معلومة

هل هناك مصطلح لإجراء يتم فيه غسل ​​عمود الكروماتوغرافيا بنسبة 20٪ كحول

هل هناك مصطلح لإجراء يتم فيه غسل ​​عمود الكروماتوغرافيا بنسبة 20٪ كحول



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

من وصف الطريقة في مستند روسي:

بعد اكتمال التحليل الكروماتوغرافي ، يُغسل العمود بما لا يقل عن 2-3 أحجام من الماء بمعدل 0.4 مل / دقيقة. ثم العمود مغمور (؟) بغسله بما لا يقل عن 10-15 حجمًا من الكحول بنسبة 20٪ بمعدل يتناقص ببطء من 0.4 مل / دقيقة إلى 0 مل / دقيقة.

الكلمة التي ترجمتها إلى "mothballed" هي konservirovat (консервировать колонку) باللغة الروسية. لها المعنى العام "تحضير شيء ما للتخزين" (على سبيل المثال ، "تحضير الخضار للتخزين بالتخليل").

في محاولة لتحديد المصطلحات الصحيحة ، أود أن أعرف سبب غسل عمود الكروماتوغرافيا بنسبة 20٪ من الإيثانول. أي توصية بشأن المصطلحات الكيميائية الحيوية القياسية لهذا الإجراء ، إن وجدت ، سيكون موضع ترحيب أيضًا.


أعدت أو مشروط للتخزين من المحتمل أن يكون مقبولًا تمامًا.

إذا كنت تبحث عن مكافئ من كلمة واحدة ، في هذه الحالة ، سأترجم كـ استقر. من Dictionary.com:

يستقر

[stey-buh-lahyz]

فعل (مع مفعول به), استقر, استقرار.

  1. لجعله ثابتًا أو ثابتًا أو ثابتًا.

يبدو هذا مناسبًا ، حيث يريد المرء ضمان الحفاظ على الحالة المناسبة للعمود لاستخدامه لاحقًا ، عند نفاد التخزين.


هذا إجراء روتيني في FPLC لإعداد الأعمدة للتخزين. يستخدم 20٪ من الإيثانول لمنع نمو الميكروبات. انظر هذه الملاحظة الفنية:

يتم تسليم جميع أعمدة SEC في 20٪ إيثانول لمنع نمو الميكروبات.


كيف يمكن تنظيف الأعمدة أو تجديدها؟

زيادة الضغط الخلفي ، والتغيرات في أوقات الاستبقاء / فقدان أداء العمود كلها أعراض شائعة للرواسب على فريت مدخل العمود ، في العمود أو على سطح الطور الثابت. في معظم الأحيان ، يمكن التغلب على هذه المشاكل من خلال استخدام إجراء غسيل مطبق بشكل صحيح. كلما أسرعت في استخدام إجراءات تجديد العمود ، زادت فرصك في استعادة الأداء الأصلي للعمود.

يتم جمع الأنواع الممتصة بشدة عند نهاية مدخل المذيب بالعمود وفي كثير من الحالات يكون من المفيد استخدام التدفق العكسي أثناء الغسيل. خلافًا للاعتقاد الشائع ، فإن عكس التدفق لن يضر أبدًا بعمود معبأ جيدًا. عادة ما يكون اتجاه التدفق المذكور هو الاتجاه الذي تم فيه تعبئة العمود في الأصل. يرجى ملاحظة ذلك ومع ذلك ، فإن السيليكا الأصلية غير المنتظمة / غير المتبلورة تمثل مشكلة محتملة عند عكس التدفق حيث يمكن إعادة هيكلة الطبقة المعبأة. يجب توخي الحذر الشديد دائمًا عند عكس التدفق على هذه السيليكا غير المنتظمة.

يرجى التحقق من إجراءات التجديد المقترحة لمجموعة المراحل المختلفة (RP ، NP ، Ion Exchange إلخ.) وإجراء اختبار عمود CoA بعد هذه الإجراءات ، في حالة استعادة الضغط الأصلي ، من أجل تقييم أداء العمود / تناظر الذروة.


12.5.1 أعمدة HPLC

يشتمل جهاز HPLC عادةً على عمودين: عمود تحليلي مسؤول عن الفصل وعمود حماية. يتم وضع عمود الحماية أمام العمود التحليلي لحمايته من التلوث.

أعمدة تحليلية

النوع الأكثر شيوعًا من عمود HPLC هو أنبوب فولاذي مقاوم للصدأ بقطر داخلي يتراوح بين 2.1 مم و 4.6 مم وطوله بين 30 مم و 300 مم (الشكل 12.39). العمود مليء بجزيئات السيليكا المسامية 3 & ndash10 & مع شكل غير منتظم أو كروي. كفاءات العمود النموذجية هي 40000 & ndash60000 لوحة نظرية / م. بافتراض أ الخامسالأعلى/الخامسدقيقة حوالي 50 ، عمود 25 سم مع 50000 لوحة / م به 12500 لوحة نظرية وسعة قصوى تبلغ 110.

يمكنك استخدام المعادلة 12.16 لتقدير سعة ذروة العمود و rsquos.

الشكل 12.39 عمود معبأ نموذجي لـ HPLC. يبلغ قطر هذا العمود الداخلي 4.6 ملم ويبلغ طوله 150 ملم ، ومعبأ بـ 5 جسيمات ومغلفة بطور ثابت.

تستخدم الأعمدة الشعرية مذيبات أقل ، ولأن العينة مخففة بدرجة أقل ، فإنها تنتج إشارات أكبر في الكاشف. هذه الأعمدة مصنوعة من شعيرات دموية مصنعة من السيليكا بأقطار داخلية من 44 & ndash200 & mum وأطوال 50 & ndash250 مم. تم تجهيز الأعمدة الشعرية المعبأة بجزيئات 3 & ndash5 & mum بكفاءات عمود تصل إلى 250000 لوحة نظرية. 10

أحد القيود على العمود الشعري المعبأ هو الضغط الخلفي الذي يتطور عند محاولة تحريك الطور المتحرك عبر الفراغات الخلالية الصغيرة بين مادة التعبئة بحجم ميكرون الجسيمات (الشكل 12.40). نظرًا لأن الأنابيب والتجهيزات التي تحمل الطور المتحرك لها حدود ضغط ، فإن الضغط الخلفي الأعلى يتطلب معدل تدفق أقل ووقت تحليل أطول. أعمدة متجانسة، حيث يكون الدعم الصلب عبارة عن قضيب مسامي واحد ، يوفر كفاءات عمود مكافئة لعمود شعري معبأ مع السماح بمعدلات تدفق أسرع. عمود متآلف و mdash الذي عادة ما يكون مشابهًا في الحجم لعمود معبأ تقليدي ، على الرغم من توفر أعمدة شعرية أصغر حجمًا ويتم تحضيرها عن طريق تشكيل قضيب متآلف في قالب وتغطيته بأنابيب PTFE أو راتينج بوليمر. تحتوي القضبان المتجانسة المصنوعة من بوليمر هلام السيليكا عادةً على مسام كبيرة بأقطار تبلغ حوالي 2 & mum و mesopores & mdashpores داخل macropores و mdash بأقطار تبلغ حوالي 13 نانومتر. 11

