T4AG2 و CHSB عبر التهجين ولا يمكن تمييزها عن طريق التهجين الجنوبي (للحصول على التفاصيل ، انظر المواد التكميلية والمواد التكميلية عبر الإنترنت). أظهر القمر الصناعي الصغير T2CG3 إشارة عبر عينات الطحالب ، ولكن ليس في وضع طرفي (انظر المواد التكميلية ، المواد التكميلية عبر الإنترنت) تم وصف حالة مماثلة في زهرة الآليوم (سيكوروفا وآخرون 2006). تمثل عينات التحكم في الحمض النووي أرابيدوبسيس-نوع (شلوريلا فولغاريس) والتيلوميرات من النوع البشري (الإنسان و Ipheion uniflorum، Alliaceae) أن الحمض النووي للنبات يحتوي أيضًا على جزء من السلف أرابيدوبسيسنوع القمر الصناعي. تم إجراء إعادة التهجين للتحكم في الأغشية باستخدام مسبار rDNA مختلط (انظر المواد والطرق للحصول على التفاصيل) غير متوفر ، لم يتم تحليله.

تحليل التيلوميرات في يوجلينا ستيلاتا. تم هضم عينات من الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي في سدادات الاغاروز باستخدام نوكلياز BAL31 للأوقات المحددة (بالدقائق) ثم باستخدام إنزيم التقييد HindIII. تم تحليل الحمض النووي المتبقي في المقابس عن طريق الرحلان الكهربائي للمجال النبضي (اللوحة اليسرى) وتم تحليل الجزء الجزيئي المنخفض من الحمض النووي بعد الانقسام (المنتشر في محلول التفاعل) بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام التقليدي (اللوحة اليمنى). تم اكتشاف TRFs باستخدام مسبار التيلومير من النوع البشري (بدون هضم BAL31) يتراوح بين 20 و 145 كيلو بايت وهي حساسة لعملية الهضم BAL31. تم تقصير جزء من TRFs بعد 15 و 50 دقيقة من الهضم مع تحولات BAL31 إلى الأجزاء منخفضة الوزن الجزيئي التي تم اكتشافها في التهجين الهلامي التقليدي. السلم في كيلوباسيس.

تحليل التيلوميرات في يوجلينا ستيلاتا. تم هضم عينات من الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي في سدادات الاغاروز باستخدام نوكلياز BAL31 للأوقات المحددة (بالدقائق) ثم باستخدام إنزيم التقييد HindIII. تم تحليل الحمض النووي المتبقي في المقابس بواسطة الرحلان الكهربائي للمجال النبضي (اللوحة اليسرى) وتم تحليل الجزء الجزيئي المنخفض من الحمض النووي بعد الانقسام (المنتشر في محلول التفاعل) بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام التقليدي (اللوحة اليمنى). تم اكتشاف TRFs باستخدام مسبار التيلومير من النوع البشري (بدون هضم BAL31) يتراوح بين 20 و 145 كيلو بايت وهي حساسة لعملية الهضم BAL31. تم تقصير جزء من TRFs بعد 15 و 50 دقيقة من الهضم مع تحولات BAL31 إلى الأجزاء منخفضة الوزن الجزيئي التي تم اكتشافها في التهجين الهلامي التقليدي. السلم بالكيلوباسيس.

نتائج اختبار TRAP والاستنساخ

N ote تم تحديد نوع التيلومير من دورية النوكليوتيدات لمنتجات TRAP (أحرف صغيرة) أو من منتجات TRAP المستنسخة (أحرف كبيرة). الاشعال: a، pSSyF b، 47F c، GG (21) d، TS21 e، CAMV f، TELPR30-3A g، TELPR h، HUTC i، T4AG2-C j، T4AG2-PR k، CHTRTTRAPRev1 l، TTATAG3-C na ، لم يتم تحليلها. تشير متغيرات الأقمار الصناعية الصغيرة إلى عدد أشكال التيلومير المشار إليها التي تم اكتشافها بين منتجات التيلوميراز ، وأنواع التيلومير الرئيسية موضحة بخط غامق. الأخطاء المصنفة على أنها T- أو G-slippage هي نيوكليوتيدات T أو G إضافية مدمجة في الوحدة المكررة. تعتبر الأخطاء الأخرى ، معظمها حذف النوكليوتيدات أو استبدال A / G ، بمثابة شركات خاطئة للنيوكليوتيدات (عدم التطابق).