الشكل 12.40 يؤدي حشو الجسيمات الأصغر إلى إنشاء مساحات خلالية أصغر من حزم الجسيمات الأكبر حجمًا. على الرغم من أن تقليل حجم الجسيمات بمقدار 2 مرات يزيد من الكفاءة بمعامل 1.4 ، فإنه ينتج أيضًا زيادة بمقدار 4 أضعاف في الضغط الخلفي.

أعمدة الحرس

تميل مشكلتان إلى تقصير عمر العمود التحليلي. أولاً ، يؤدي الارتباط المذاب بشكل لا رجعة فيه إلى الطور الثابت إلى تدهور أداء العمود و rsquos عن طريق تقليل المرحلة الثابتة المتاحة. ثانيًا ، قد تسد المادة الجسيمية المحقونة بالعينة العمود التحليلي. لتقليل هذه المشكلات ، نضع عمود حماية قبل العمود التحليلي. أعمدة الحرس عادةً ما تحتوي على نفس مادة تعبئة الجسيمات والمرحلة الثابتة مثل العمود التحليلي ، ولكنها أقصر بكثير وأقل تكلفة ويبلغ طول مدشا 7.5 مم وتكلفة عُشر التكلفة للعمود التحليلي المقابل نموذجي. يتم استبدال أعمدة الحراسة بانتظام ، لأن الغرض منها هو التضحية.

إذا نظرت عن كثب إلى الشكل 12.39 ، فسترى عمود الحماية الصغير أعلى العمود التحليلي مباشرةً.

المراحل الثابتة للغاز و ndash الكروماتوغرافيا السائلة

في الكروماتوغرافيا السائلة و ndashl Liquid ، تكون المرحلة الثابتة عبارة عن فيلم سائل مغطى بمواد تعبئة ، عادة 3 & ndash10 & mum جزيئات السيليكا المسامية. نظرًا لأن المرحلة الثابتة قد تكون قابلة للذوبان جزئيًا في الطور المتحرك ، فقد تتم إزالتها أو نزفها من العمود بمرور الوقت. لمنع فقدان المرحلة الثابتة ، والتي تقصر من عمر العمود و rsquos ، فهي مرتبطة تساهميًا بجزيئات السيليكا. المراحل الثابتة المستعبدة يتم إنشاؤها عن طريق تفاعل جسيمات السيليكا مع كلوروسيلان عضوي من الشكل العام Si (CH3)2RCl ، حيث R عبارة عن مجموعة ألكيل ، أو مجموعة ألكيل مستبدلة.

لمنع التفاعلات غير المرغوب فيها بين المواد المذابة وأي مجموعات & ndashSiOH المتبقية ، Si (CH3)3تمت إضافة Cl ، وتحويل المواقع غير المتفاعلة إلى & ndashSiOSi (CH3)3 يتم تحديد هذه الأعمدة على أنها نهائية.

تعتمد خصائص المرحلة الثابتة على مجموعة ألكيل عضوي و rsquos. إذا كانت R مجموعة وظيفية قطبية ، فإن المرحلة الثابتة تكون قطبية. تتضمن أمثلة الأطوار القطبية الثابتة تلك التي تحتوي فيها R على cyano (& ndashC2ح4CN) ، ديول (& ndashC3ح6OCH2CHOHCH2OH) ، أو amino (& ndashC3ح6نيو هامبشاير2) المجموعة الوظيفية. لأن المرحلة الثابتة قطبية ، فإن الطور المتحرك هو مذيب غير قطبي أو مذيب متوسط ​​القطبية. يسمى الجمع بين المرحلة القطبية الثابتة والمرحلة المتنقلة غير القطبية كروماتوغرافيا الطور الطبيعي.

في كروماتوغرافيا الطور العكسي، وهو الشكل الأكثر شيوعًا لـ HPLC ، فإن المرحلة الثابتة غير قطبية والمرحلة المتنقلة قطبية. تستخدم الأطوار الثابتة غير القطبية الأكثر شيوعًا مادة السيلان العضوي حيث تكون المجموعة R. ن-أوكتيل (سي8) أو ن- أوكتيل ديسيل (سي18) سلسلة الهيدروكربون. يتم إجراء معظم عمليات الفصل ذات الطور العكسي باستخدام محلول مائي مخزون كطور متحرك قطبي ، أو باستخدام مذيبات قطبية أخرى ، مثل الميثانول والأسيتونتريل. نظرًا لأن ركيزة السيليكا قد تخضع للتحلل المائي في المحاليل الأساسية ، يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني للطور المتحرك أقل من 7.5.

قد يكون من الغريب أن يتم تحديد الشكل الأقل شيوعًا للكروماتوغرافيا السائلة على أنه مرحلة طبيعية. قد تتذكر أن أحد أقدم الأمثلة على الكروماتوغرافيا كان فصل ميخائيل تسويت ورسكووس للأصباغ النباتية باستخدام عمود قطبي من كربونات الكالسيوم ومرحلة متحركة غير قطبية من إيثر البترول. لذلك ، فإن إسناد الطبيعي والمعكوس هو كل شيء عن الأسبقية.


منظمات إشارات البروتين G ، الجزء ب

سكوت ويذرو ، فلادلين ز. سليباك ، في طرق في علم الإنزيمات ، 2004

الاستنتاجات

أظهر تنقية البروتين أن التفاعل بين بروتينات RGS لعائلة Gβ5 و R7 يحدث في الجسم الحي. أظهرت تجارب مطاردة النبض أن البروتينات غير المرتبطة Gβ5 و RGS7 خضعت لتحلل سريع للبروتين في الخلايا ، مما يوفر على الأرجح الآلية التي تحافظ على القياس المتكافئ 1: 1 للوحدات الفرعية Gβ5 و RGS في الخلايا. على الرغم من أن Gβ5 – RGS7 قد ثبت أن له نشاط GAP وتنظيم الإشارات بوساطة بروتين G ، إلا أن المقايسات المنسدلة فشلت في اكتشاف تفاعلها الملزم مع وحدات Gα الفرعية. في المقابل ، التفاعل بين Gβ5 – RGS7 و Gαف تم عرضه باستخدام FRET في اختبار قائم على الخلية ، مما يشير إلى أن هذا النهج قابل للتطبيق على الدراسات المستقبلية لتفاعلات Gβ5-RGS مع وحدات Gα الفرعية.


كروماتوغرافيا سائلة | اللوني تقارب

مقدمة

يمكن تعريف كروماتوغرافيا الانجذاب على أنها طريقة كروماتوغرافية سائلة يتم فيها استخدام عامل بيولوجي أو رابطة محاكية حيوية للاحتفاظ الانتقائي للمركبات التكميلية. استخدم Starkenstein هذا الشكل من اللوني السائل في الأصل في عام 1910 لتنقية الأميليز من خلال استخدام النشا كدعم صلب. استمرت هذه الطريقة في التطور ببطء على مدار الخمسين عامًا القادمة. ومع ذلك ، لم يكن حتى الستينيات من القرن الماضي أن أصبحت الدعامات المناسبة مثل agarose المخرز ، كما طورتها Hjerten ، متاحة بالإضافة إلى تقنيات تثبيت بسيطة نسبيًا لهذه الدعامات. كان التقدم المهم في هذا المجال الأخير هو تقرير في عام 1967 من قبل Axen و Porath و Ernback تم الإبلاغ فيه لأول مرة عن طريقة بروميد السيانوجين لتثبيت البروتين والببتيد. تم استخدام هذا النهج في عام 1968 من قبل كواتريكاس وأنفينسن وويلشيك لتنقية الإنزيمات من خلال استخدام مثبطات الإنزيم المعطلة. وفي هذا الوقت أيضًا تم اقتراح مصطلح "كروماتوغرافيا التقارب" لوصف هذه التقنية.

كروماتوغرافيا التقارب بسيطة نسبيًا في الأداء وهي أداة قوية لفصل الجزيئات البيولوجية الكبيرة. غالبًا ما تسمح الانتقائية العالية لهذا النهج بتطوير استراتيجيات تنقية من خطوة واحدة ، حتى عند العمل مع مخاليط مخففة ومعقدة للغاية. جعلت هذه البساطة وتنوع الروابط التي يمكن استخدامها مع هذا النهج أداة مهمة في عمليات الفصل على نطاق واسع. ومع ذلك ، يلعب كروماتوغرافيا التقارب الحديث أيضًا دورًا مهمًا في تحليل ودراسة النظم البيولوجية. على سبيل المثال ، يمكن اعتبار معظم أشكال كروماتوغرافيا السائل اللولبي ، مثل تلك التي تستخدم الدكسترين الحلقي أو بروتينات المصل ، فئة فرعية من كروماتوغرافيا التقارب.


معمل 5 أسئلة

3. الطور الثابت = يحتوي على مادة تحليلية / نظام ماص ، ويبقى في العمود / على لوح TLC
-المرحلة التي لا تتحرك أثناء TLC
- في العمود اللوني ، هو المكون الجاف المحكم في العمود.
- يتكون بشكل طبيعي من مادة ماصة مجزأة بدقة تستخدم على شكل طبقة رقيقة على مادة داعمة.
- تتدفق المرحلة المتنقلة (محلول يحتوي على العينة) عبر أو خلال المرحلة الثابتة لتأثير الفصل.

- قابل للذوبان = ما إذا كان يمكن إذابة المادة في سائل.

-مقدمة المذيب = المسافة لأعلى لوحة TLC التي ينتقل إليها المذيب النامي.
- تستخدم في تحديد قيمة الترددات اللاسلكية.

-غرفة TLC = الوسط الذي يتم فيه تنفيذ TLC.
- جرة مغطاة مع مذيب متطور ولوحة TLC واقفة بشكل مستقيم لمنع السفر المنحني

-مذيب الإكتشاف = مذيب يستخدم لإذابة المركب المراد تحليله.
- في كثير من الأحيان أسيتات الإيثيل أو كلوريد الميثيلين

-تطوير المذيب = المذيب الذي يوضع فيه TLC داخل الحجرة ، ويخلق واجهة المذيب

-مادة ماصة = ما يتمسك به الحليلة ، وعادة ما يكون صلبًا
- طبقة رقيقة وموحدة من مادة جافة ناعمة المسحوق توضع على دعامة مناسبة

-Rf = عامل الاحتفاظ - نسبة المسافة التي يقطعها البقعة على المسافة التي تقطعها مقدمة المذيب.


هل هناك مصطلح لإجراء يتم فيه غسل ​​عمود الكروماتوغرافيا بنسبة 20٪ كحول - علم الأحياء

هذه الصفحة عبارة عن مقدمة للكروماتوغرافيا الورقية - بما في ذلك اللوني ثنائي الاتجاه.

إجراء الكروماتوغرافيا الورقية

يستخدم الفصل الكروماتوغرافي لفصل مخاليط المواد في مكوناتها. تعمل جميع أشكال الكروماتوغرافيا على نفس المبدأ.

كلهم لديهم مرحلة ثابتة (مادة صلبة أو سائلة مدعومة على مادة صلبة) و أ المرحلة المتنقلة (سائل أو غاز). يتدفق الطور المتحرك خلال المرحلة الثابتة ويحمل معه مكونات الخليط. مكونات مختلفة تسافر بمعدلات مختلفة. سننظر في أسباب ذلك في أسفل الصفحة.

في الكروماتوغرافيا الورقية ، تكون المرحلة الثابتة عبارة عن ورق ماص موحد للغاية. الطور المتحرك عبارة عن مذيب سائل مناسب أو خليط من المذيبات.

إنتاج كروماتوجرام ورقي

ربما استخدمت كروماتوغرافيا الورق كأحد الأشياء الأولى التي فعلتها في الكيمياء لفصل خليط من الأصباغ الملونة - على سبيل المثال ، الأصباغ التي تشكل حبرًا معينًا. هذا مثال سهل نأخذه ، فلنبدأ من هناك.

افترض أن لديك ثلاثة أقلام زرقاء وتريد معرفة أي منها تم استخدامه لكتابة رسالة. تم رصد عينات من كل حبر على خط قلم رصاص مرسوم على ورقة من ورق كروماتوغرافيا. يتم إذابة بعض الحبر من الرسالة في أقل كمية ممكنة من مذيب مناسب ، ويتم رصد ذلك أيضًا على نفس الخط. في الرسم التخطيطي ، تم تصنيف الأقلام 1 و 2 و 3 ، وحبر الرسالة هو M.