نتائج اختبار TRAP والاستنساخ

N ote تم تحديد نوع التيلومير من دورية النوكليوتيدات لمنتجات TRAP (أحرف صغيرة) أو من منتجات TRAP المستنسخة (أحرف كبيرة). الاشعال: a، pSSyF b، 47F c، GG (21) d، TS21 e، CAMV f، TELPR30-3A g، TELPR h، HUTC i، T4AG2-C j، T4AG2-PR k، CHTRTTRAPRev1 l، TTATAG3-C na ، لم يتم تحليلها. تشير متغيرات الأقمار الصناعية الصغيرة إلى عدد أشكال التيلومير المشار إليها التي تم اكتشافها بين منتجات التيلوميراز ، وأنواع التيلومير الرئيسية موضحة بخط غامق. الأخطاء المصنفة على أنها T- أو G-slippage هي نيوكليوتيدات T أو G إضافية مدمجة في الوحدة المكررة. تعتبر الأخطاء الأخرى ، معظمها حذف النوكليوتيدات أو استبدال A / G ، بمثابة شركات خاطئة للنيوكليوتيدات (عدم التطابق).

فحص نشاط التيلوميراز في Archaeplastida باستخدام اختبار TRAP

لقد درسنا 23 و 8 سلالات من الطحالب من Chlorophyta و Streptophyta ، على التوالي ، لوجود نشاط تيلوميراز باستخدام التمهيدي العكسي TELPR30-3A مع أرابيدوبسيس- نوع تسلسل التيلومير. ال أرابيدوبسيستم افتراض تسلسل النوع كنوع من التيلومير السلفي لهذه المجموعة بناءً على نتائجنا السابقة (Fulnečková et al. 2012). أظهرت سلالات الطحالب من فئات الكلوروفيتية Chlorophyceae و Trebouxiophyceae و Chlorodendrophyceae نشاط تيلوميراز إيجابي مع منتجات دورية من 7 نيوكليوتيدات (nt) (الشكل 2) وأكدت منتجات TRAP المستنسخة تخليق ال أرابيدوبسيس- نوع تسلسل التيلومير (الجدول 1). كشفت مقارنة نشاط التيلوميراز في مستخلصات التيلوميراز "الخام" ، والمستخلصات المنقاة من PEG ، وجزء البروتين غير المتسرب PEG أن نشاط التيلوميراز موجود أيضًا في جزء PEG-nonprecipitated في جميع سلالات الطحالب الإيجابية التيلوميراز هذه (تكميلية) الجدول S3 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). ومع ذلك ، فشلت سلالات الطحالب من فئة Ulvophyceae في إظهار نشاط تيلوميراز قابل للتكاثر. لم ينتج عن اختبار البادئات العكسية ذات التسلسلات المقابلة لأنواع التيلومير البديلة أو متغيرات الأقمار الصناعية الصغيرة و / أو استخدام بادئات ركيزة مختلفة للتعامل مع تفضيل الركيزة التيلوميراز المحتمل نتائج إيجابية (الجدول التكميلي S4 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). استبعدت تجربة التحكم وجود مثبطات التيلوميراز في مستخلصات الطحالب (الشكل التكميلي S1 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت التي تمت مناقشتها لاحقًا). في حالتين ، واجهنا سلمًا ضعيفًا للغاية من منتجات TRAP باستخدام التمهيدي العكسي من النوع البشري ، ومع ذلك ، حددنا الملوثات الفطرية في ثقافتين من الطحالب بواسطة PCR (انظر المواد والطرق) ، والتي قد تكون مسؤولة عن هذا النشاط المتبقي في عينات تم اختبارها.

ثلاث سلالات من الطحالب تمثل الفروع المختلفة لفئة العقدية Zygnematophyceae (TEL181 Zygnema محيط، هاتف 196 Micrasterias crux-melitensis، و TEL198 Mesotaenium endlicherianum) عرض نشاط تيلوميراز إيجابي وتوليف أرابيدوبسيستكرار التيلومير من النوع (الشكل 2 والجدول 1). في المقابل ، يمكن توضيح نوعين مختلفين من التيلوميرات في فئة Klebsormidiophyceae (الشكل 2 والجدول 1). أربع سلالات (TEL100 ك. تشريح، هاتف 101 ك. مترهل، هاتف 103 ك. نيتين، و TEL187 ك. crenulatum) أظهر نمطًا مع دورية 8-nt وكشف استنساخ منتجات TRAP عن تخليق كلاميدوموناسمن نوع التسلسلات التيلوميرية. ومن المثير للاهتمام ، أن اختبار TRAP فشل مع كلاميدوموناس- نوع التمهيدي العكسي (الشكل 2) في ك. رديء (TEL97) وأظهرت دورية 7-nt نتجت عن توليف تكرار TTTTAGG للقمر الصناعي الصغير (الجدول 1). أظهر التحقيق في نشاط التيلوميراز باستخدام بادئات الركيزة المختلفة اختلافًا في استخدام الركيزة بين التيلوميرات من Zygnematophyceae و Chlorophyceae و Trebouxiophyceae و أرابيدوبسيس، مما أدى إلى تغيير نمط منتجات TRAP (الشكل التكميلي S2 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). ولوحظ اختلاف مماثل في استخدام الأساس التمهيدي في النباتات من رتبة أحادي الفلقة Asparagales ، التي تمتلك تيلوميراز يصنع تكرارات التيلومير من النوع البشري (Sýkorová ، Leitch ، Fajkus 2006).