ملحوظة: في الواقع ، سيكون ورق اللوني أبيض نقيًا - وليس رماديًا باهتًا. أجد نفسي مضطرًا لإظهاره باللون الأبيض الفاتح بسبب الطريقة التي أقوم بها في إنشاء المخططات. يسمح أي شيء أرسمه بلون أبيض نقي بإظهار لون خلفية الصفحة من خلاله.

يتم تعليق الورق في وعاء به طبقة ضحلة من مذيب مناسب أو خليط من المذيبات فيه. من المهم أن يكون مستوى المذيب أقل من الخط مع وجود البقع عليه. لا يُظهر الرسم التخطيطي التالي تفاصيل حول كيفية تعليق الورقة نظرًا لوجود عدد كبير جدًا من الطرق الممكنة للقيام بذلك ، مما يؤدي إلى تشويش الرسم التخطيطي. في بعض الأحيان ، يتم لف الورق فقط في أسطوانة مفكوكة ويتم تثبيتها بمشابك من أعلى وأسفل. ثم تقف الأسطوانة في قاع الحاوية.

سبب تغطية الحاوية هو التأكد من أن الغلاف الجوي في الدورق مشبع ببخار المذيب. يؤدي تشبع الغلاف الجوي في الدورق بالبخار إلى منع المذيب من التبخر أثناء صعوده إلى أعلى الورقة.

نظرًا لأن المذيب ينتقل ببطء إلى أعلى الورق ، فإن المكونات المختلفة لمخاليط الحبر تنتقل بمعدلات مختلفة ويتم فصل المخاليط إلى نقاط ملونة مختلفة.

يوضح الرسم التخطيطي الشكل الذي قد تبدو عليه اللوحة بعد انتقال المذيب تقريبًا إلى الأعلى.

من السهل إلى حد ما أن نرى من مخطط الكروماتوغرام الأخير أن القلم الذي كتب الرسالة يحتوي على نفس الصبغات مثل القلم 2. يمكنك أيضًا أن ترى أن القلم 1 يحتوي على مزيج من صبغتين مختلفتين - أحدهما قد تكون مماثلة للصبغة المفردة في القلم 3.

تنتقل بعض المركبات في الخليط تقريبًا بقدر المذيب ، ويبقى بعضها قريبًا جدًا من خط الأساس. المسافة المقطوعة بالنسبة إلى المذيب ثابتة لمركب معين طالما أنك تحافظ على ثبات كل شيء آخر - نوع الورق والتركيب الدقيق للمذيب ، على سبيل المثال.

المسافة المقطوعة بالنسبة للمذيب تسمى RF القيمة. لكل مركب يمكن حسابه باستخدام الصيغة:

على سبيل المثال ، إذا كان أحد مكونات الخليط قد تحرك 9.6 سم من خط الأساس بينما المذيب قد تحرك 12.0 سم ، فإن RF قيمة هذا المكون هي:

في المثال الذي نظرنا إليه باستخدام الأقلام المختلفة ، لم يكن من الضروري قياس R.F القيم لأنك تجري مقارنة مباشرة بمجرد النظر إلى مخطط الكروماتوغرام.

أنت تفترض أنه إذا كان لديك نقطتان في مخطط الكروماتوغرام النهائي لهما نفس اللون وقطعتا نفس المسافة فوق الورقة ، فمن المرجح أن تكونا نفس المركب. هذا ليس صحيحًا بالضرورة بالطبع - يمكنك الحصول على مركبين متشابهين الألوان مع R متشابهة جدًاF القيم. سننظر في كيفية التغلب على هذه المشكلة في أسفل الصفحة.

ماذا لو كانت المواد التي تهتم بها عديمة اللون؟

في بعض الحالات ، قد يكون من الممكن جعل البقع مرئية من خلال تفاعلها مع شيء ينتج عنه منتج ملون. وخير مثال على ذلك في كروماتوجرامس المنتجة من مخاليط الأحماض الأمينية.

لنفترض أن لديك خليطًا من الأحماض الأمينية وأردت معرفة الأحماض الأمينية الخاصة التي يحتوي عليها الخليط. للتبسيط سنفترض أنك تعرف أن الخليط يمكن أن يحتوي فقط على خمسة من الأحماض الأمينية الشائعة.

توضع قطرة صغيرة من محلول الخليط على الخط الأساسي للورقة ، وتوضع إلى جانبها بقع صغيرة مماثلة من الأحماض الأمينية المعروفة. يتم بعد ذلك وضع الورق في مذيب مناسب وتركه للتطور كما كان من قبل. في الرسم التخطيطي ، الخليط هو M ، والأحماض الأمينية المعروفة مرقمة من 1 إلى 5.

تم وضع علامة على موضع واجهة المذيب بالقلم الرصاص والسماح للكروماتوجرام بالتجفيف ثم رشها بمحلول من نينهيدرين. يتفاعل نينهيدرين مع الأحماض الأمينية ليعطي مركبات ملونة ، لونها بني أو أرجواني بشكل أساسي.

يُظهر الرسم البياني الأيسر الورقة بعد أن وصلت واجهة المذيب تقريبًا إلى القمة. البقع لا تزال غير مرئية. يوضح الرسم البياني الثاني الشكل الذي قد يبدو عليه بعد الرش بالنينهيدرين.

ليست هناك حاجة لقياس R.F القيم لأنه يمكنك بسهولة مقارنة البقع الموجودة في الخليط مع تلك الموجودة في الأحماض الأمينية المعروفة - من مواقعها وألوانها.

في هذا المثال ، يحتوي الخليط على الأحماض الأمينية المسمى 1 و 4 و 5.

وماذا لو احتوى الخليط على أحماض أمينية غير تلك التي استخدمناها للمقارنة؟ سيكون هناك بقع في الخليط لا تتطابق مع تلك الموجودة في الأحماض الأمينية المعروفة. سيكون عليك إعادة تشغيل التجربة باستخدام أحماض أمينية أخرى للمقارنة.

الكروماتوغرافيا الورقية ذات الاتجاهين

يتغلب الكروماتوغرافيا الورقية ذات الاتجاهين على مشكلة فصل المواد التي لها تشابه كبير في RF القيم.

سأعود للحديث عن المركبات الملونة لأنه من الأسهل بكثير رؤية ما يحدث. يمكنك فعل ذلك جيدًا باستخدام مركبات عديمة اللون - لكن عليك استخدام قدر كبير من الخيال في شرح ما يحدث!

هذه المرة ، يتم عمل مخطط كروماتوغرافي بدءًا من بقعة واحدة من الخليط موضوعة في أحد طرفي الخط الأساسي. يتم وضعه في مذيب كما كان من قبل ويترك حتى تقترب واجهة المذيب من أعلى الورقة.