فشلت ثلاث سلالات من الطحالب تغطي فروعًا مختلفة من نباتات رودوفيت في إظهار نشاط التيلوميراز عند فحصها باستخدام ستة متغيرات من أوليغنوكليوتيد عكسي تمهيدي مشتق من تسلسل التيلومير المعروف في Cya. ميرولا (الجداول التكميلية S2 والبيانات التكميلية ، المواد التكميلية عبر الإنترنت) أو أربعة بادئات عكسية بديلة (الجدول التكميلي S4 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت) بما في ذلك أرابيدوبسيس اكتب (الشكل 2 والجدول 1). للتحقق مما إذا كان فشل اختبار TRAP قد يكون ناتجًا عن وجود مثبطات في مستخلصات تيلوميراز الطحالب ، أجرينا تجربة تحكم ، حيث تمت إضافة مستخلصات تيلوميراز الطحالب الحمراء السلبية إلى مستخلص تحكم إيجابي من أ. ثاليانا بنسبة 1: 1 أو 3: 1. لم يشكل أي من مستخلصات الطحالب الحمراء تأثيرًا مثبطًا واضحًا (الشكل التكميلي S1 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). أظهرت التحليلات الإضافية لنشاط الإنزيم تيلوميراز باستخدام ثلاثة بادئات أساسية مختلفة مع التمهيدي العكسي من النوع البشري نتيجة إيجابية في جميع عينات الطحالب الحمراء الثلاثة ، ولكن فقط باستخدام أساس الركيزة 47F (الشكل التكميلي S5 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). للتحقق من هوية تكرار الساتل الصغير المضخم ، أجرينا تفاعلات TRAP أيضًا باستخدام تمهيدي عكسي بديل (T3AG2-C) كان قادرًا على تضخيم منتجات TRAP بنجاح التي تحتوي على تكرارات من النوع البشري من أنواع طحالب أخرى (تمت مناقشتها لاحقًا) وبالتالي يمكن بمثابة عنصر تحكم. كشف تسلسل منتجات TRAP المستنسخة من تفاعلات التحكم هذه أنه تم تضخيم تكرار تسلسل التمهيدي العكسي فقط ، مما يشير إلى نتيجة إيجابية خاطئة.

طحلب الجلوكوفيت nostochinearum الجلوكوسيستيس (TEL195) أظهر نشاط تيلوميراز (الشكل 2) مع دورية 6-nt من منتجات TRAP باستخدام أرابيدوبسيس- أو التمهيدي العكسي من النوع البشري. تم التحقق من استنساخ منتجات TRAP من كلا توليفي التمهيدي من التوليف للتسلسل التيلومري من النوع البشري بواسطة غلا. nostochinearum تيلوميراز (الجدول 1). ومن المثير للاهتمام ، أن سلالات الطحالب من كلا الفئتين العقدية أظهرت إثراءًا كبيرًا للتيلوميراز في مستخلص البروتين بعد تنقية PEG ، على عكس الكلوروفيت وطحلب الجلوكوفيت ، الذي أظهر نشاطًا مشابهًا في كل من العينات النقية وغير المنقاة (انظر الجدول التكميلي S3 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت) .

نشاط التيلوميراز في مجموعات الطحالب الأخرى

لقد بحثنا في نشاط التيلوميراز أيضًا في ممثلي مجموعات الطحالب الأخرى. وفقًا للبيانات المنشورة ، يجب أن تمتلك الدياتومات والنباتات الحمضية تيلوميرات مكونة من النوع البشري من الأقمار الصناعية التيلوميرية الصغيرة (Dooijes et al. 2000 Armbrust et al. 2004) ، لكننا لم نتمكن من اكتشاف أي نشاط تيلوميراز (الشكل 3) هاتف 231 ص. tricornutum. في المقابل ، الثلاثة يوجلينا الأنواع التي تم اختبارها (Euglenophyceae) و haptophyte TEL210 بافلوفا لوثري عرض نشاط تيلوميراز مرتفع وتوليف التكرارات التيلوميرية من النوع البشري (الجدول 1). استبعدت تجارب التحكم المصممة للتحقيق في التفضيلات المحتملة في تسلسل الركيزة التمهيدي أو وجود مثبطات في مستخلص الدياتوم تيلوميراز هذه الأسباب الفنية لفشل اختبار TRAP (الجدول التكميلي S4 والبيانات التكميلية ، المواد التكميلية عبر الإنترنت تشير إلى المناقشة السابقة). أكدت دورية 7-nt واستنساخ منتجات TRAP تخليق المتوقع أرابيدوبسيسنوع التيلومير في ج. فيليا (الشكل 3 والجدول 1) ، والتي تتفق مع موقعها التطوري داخل Alveolata بالقرب من dinoflagellates المعروف من التجارب السابقة لامتلاك التيلوميرات التي شكلتها أرابيدوبسيسمن النوع المتسلسل (Fojtová et al. 2010). أظهرت عينات من فئتي Xanthophyceae و Eustigmatophyceae نتائج مختلفة تمامًا ، على الرغم من حقيقة أنهما ينتميان إلى فصيلة الطحالب Ochrophyta داخل Stramenopiles. على الرغم من أن كل خمسة من xanthophytes (TEL95 زانثونيما راجع هورميدويد، هاتف 202 بلوروكلوريس ميرينغنسيس، هاتف 203 Xanthonema debile، هاتف 204 البروتونات غير المتجانسة، و TEL205 يتدخل Botrydiopsis) أظهر التيلوميراز توليف أرابيدوبسيسمن النوع المتسلسل ، تم فحص سلالتي eustigmatophyte (TEL133 يوس. بوليفيم و TEL201 الخامس. النقاط) did not reveal any reproducible telomerase activity ( fig. 3). Similar to diatoms, control experiments using different combinations of substrate and reverse primers showed negative result ( supplementary table S4 , Supplementary Material online), whereas a presence of inhibitors was excluded (discussed earlier, supplementary fig. S1 , Supplementary Material online). A PEG purification step was successful in telomerase enrichment of protein extracts from algal strains of Euglenophyceae, Haptophyta, Xanthophyceae, and C. velia ( supplementary table S3 , Supplementary Material online).

Dot-Blot Hybridization Screening and Testing for Telomeric Localization of Minisatellite Repeats Using BAL 31 Digestion

We screened samples of algal genomic DNA by Southern hybridization using radioactively labeled oligonucleotides as probes ( fig. 4) to unveil a possible occurrence of other telomere-like minisatellites in the respective genomes and to possibly identify candidate telomeric sequences in samples with no detected telomerase activity. We experienced difficulties in DNA extraction from several algal strains, mainly from Zygnematophyceae and rhodophytes, which showed the presence of colored substances and a low DNA yield moreover, genomic DNA extraction was not successful for TEL196 Micrasterias crux-melitensis and TEL198 Mesotaenium endlicherianum. For the remaining samples from Chlorophyta, Streptophyta, Xanthophyceae, Euglenophyceae, Haptophyta, Glaucophyta, and C. velia, the dot-blot hybridization confirmed the presence of telomeric minisatellites identified as “true” telomeric types synthesized by telomerase in the respective algal strains. However, dot-blot hybridization of genomic DNA from telomerase-negative strains did not suggest any other candidate telomeric sequence and in general, dot-blot hybridization signals were much weaker than we experienced in our previous study ( Fulnečková et al. 2012). A weak signal of control hybridization with a mixed probe consisting of a mixture of LSU and SSU rDNA sequences (see Material and Methods) may be caused by a wide phylogenetic span of our algal collection and a limited similarity among rDNA sequences or by a low quality of genomic DNA prepared by the proteinase K-based method, because we observed difficulties in PCR amplification of control rDNA sequences and other Southern hybridization experiments ( supplementary material , Supplementary Material online). The terminal position of a candidate human-type telomeric sequence in euglenophytes (TEL206 and TEL207) and the terminal position of the كلاميدوموناس type or the TTTTAGG type of a telomeric sequence in Klebsormidiophyceae (TEL103, TEL187, and TEL97) were verified using BAL 31 nuclease digestion ( fig. 5 supplementary figs. S3 and Supplementary Data , Supplementary Material online). Subsequent rehybridization of BAL31-digested samples of TEL97 (ك. subtilissimum) with the كلاميدوموناس-type sequence probe confirmed the presence of both sequence types in TRFs ( supplementary fig. S3B , the bottom panel, Supplementary Material online). Investigation of the TRF lengths showed that the TTTTAGG-type sequences hybridize with 0.7–1.5 kb long fragments ( supplementary fig. S3A , right panel, Supplementary Material online), suggesting short telomeres similar to Chlamydomonadales. Correspondingly, digestion with SmaI digestion produced longer restriction fragments and the signal of both TTTTAGG- and كلاميدوموناس-type probes was distributed among multiple BAL31-sensitive fragments of 2.5–23 kb length ( supplementary fig. S3B , the bottom panel, Supplementary Material online). Besides these, short BAL31-resistant fragments (1.3–2.3 kb) representing interstitial telomeric sequences could also be seen in the hybridization patterns of both probes. The presence of internal telomere repeats is also apparent in ك. crenulatum ( supplementary fig. S4A , Supplementary Material online). Although high-molecular-weight restriction fragments hybridizing with كلاميدوموناس-type probe shortened upon BAL31 treatment ( supplementary fig. S4A , the left panel, Supplementary Material online), the low-molecular-weight fragments were resistant to BAL31, which reflects their internal (nontelomeric) positions ( supplementary fig. S4A , the right panel, Supplementary Material online). We also performed BAL31 digestion on both strains of Eustigmatophyceae to check whether the quality of the genomic DNA could be the reason for the failure of dot-blot hybridization. Probing with the أرابيدوبسيس-type or the human-type telomeric sequence, which are expected as candidate telomere types due to the phylogenetic position of Eustigmatophyceae in Ochrophyta, did not produce any specific signal ( supplementary fig. S4 , Supplementary Material online), thus confirming the negative results of the TRAP assay and dot-blot hybridization. BAL 31 nuclease digestion was performed also in TEL131 Porphyridium purpureum samples, but both investigated probes (Cyanidioschyzon-type and human-type) failed to show any specific signal.