في الرسم التخطيطي ، تم تحديد موضع واجهة المذيب بالقلم الرصاص قبل أن يجف الورق. هذا يسمى SF1 - واجهة المذيب للمذيب الأول. سنستخدم مذيلين مختلفين.

إذا نظرت عن كثب ، فقد تتمكن من رؤية أن البقعة المركزية الكبيرة في الكروماتوجرام زرقاء جزئيًا والأخضر جزئيًا. صبغتان في الخليط لهما نفس R تقريبًاF القيم. من الممكن أن يكون كلاهما بنفس اللون بالطبع - وفي هذه الحالة لا يمكنك معرفة ما إذا كان هناك صبغة واحدة أو أكثر في تلك البقعة.

ما تفعله الآن هو الانتظار حتى يجف الورق تمامًا ، ثم قم بتدويره خلال 90 درجة ، ثم قم بتطوير مخطط الكروماتوجرام مرة أخرى في مذيب مختلف.

من غير المحتمل جدًا أن يكون للنقطتين المربكان نفس RF القيم في المذيب الثاني بالإضافة إلى الأول ، وبالتالي ستتحرك البقع بمقدار مختلف.

يوضح الرسم التخطيطي التالي ما يمكن أن يحدث للبقع المختلفة في الكروماتوغرام الأصلي. تم وضع علامة أيضًا على موضع جبهة المذيب الثانية.

بالطبع لن ترى هذه البقع في مواقعها الأصلية والنهائية - لقد انتقلت! سيبدو مخطط الكروماتوغرام النهائي كما يلي:

قام الكروماتوغرافيا ثنائية الاتجاه بفصل الخليط بالكامل إلى أربع نقاط مميزة.

إذا كنت ترغب في تحديد البقع في الخليط ، فمن الواضح أنه لا يمكنك فعل ذلك بمواد مقارنة على نفس مخطط الكروماتوغرام كما نظرنا سابقًا باستخدام أمثلة الأقلام أو الأحماض الأمينية. سوف ينتهي بك الأمر مع فوضى لا معنى لها من البقع.

على الرغم من ذلك ، يمكنك العمل على RF قيم كل نقطة في كلا المذيبات ، ثم قارنها بالقيم التي قمت بقياسها للمركبات المعروفة في نفس الظروف بالضبط.

كيف يعمل الكروماتوغرافيا الورقية؟

على الرغم من أن الفصل الكروماتوغرافي للورق سهل ، إلا أنه من الصعب جدًا شرحه مقارنةً بالكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة. يعتمد التفسير إلى حد ما على نوع المذيب الذي تستخدمه ، والعديد من المصادر تتجاهل المشكلة تمامًا. إذا لم تكن قد قمت بذلك بالفعل ، فسيكون من المفيد قراءة الشرح الخاص بكيفية عمل كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (الرابط أدناه). سيوفر لي ذلك الكثير من التكرار ، ويمكنني التركيز على المشكلات.

ملحوظة: ستجد شرحًا لكيفية عمل كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة باتباع هذا الرابط.

استخدم الزر "رجوع" في المستعرض الخاص بك للعودة بسرعة إلى هذه الصفحة عندما تقرأها.

الهيكل الأساسي للورق

الورق مصنوع من ألياف السليلوز ، والسليلوز عبارة عن بوليمر من السكر البسيط ، الجلوكوز.

النقطة الأساسية في السليلوز هي أن سلاسل البوليمر بها مجموعات -OH التي تبرز في كل مكان حولها. إلى هذا الحد ، فإنه يقدم نفس نوع السطح مثل هلام السيليكا أو الألومينا في كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة.

قد يكون من المغري محاولة شرح كروماتوغرافيا الورق من حيث الطريقة التي يتم بها امتصاص المركبات المختلفة بدرجات مختلفة على سطح الورق. بمعنى آخر ، سيكون من الجيد أن تكون قادرًا على استخدام نفس التفسير لكل من كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة والورقية. للأسف ، الأمر أكثر تعقيدًا من ذلك!

ينشأ التعقيد لأن ألياف السليلوز تجذب بخار الماء من الغلاف الجوي وكذلك أي ماء كان موجودًا عند صنع الورق. لذلك يمكنك التفكير في الورق على أنه ألياف سليلوز ذات طبقة رقيقة جدًا من جزيئات الماء مرتبطة بالسطح.

التفاعل مع هذا الماء هو أهم تأثير أثناء الفصل الكروماتوغرافي للورق.

كروماتوغرافيا الورق باستخدام مذيب غير قطبي

افترض أنك تستخدم مذيبًا غير قطبي مثل الهكسان لتطوير مخطط الكروماتوجرام الخاص بك.

الجزيئات غير القطبية في الخليط الذي تحاول فصله لن يكون لها جاذبية كبيرة لجزيئات الماء المرتبطة بالسليلوز ، وبالتالي ستقضي معظم وقتها في الذوبان في المذيب المتحرك. وبالتالي ، فإن جزيئات مثل هذه ستنتقل لمسافة طويلة إلى أعلى الورقة التي يحملها المذيب. سيكون لديهم R عالية نسبيًاF القيم.

من ناحية أخرى ، الجزيئات القطبية إرادة لها جاذبية عالية لجزيئات الماء وأقل بكثير للمذيبات غير القطبية. وبالتالي فإنها تميل إلى الذوبان في الطبقة الرقيقة من الماء حول ألياف السليلوز أكثر بكثير مما تذوب في المذيب المتحرك.

نظرًا لأنهم يقضون وقتًا أطول في الذوبان في المرحلة الثابتة ووقتًا أقل في مرحلة التنقل ، فلن يسافروا بسرعة كبيرة فوق الورق.

يُعرف ميل المركب إلى تقسيم وقته بين مذيبين غير قابلين للامتزاج (مذيبات مثل الهكسان والماء الذي لا يمتزجان) باسم تقسيم. لذلك فإن كروماتوغرافيا الورق باستخدام مذيب غير قطبي هي نوع من كروماتوغرافيا التقسيم.

كروماتوغرافيا الورق باستخدام الماء والمذيبات القطبية الأخرى

ستخبرك لحظة التفكير أن التقسيم لا يمكن أن يكون التفسير إذا كنت تستخدم الماء كمذيب لمزيجك. إذا كان لديك ماء كمرحلة متحركة وكان الماء مرتبطًا بالسليلوز كمرحلة ثابتة ، فلا يمكن أن يكون هناك أي فرق ذي مغزى بين مقدار الوقت الذي تقضيه المادة في المحلول في أي منهما. يجب أن تكون جميع المواد قابلة للذوبان بالتساوي (أو غير قابلة للذوبان على حد سواء) في كليهما.