Identification of Candidate Telomere Sequences in Genome Sequences of Phylogenetically Diverse Eukaryotes

To cover a wider spectrum of phylogenetic lineages across the tree of eukaryotic life, we coupled our experimental investigations with in silico searches for candidate telomeric sequences in published or publicly available genome sequences, focusing on groups that have been ignored or poorly studied with regard to their telomeres. In addition, we take advantage of the genome data yielded by our on-going genome sequencing projects for three phylogenetically unique organisms, the jakobid و. godoyi, the malawimonad م. californiana, and the goniomonad Gon. avonlea. We also used available genomic sequences to verify the presence of telomeric sequences that have been described previously for the respective organisms by methods in telomere biology. We searched the genome assemblies for stretches consisting of repeated units of the major known types of telomeric sequences (Tنأمجيا) and assessed them as candidate telomeric minisatellites by taking into account their position and orientation with respect to adjacent sequences. Our simple database search could not uncover degenerated telomere types, like those known from yeasts, and experimental tests are also required to confirm the terminal position of the candidate sequences. We searched 143 genomes (including 32 from species where the telomeric sequence has been published before) and 80 of them showed a convincing pattern of telomeric sequence ( supplementary table S5 , Supplementary Material online). A majority of the genomes that showed a dominant presence of the candidate sequence in terminal regions also exhibited internal telomeric repeats occurring in short stretches or in large blocks (>100 bp of uninterrupted minisatellite). The genomes where we found only short or occasional repeats positioned terminally and/or in large internal blocks were considered inconclusive and ignored for the summary of the phyletic distribution of telomeric sequences in eukaryotes shown in figure 1 (except species with previously published telomeric sequences supplementary table S5 , Supplementary Material online). In several cases, we identified unexpected candidate telomeric repeats in genomes representing hitherto unstudied key phylogenetic groups, for example, TTTCGGG in the parasitic relative of dinoflagellates Perkinsus marinus, TTTGGG in the heterolobosean ن. gruberi, TTAGG in the labyrinthulid Aurantiochytrium limacinum, and the highly unusual 10–11 nucleotide repeat unit TTTATT(T)AGGG in the rhodophyte Galdieria sulphuraria ( fig. 1 and supplementary table S5 , Supplementary Material online). In addition, minisatellites that differed from the types “canonical” for the respective organismal groups were found in fungi and stramenopiles, indicating the evolutionary flexibility of the telomeric sequence at various phylogenetic scales. Our database searches corroborated the experimental results from Haptophyta, Glaucophyta, and Chlorophyta, whereas no genome assemblies from Xanthophyceae, Chromera, Ulvophyceae, Euglenophyceae, or dinoflagellates were available for analysis. The genome assemblies of two النانوكلوروبسيس species (Eustigmatophyceae) displayed the presence of large internal blocks of TTAGGG-type repeats in addition to several terminally positioned stretches and without experimental evidence, these repeats should be taken as a candidate telomere sequence. Searches of unassembled genomic reads available for the red alga Por. umbilicalis did not identify the telomere types described in جنعم. merolae genome or predicted in the Galdieria sulphuraria genome (discussed earlier), but revealed a large number of reads containing a TTAGGG-type minisatellite. In several cases, these repeats could be assessed as internal, but whether any of the other sequences represent the true telomere cannot be verified without a full genome assembly or an experiment. A similar result was achieved when we searched unassembled Sanger reads from an on-going genome project for the haptophyte Pha. antarctica.


Effects of Psychological Stress on Telomeres as Genome Regulators

Telomere Position Effect

Telomeres form loop structures encompassing telomeric and subtelomeric regions. These looping structures bring telomeres near nontelomeric regions of chromosomes, which have been shown to modify expression of genes in these areas. This process is known as the telomere position effect (TPE) for interactions with genes proximal to telomeres or the telomere position effect over long distances (TPE-OLD) for interactions between telomeres and regions up to 10 megabase pairs away ( Fig. 9.1 ). 31 The mechanism of gene expression modification may be through physical blocking of transcription, such as in the observed silencing of genes at subtelomeric regions. Interactions between telomere–chromatin loop structures and genes controlling the activation of telomerase, for example, have been shown to repress transcription, thus preventing activation of telomerase and unwanted elongation of sufficiently long telomeres. 32

Figure 9.1 . Telomere position effect (TPE) and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). (A) Depiction of TPE-OLD silencing of gene X, possibly via interactions between chromatin loops and regulatory regions of the genome, and classic TPE silencing of gene Y. (B) Hypothesized increase in transcription of gene X with loss of TPE-OLD possibly due to chromatin conformational changes with progressive telomere shortening. (C) Depicted increase in transcription of gene Y with loss of classic TPE at critically short telomere lengths.