ومع ذلك ، ربما كانت المخططات اللونية الأولى التي صنعتها من أحبار تستخدم الماء كمذيب.

إذا كان الماء يعمل كمرحلة متحركة بالإضافة إلى كونه المرحلة الثابتة ، فيجب أن يكون هناك آلية مختلفة تمامًا في العمل - ويجب أن يكون هذا صحيحًا بنفس القدر بالنسبة للمذيبات القطبية الأخرى مثل الكحول ، على سبيل المثال. يحدث التقسيم فقط بين المذيبات التي لا تختلط مع بعضها البعض. المذيبات القطبية مثل الكحوليات الصغيرة تختلط بالماء.

أثناء البحث في هذا الموضوع ، لم أجد أي تفسير سهل لما يحدث في هذه الحالات. تتجاهل معظم المصادر المشكلة تمامًا وتقتبس فقط شرح القسم دون السماح بنوع المذيب الذي تستخدمه. تقتبس مصادر أخرى آليات لها خيوط كثيرة جدًا لدرجة أنها معقدة للغاية بالنسبة لهذا المستوى التمهيدي. لذلك أنا لا أذهب إلى أبعد من ذلك - لا داعي للقلق بشأن هذا على مستوى المملكة المتحدة A ، أو ما يعادلها.

ملحوظة: إذا فاتني شيء واضح في بحثي وكنت تعرف شرحًا مباشرًا (بقيمة حوالي علامة أو درجتين في الاختبار) لما يحدث مع الماء والمذيبات القطبية الأخرى ، فهل يمكنك الاتصال بي عبر العنوان الموجود في صفحة حول هذا الموقع .

أسئلة لاختبار فهمك

إذا كانت هذه هي المجموعة الأولى من الأسئلة التي أجريتها ، فيرجى قراءة الصفحة التمهيدية قبل البدء. ستحتاج إلى استخدام زر "BACK BUTTON" الموجود في متصفحك للعودة إلى هنا بعد ذلك.


الاختلافات بين استخدام الاسيتونتريل والميثانول للكروماتوجرافيا الطورية العكسية

من المحتمل أن تكون المذيبات العضوية الأكثر استخدامًا للمراحل المتنقلة في الفصل اللوني العكسي هي الأسيتونيتريل والميثانول. قائمة أسعار (أمثلة) للكواشف التجارية لهذه المذيبات مبينة أدناه.

كما هو موضح ، فإن الأسيتونتريل مكلف للغاية ، خاصة بالنسبة لدرجة LC. ومع ذلك ، فإن الشروط التحليلية المشار إليها في المواد المرجعية ومصنعي LC غالبًا ما تستخدم الأسيتونيتريل. لماذا هذا؟ هذا هو موضوع هذه الصفحة.

2. الامتصاص - LC Grade Acetonitrile هو الأدنى

الشكلان 1 و 2 هما أطياف الامتصاص لـ LC والدرجات الخاصة من كواشف الأسيتونيتريل والميثانول التجارية ، على التوالي. تعني درجة LC أنه تمت إزالة الشوائب التي تمتص ضوء الأشعة فوق البنفسجية (لا يعني ذلك أن النقاوة المطلقة أعلى) ويتم الاحتفاظ بامتصاص أطوال موجية محددة ضمن نطاق محدد. توضح الأرقام أنه من بين هذه الكواشف الأربعة ، فإن الأسيتونتريل من الدرجة LC لديه أدنى امتصاص ، خاصة للأطوال الموجية الأقصر. نظرًا لأنه كلما انخفض امتصاص المذيب العضوي المستخدم في المراحل المتنقلة ، انخفضت الضوضاء في الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية يعتبر الأسيتونتريل من الدرجة LC هو الأنسب لتحليل الحساسية العالية عند أطوال موجات الأشعة فوق البنفسجية القصيرة. أيضًا ، ينتج عن الأسيتونتريل من الدرجة LC أقل ذروتها الأشباح لخطوط الأساس المتدرجة. على الرغم من وجود العديد من المذيبات العضوية الأخرى ذات التوافق العالي مع الماء ، إلا أنه من الواضح أن أيا منها لا تتمتع بامتصاص أقل من أسيتونيتريل بدرجة LC.

على سبيل الاستطراد ، يصف ما يلي مثالاً لمشكلة حدثت فيما يتعلق بدرجات الكاشف. كان هناك شخص معين ، "السيد أ" ، يقيس الإيفيدرين في الإيفيدرا عند 210 نانومتر ، ولكنه كان قادرًا فقط على الحصول على بيانات ذات ضوضاء أعلى من سابقه. بعد أن شعر بالإحباط بشأن مهاراته التحليلية ، صادف أنه سأل سلفه مرة أخرى عن التحليل وعلم أن سلفه قد استخدم أسيتونتريل من الدرجة LC ، بينما كان السيد A يستخدم درجة خاصة ، بسبب المصاريف. كان يكافح من أجل استخدام مرحلة متنقلة ذات قيمة خلفية أكبر بعشرات المرات من قيمة درجة LC. وبحسب ما ورد ، بعد ذلك وضع قاعدة صارمة لوصف دائمًا منتج الكاشف ودرجته في الظروف التحليلية.
في حالة الميثانول ، لا يوجد فرق كبير في أطياف LC والدرجات الخاصة ، ولكن الامتصاصية غير مضمونة للدرجة الخاصة ، لذلك فمن المرجح أن يكون لها تقلبات أعلى. نظرًا لأن السعر لا يختلف كثيرًا ، يجب استخدام درجة LC كلما أمكن ذلك.

3. الضغط - الأسيتونتريل أقل

يختلف الضغط الذي تتعرض له الأعمدة اعتمادًا على نوع ونسبة خليط المذيبات العضوية. يوضح الشكل 3 العلاقة بين نسبة الخليط وضغط التسليم لخلائط الماء / الأسيتونيتريل والماء / الميثانول. يزداد ضغط الميثانول عند مزجه بالماء ، ولكن ليس كثيرًا مع الأسيتونتريل. بالتالي، بالنظر إلى نفس معدل التدفق ، فإن المحاليل القائمة على الأسيتونيتريل تطبق ضغطًا أقل على العمود. استنادًا إلى المسألتين اللتين تمت مناقشتهما أعلاه ، أكدنا أسباب استخدام الأسيتونتريل. ومع ذلك ، هل للميثانول أي مزايا بجانب السعر؟ نواصل المقارنة أدناه.

4. قوة الشطف - الأسيتونيتريل أعلى بشكل عام

عندما يتم خلط الأسيتونيتريل والميثانول على التوالي مع الماء بنفس النسبة ، فإن المحلول المعتمد على الأسيتونيتريل يتمتع عمومًا بقوة شطف أعلى. على وجه الخصوص ، في بعض الحالات التي تكون فيها نسبة الخليط منخفضة ، يمكن تحقيق أوقات الاحتفاظ نفسها باستخدام الأسيتونيتريل بأقل من نصف نسبة الميثانول ، كما يتضح من الكافيين والفينولات (الشكل 4).
من ناحية أخرى ، بالنسبة للمذيبات العضوية بنسبة 100٪ أو قريبة جدًا منها ، غالبًا ما يكون للميثانول قوة شطف أعلى ، كما يتضح من الكاروتين والكوليسترول (الشكل 5). قد يكون من الصعب فهم خصائص المحاليل المخلوطة ، ولكن في مثل هذه الحالات ، يبدو أن خصائص (استقطاب) المذيبات الفردية تأتي في المقدمة.
بالنسبة لنسب الخليط الأكثر تطرفًا ، مثل 50: 1 ، يمكن أن يكون لأي أخطاء عامل تشغيل أثناء التحضير تأثير كبير على أوقات الاحتفاظ أو زيادة الوقت للوصول إلى التوازن. إذا حدث هذا مع محلول أساسه الأسيتونيتريل ، فإن استخدام الميثانول سيسمح باستخدام نسبة أصغر ، مثل 10: 1 ، مما قد يجعل التحضير أسهل.

5. الفصل (شطف) الانتقائية- يختلف لكل منهما

تختلف انتقائية الفصل بين الأسيتونيتريل والميثانول. يوضح المثال في الشكل 6 عكس ترتيب شطف الفينول وحمض البنزويك. (ومع ذلك ، بالنسبة للنسب العالية من الماء ، يُستخلص الفينول أولاً حتى بالنسبة للمحاليل القائمة على الأسيتونيتريل.) ويُفترض أن هذا يرجع إلى الاختلافات في الخواص الكيميائية لجزيئات المذيبات العضوية. (الميثانول والإيثانول بروتينات ، لكن الأسيتونيتريل ورباعي الهيدروفلوران غير بروتوني). وبالتالي ، إذا لم يوفر الأسيتونيتريل انتقائية كافية للفصل ، جرب الميثانول.

6. شكل الذروة - في بعض الأحيان هناك اختلافات

بالنسبة للمركبات مثل حمض الساليسيليك (الفينول مع مجموعة الكربوكسيل أو مجموعة الميثوكسي في وضع ortho) ، يمكن أن يتسبب الأسيتونيتريل في حدوث مخلفات كبيرة ، والتي يمكن تثبيتها باستخدام الميثانول. This is probably caused by differences in the way the mobile phases relate to the mutual interaction (adsorption) between the silica surfaces and target components, due to the chemical properties of the organic solvent molecules.
Also, polymer-based reversed-phase columns generally tend to result in broader peaks than silica-based columns. This is particularly common for aromatic compounds in polystyrene columns. This is especially noticeable when using methanol-based mobile phases, whereas it is not very noticeable for acetonitrile-based mobile phases. Consequently, the latter is recommended for polymer reversed phase columns. The reason is presumably because of an affinity of organic solvents for gels, which causes the pore structure to change.

7. Mobile Phase Degassing - Use Caution With Acetonitrile

The following discusses preparing solvent mixtures ahead of time, in a mobile phase bottle (isocratic), instead of inside the LC system.
When methanol is mixed with water, it releases heat, which tends to facilitate releasing any extraneous dissolved air as bubbles (facilitates degassing). In contrast, acetonitrile cools the temperature by absorbing heat, so air bubbles are generated later, as it gradually returns to room temperature. Consequently, more care is required with respect to degassing. (Refer to LCtalk Special Issue 5 regarding heated stirring, membrane degassers, helium purging, and so on).

8. ملخص

The organic solvents most commonly used for mobile phases in reverse chromatography, acetonitrile and methanol, were compared. In general, using LC grade acetonitrile is the safest choice. If selectivity or peak shape is poor, try LC grade methanol, but it can also be effective to set analytical conditions by carefully considering the properties of each solvent.


RESULTS AND DISCUSSION

Fig. 1 outlines the general strategy of the practical protocol in a flow chart. Fig. 2 shows the elution profile of 40–60% ammonium sulfate precipitation protein that was loaded onto a Superdex G-75 column (500 μg of concentrated protein was applied to the column) and eluted out with 10 m M Tris-HCl buffer (pH 7.8). The fractions obtained were tested for their inhibitory activity by the dot-blot method. The tubes (numbers 41–52) showed the inhibitory activity. These tubes were used for electrophoretic analysis.

Fig. 3 shows the gel-x-r ay film contact print photograph. Lane 1 shows the crude extract, lane 2 shows the 0–40% ammonium sulfate precipitation, lane 3 shows the 40–60% ammonium sulfate precipitation, and lane 4 shows the 60–90% ammonium sulfate precipitation. These results show that the crude extract contained all the inhibitors (بمعنى آخر. trypsin and chymotrypsin inhibitors) and that the ammonium sulfate fractions showed different isoforms of inhibitors. In particular, the 40–60% ammonium sulfate-precipitated protein showed more specific inhibition toward trypsin than chymotrypsin. Similarly the 60–90% fraction had more affinity for chymotrypsin inhibition. Therefore, from the above observations, we can designate the 40–60%-saturated protein as trypsin inhibitors and the 60–90%-saturated proteins as chymotrypsin inhibitors (في المختبر analysis confirms these results). It is evident that the inhibitory activity is distributed among the different isoforms of inhibitors in the legume seeds.

Fig. 4 shows the electrophoretically separated gel filtration fractions (numbers 41–52). These fractions were loaded onto a gel (non-denaturing) and were stained for activity using 0.1% trypsin as a substrate. It was observed that there are about six to eight isoinhibitors depending upon the time of development. No extra bands were detected even when the gel was incubated with the x-ray films for more than 30 min.

There are several reported methods of visualization of protease inhibitors [ 19 ]. The method we described here requires neither ampholytes nor synthetic substrates, so it is cheaper and more convenient. Preparation of gels is simpler than in methods that incorporate substrates in a gel [ 7 ]. X-ray films can be stored as records, and an immediate photograph is not essential. The time required for visualization on inhibitor bands is much shorter (less than 1 h for non-SDS and 2 h for SDS-PAGE) than are most other methods. The protease solution used for visualizing inhibitor bands in the gel can be reused several times, and therefore, the amount of proteases required is much less than in methods involving agarose overlaying [ 20 ]. The protease concentrations for the visualization of protease inhibitors in gels are only indicators of the range, as the protease concentrations and solution volume are changed by repeated use of the same solution. More protease can be added to the used protease solution to restore the activity and the volume to the desired level.