Recent research indicates that the interaction between long telomeres and nontelomeric sites within the genome is not random the differential expression of genes due to short telomeres can be reversed through the elongation of telomeres within the same cell culture. 7 The nucleus contains a highly regulated three-dimensional organization of chromatin that is systematically rearranged by changes in telomere length. The positioning of telomeres within the nucleus and their physical proximity to functional areas of the genome points to the role of TPE in maintaining a stable cellular phenotype.


How does the telomere repeat sequence vary in Eukaryotes? - مادة الاحياء

Telomeres preserve genome integrity by ensuring complete replication of unique sequence and protection against end-to-end chromosome fusions.

Although telomere integrity is strictly conserved, telomere proteins evolve rapidly across flies, across plants, and across mammals.

Rapid evolution of the telomere-adjacent subtelomeric sequence, combined with functional crosstalk between telomeres and subtelomeres, suggests that subtelomere sequence evolution may drive telomere protein evolution.

We propose that selfish genetic elements shape some subtelomere sequence evolution and, ultimately, adaptive telomere protein evolution across eukaryotes.

Telomeres ensure chromosome length homeostasis and protection from catastrophic end-to-end chromosome fusions. All eukaryotes require this essential, strictly conserved telomere-dependent genome preservation. However, recent evolutionary analyses of mammals, plants, and flies report pervasive rapid evolution of telomere proteins. The causes of this paradoxical observation – that unconserved machinery underlies an essential, conserved function – remain enigmatic. Indeed, these fast-evolving telomere proteins bind, extend, and protect telomeric DNA, which itself evolves slowly in most systems. We hypothesize that the universally fast-evolving subtelomere – the telomere-adjacent, repetitive sequence – is a primary driver of the ‘telomere paradox’. Under this model, radical sequence changes in the subtelomere perturb subtelomere-dependent, telomere functions. Compromised telomere function then spurs adaptation of telomere proteins to maintain telomere length homeostasis and protection. We propose an experimental framework that leverages both protein divergence and subtelomeric sequence divergence to test the hypothesis that subtelomere sequence evolution shapes recurrent innovation of telomere machinery.


Oxidative stress and antioxidants in elderly women

Brunna Cristina Bremer Boaventura , . Francieli Cembranel , in Aging (Second Edition) , 2020

Role of telomere length in oxidative stress and antioxidant defense in elderly women

Telomere maintenance might be a key factor in relation to the cumulative effects of genetic, environmental, and lifestyle factors involved in aging and aging-related diseases. 16 Various nutrients influence telomere length via mechanisms that reflect their roles in cellular functions including DNA repair and chromosome maintenance, DNA methylation, inflammation, oxidative stress, and the activity of the enzyme telomerase ( Fig. 3 ). Damage to telomeric DNA due to either oxidative stress or nucleotide precursors results in shorter telomeres . 17 In this context, antioxidant nutrients can reduce the erosion of telomeres through the potential to influence the regulation of telomere length. 17

تين. 3 . Potential mechanisms behind the influence of nutrients on telomere length. Dietary nutrients and oxidative stress influence telomere length by various mechanisms that reflect their role in cellular functions. Dashed line indicates effect of deficiency of a nutrient.

Reprinted from Paul L. Diet, nutrition and telomere length. J Nutr Biochem 201122(10):895–901, Copyright 2013, with permission from Elsevier.

Although oxidative stress gene expression and telomere shortening may be epiphenomena of an underlying aging process, allelic variation in oxidative stress genotypes is fixed and may contribute to individual differences in both telomere length and biological aging. 18 An investigation on elderly persons demonstrated that oxidative genes that are associated with shorter telomeres are also associated with the impairment of physical biomarkers of aging. 18 The authors hypothesized that pathways involving altered Cu/Fe metabolism, glutathione transferase, and mitochondrial function are likely to be centered on sirtuins, providing a possible functional link between redox biology and telomere biology. Hence, associations between telomere length and physical biomarkers of aging may, in part, reflect cellular redox status as underlying common causes. 18

The relationship between estimated endogenous estrogen exposure and telomere length was evaluated in a sample of postmenopausal women at risk of cognitive decline. 8 The authors found that greater endogenous estrogen exposure, as measured by a longer duration of reproductive years, was related to longer telomere length.

The telomerase molecule, which synthesizes telomeres, contains an estrogen-responsive element in its promoter region, which determines that telomerase activity is higher in females than in males. 19 Longer telomeres in women have been ascribed to the ability of estrogen to upregulate telomerase and at the same time reduce oxidative stress. 8 In addition, it has been observed that telomerase is also regulated by glutathione. 19


Greider, C. W. & Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. زنزانة 43, 405–413 (1985).

Nugent, C. I. & Lundblad, V. The telomerase reverse transcriptase: components and regulation. تطوير الجينات. 12, 1073–1085 (1998).

Lundblad, V. Telomerase catalysis: a phylogenetically conserved reverse transcriptase. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 95, 8415–8416 (1998).

Kobryn, K. & Chaconas, G. The circle is broken: telomere resolution in linear replicons. بالعملة. رأي. ميكروبيول. 4, 558–564 (2001).

Varmus, H. E. Form and function of retroviral proviruses. علم 216, 812–820 (1982).

de Jong, R. N., van der Vliet, P. C. & Brenkman, A. B. Adenovirus DNA replication: protein priming, jumping back and the role of the DNA binding protein DBP. بالعملة. قمة. ميكروبيول. إمونول. 272, 187–211 (2003).

Biessmann, H. & Mason, J. M. Telomere maintenance without telomerase. الكروموسوما 106, 63–69 (1997).

Frydrychova, R. & Marec, F. Repeated losses of TTAGG telomere repeats in evolution of beetles (Coleoptera). جينيتيكا 115, 179–187 (2002).

Lundblad, V. & Szostak, J. W. A mutant with a defect in telomere elongation leads to senescence in yeast. زنزانة 57, 633–643 (1989).

Lundblad, V. & Blackburn, E. H. An alternative pathway for yeast telomere maintenance rescues est1- senescence. زنزانة 73, 347–360 (1993).

Kass-Eisler, A. & Greider, C. W. Recombination in telomere-length maintenance. Trends Biochem. علوم. 25, 200–204 (2000).

Natarajan, S. & McEachern, M. J. Recombinational telomere elongation promoted by DNA circles. مول. زنزانة. بيول. 22, 4512–4521 (2002).

Bryan, T. M., Englezou, A., Dalla-Pozza, L., Dunham, M. A. & Reddel, R. R. Evidence for an alternative mechanism for maintaining telomere length in human tumors and tumor-derived cell lines. نيتشر ميد. 3, 1271–1274 (1997).

Henson, J. D., Neumann, A. A., Yeager, T. R. & Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres in mammalian cells. الأورام 21, 598–610 (2002).

de Lange, T. Protection of mammalian telomeres. الأورام 21, 532–540 (2002).

Lustig, A. J. Cdc13 subcomplexes regulate multiple telomere functions. Nature Struct. بيول. 8, 297–299 (2001).

Ferreira, M. G., Miller, K. M. & Cooper, J. P. Indecent exposure. When telomeres become uncapped. مول. زنزانة 13, 7–18 (2004).

Singer, M. S. & Gottschling, D. E. TLC1: template RNA component of خميرة الخميرة telomerase. علم 266, 404–409 (1994).

Blasco, M. A. et al. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. زنزانة 91, 25–34 (1997).

Gottschling, D. E. & Zakian, V. A. Telomere proteins: specific recognition and protection of the natural termini of Oxytricha macronuclear DNA. زنزانة 47, 195–205 (1986).

Griffith, J. D. et al. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. زنزانة 97, 503–514 (1999).

Stansel, R. M., de Lange, T. & Griffith, J. D. T-loop assembly في المختبر involves binding of TRF2 near the 3′ telomeric overhang. EMBO J. 20, E5532–5540 (2001).

de Lange, T. & Petrini, J. A new connection at human telomeres: association of the Mre11 complex with TRF2. Cold Spring Harb. Symp. Quant. بيول. LXV, 265–273 (2000).

Opresko, P. L. et al. Telomere binding protein TRF2 binds to and stimulates the Werner and Bloom syndrome helicases. J. بيول. تشيم. 277, 41110–41119 (2002).

Sun, H., Karow, J. K., Hickson, I. D. & Maizels, N. P. The Bloom's syndrome helicase unwinds G4 DNA. J. بيول. تشيم. 273, 27587–27592 (1998).

Sun, H., Bennett, R. J. & Maizels, N. The خميرة الخميرة Sgs1 helicase efficiently unwinds G–G paired DNAs. الدقة الأحماض النووية. 27, 1978–1984 (1999).

Lustig, A. J. Clues to catastrophic telomere loss in mammals from yeast telomere rapid deletion. القس الطبيعة جينيه. 4, 916–923 (2003).

Mosig, G. The essential role of recombination in phage T4 growth. Annu. القس جينيه. 21, 347–371 (1987).

Kreuzer, K. N. Recombination-dependent DNA replication in phage T4. Trends Biochem. علوم. 25, 165–173 (2000).

Cox, M. M. et al. The importance of repairing stalled replication forks. طبيعة سجية 404, 37–41 (2000).

Wei, C., Skopp, R., Takata, M., Takeda, S. & Price, C. M. Effects of double-strand break repair proteins on vertebrate telomere structure. الدقة الأحماض النووية. 30, 2862–2870 (2002).

جاكو وآخرون. دور الثدييات Rad54 في صيانة طول التيلومير. مول. زنزانة. بيول. 23, 5572–5580 (2003).

Le, S., Moore, J. K., Haber, J. E. & Greider, C. W. RAD50 and RAD51 define two pathways that collaborate to maintain telomeres in the absence of telomerase. علم الوراثة 152, 143–152 (1999).

Goldbach, R. W., Bollen-de Boer, J. E., van Bruggen, E. F. & Borst, P. Replication of the linear mitochondrial DNA of Tetrahymena pyriformis. بيوكيم. بيوفيز. Acta 562, 400–417 (1979).

Morin, G. B. & Cech, T. R. The telomeres of the linear mitochondrial DNA of Tetrahymena thermophila consist of 53 bp tandem repeats. زنزانة 46, 873–883 (1986).

Morin, G. B. & Cech, T. R. Mitochondrial telomeres: surprising diversity of repeated telomeric DNA sequences among six species of Tetrahymena. زنزانة 52, 367–374 (1988).

Cech, T. R., Nakamura, T. M. & Lingner, J. Telomerase is a true reverse transcriptase. مراجعة. Biochemistry (Mosc.) 62, 1202–1205 (1997).

Eickbush, T. H. Telomerase and retrotransposons: which came first? علم 277, 911–912 (1997).

Klobutcher, L. A., Swanton, M. T., Donini, P. & Prescott, D. M. All gene-sized DNA molecules in four species of hypotrichs have the same terminal sequence and an unusual 3′ terminus. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 78, 3015–3019 (1981).

Lipps, H. J., Gruissem, W. & Prescott, D. M. Higher order DNA structure in macronuclear chromatin of the hypotrichous ciliate Oxytricha nova. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 79, 2495–2499 (1982).

Gottschling, D. E. & Cech, T. R. Chromatin structure of the molecular ends of Oxytricha macronuclear DNA: phased nucleosomes and a telomeric complex. زنزانة 38, 501–510 (1984).

Lingner, J. et al. Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase. علم 276, 561–567 (1997).

Smogorzewska, A. & de Lange, T. Regulation of telomerase by telomeric proteins. Annu. Rev. Biochem. (في الصحافة).

Murti, K. G. & Prescott, D. M. Telomeres of polytene chromosomes in a ciliated protozoan terminate in duplex DNA loops. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 96, 14436–14439 (1999).

Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T. & Griffith, J. D. T-loops at trypanosome telomeres. Embo J. 20, 579–588 (2001).

Cesare, A. J., Quinney, N., Willcox, S., Subramanian, D. & Griffith, J. D. Telomere looping in P. sativum (common garden pea). Plant J. 36, 271–279 (2003).

Horvath, M. P., Schweiker, V. L., Bevilacqua, J. M., Ruggles, J. A. & Schultz, S. C. Crystal structure of the Oxytricha nova telomere end binding protein complexed with single strand DNA. زنزانة 95, 963–974 (1998).


الملخص

To elucidate the molecular nature of evolutionary changes of telomeres in the plant order Asparagales, we aimed to characterize telomerase RNA subunits (TRs) in these plants. The unusually long telomere repeat unit in زهرة الآليوم plants (12 nt) allowed us to identify TRs in transcriptomic data of representative species of the زهرة الآليوم genus. Orthologous TRs were then identified in Asparagales plants harbouring telomere DNA composed of TTAGGG (human type) or TTTAGGG (أرابيدوبسيس-type) repeats. Further, we identified TRs across the land plant phylogeny, including common model plants, crop plants, and plants with unusual telomeres. Several lines of functional testing demonstrate the templating telomerase function of the identified TRs and disprove a functionality of the only previously reported plant telomerase RNA in نبات الأرابيدوبسيس thaliana. Importantly, our results change the existing paradigm in plant telomere biology which has been based on the existence of a relatively conserved telomerase reverse transcriptase subunit (TERT) associating with highly divergent TRs even between closely related plant taxa. The finding of a monophyletic origin of genuine TRs across land plants opens the possibility to identify TRs directly in transcriptomic or genomic data and/or predict telomere sequences synthesized according to the respective TR template region.


شكر وتقدير

This review is the result of discussions and collaborations emerging from a workshop on telomere dynamics in non-model organisms. The workshop was supported by a BBSRC International Workshop Grant and additional support from the Genetics Society and Agilent Technologies, and from a European Research Council Advanced Investigator Award to PM. We are grateful to all attendees at the workshop for their input into our discussions of telomere measurement methods, and to Abraham Aviv, Hannah Froy and Francois Criscuolo for their comments on draft manuscripts. DHN is supported by a BBSRC David Phillips fellowship.

اسم الملف وصف
mee312161-sup-0001-TableS1.docxWord document, 16.1 KB الجدول S1. List of species and tissue storage and DNA extraction methods and their suitability for subsequent telomere length analysis, based on past experience of the authors and personal communications with colleagues. AE and TE refer to commonly used buffer solutions: AE is a mixture of sodium acetate and EDTA, TE of Tris solution and EDTA.

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


شاهد الفيديو: Lecture 5 Eukaryotic DNA Replication تضاعف DNA لحقيقية النواة (قد 2022).