This method is fairly reliable, and gel storage does not appear to cause a serious problem. This method can be applied for visualization of isoelectrophoretically separated protease inhibitors and estimation of their isoelectric points. 2 2 K. Sudheendra, unpublished data. The use of single side-coated x-ray films will obviate the need to remove the coating on one side of the two side-coated film. The inhibitor activity bands are clearly visible even without removing the gelatin coating on the other side of the film. However, removal of coating on the other side of the film improves the contrast for developing the x-ray film.

With exposure to x-ray film and rinsing the gel, the protease concentration goes down, and lower inhibitory activity bands become visible. However, under these conditions higher inhibitory activity bands appear much thicker and broader. So exposing the same gel a few times to fresh films allows the detection of even closely spaced, high activity bands in the beginning and the low activity bands in the later exposures. High activity inhibitor bands can be resolved by increasing, and low activity inhibitor bands by decreasing, gel-x-r ay film incubation time. Even after several exposures, the same gel can be incubated again in protease solution, and inhibitor bands can be visualized.

However, visualization of poorly resolved or closely spaced high and low inhibitory activity bands will be difficult with this method. Protease inhibitors can be detected using photographic paper instead of x-ray film. However, paper needs to be incubated with the x-ray film for a longer time. X-ray film is more sensitive than photographic paper.

Based on our experience with this assay to detect protease inhibitors, there appears to be little variation between different lots of films (x-ray). The results are immediately available after electrophoresis and are rapid and reproducible (after electrophoresis the results can be observed on x-ray film within 1 h). Also this method is inexpensive a box of 25 films (20 × 25 cm) can accommodate up to 50 assays ($5.00 per box). The presence of a well defined end point and the simplicity of the experiment allows this experiment to be carried out by undergraduate and graduate students.


محتويات

Ion chromatography has advanced through the accumulation of knowledge over a course of many years. Starting from 1947, Spedding and Powell used displacement ion-exchange chromatography for the separation of the rare earths. Additionally, they showed the ion-exchange separation of 14N and 15N isotopes in ammonia. At the start of the 1950s, Kraus and Nelson demonstrated the use of many analytical methods for metal ions dependent on their separation of their chloride, fluoride, nitrate or sulfate complexes by anion chromatography. Automatic in-line detection was progressively introduced from 1960 to 1980 as well as novel chromatographic methods for metal ion separations. A groundbreaking method by Small, Stevens and Bauman at Dow Chemical Co. unfolded the creation of the modern ion chromatography. Anions and cations could now be separated efficiently by a system of suppressed conductivity detection. In 1979, a method for anion chromatography with non-suppressed conductivity detection was introduced by Gjerde et al. Following it in 1980, was a similar method for cation chromatography. [10]

As a result, a period of extreme competition began within the IC market, with supporters for both suppressed and non-suppressed conductivity detection. This competition led to fast growth of new forms and the fast evolution of IC. [11] A challenge that needs to be overcome in the future development of IC is the preparation of highly efficient monolithic ion-exchange columns and overcoming this challenge would be of great importance to the development of IC. [12]

The boom of Ion exchange chromatography primarily began between 1935–1950 during World War II and it was through the "Manhattan project" that applications and IC were significantly extended. Ion chromatography was originally introduced by two English researchers, agricultural Sir Thompson and chemist J T Way. The works of Thompson and Way involved the action of water-soluble fertilizer salts, ammonium sulfate and potassium chloride. These salts could not easily be extracted from the ground due to the rain. They performed ion methods to treat clays with the salts, resulting in the extraction of ammonia in addition to the release of calcium. [13] [ مصدر غير موثوق؟ ] It was in the fifties and sixties that theoretical models were developed for IC for further understanding and it was not until the seventies that continuous detectors were utilized, paving the path for the development from low-pressure to high-performance chromatography. Not until 1975 was "ion chromatography" established as a name in reference to the techniques, and was thereafter used as a name for marketing purposes. Today IC is important for investigating aqueous systems, such as drinking water. It is a popular method for analyzing anionic elements or complexes that help solve environmentally relevant problems. Likewise, it also has great uses in the semiconductor industry.

Because of the abundant separating columns, elution systems, and detectors available, chromatography has developed into the main method for ion analysis. [14]

When this technique was initially developed, it was primarily used for water treatment. Since 1935, ion exchange chromatography rapidly manifested into one of the most heavily leveraged techniques, with its principles often being applied to majority of fields of chemistry, including distillation, adsorption, and filtration. [15]

Ion-exchange chromatography separates molecules based on their respective charged groups. Ion-exchange chromatography retains analyte molecules on the column based on coulombic (ionic) interactions. The ion exchange chromatography matrix consists of positively and negatively charged ions. [16] Essentially, molecules undergo electrostatic interactions with opposite charges on the stationary phase matrix. The stationary phase consists of an immobile matrix that contains charged ionizable functional groups or ligands. [17] The stationary phase surface displays ionic functional groups (R-X) that interact with analyte ions of opposite charge. To achieve electroneutrality, these inert charges couple with exchangeable counterions in the solution. Ionizable molecules that are to be purified compete with these exchangeable counterions for binding to the immobilized charges on the stationary phase. These ionizable molecules are retained or eluted based on their charge. Initially, molecules that do not bind or bind weakly to the stationary phase are first to wash away. Altered conditions are needed for the elution of the molecules that bind to the stationary phase. The concentration of the exchangeable counterions, which competes with the molecules for binding, can be increased or the pH can be changed. A change in pH affects the charge on the particular molecules and, therefore, alters binding. The molecules then start eluting out based on the changes in their charges from the adjustments. Further such adjustments can be used to release the protein of interest. Additionally, concentration of counterions can be gradually varied to separate ionized molecules. This type of elution is called gradient elution. On the other hand, step elution can be used in which the concentration of counterions are varied in one step. [1] This type of chromatography is further subdivided into cation exchange chromatography and anion-exchange chromatography. Positively charged molecules bind to cation exchange resins while negatively charged molecules bind to anion exchange resins. [18] The ionic compound consisting of the cationic species M+ and the anionic species B- can be retained by the stationary phase.

Cation exchange chromatography retains positively charged cations because the stationary phase displays a negatively charged functional group:

Anion exchange chromatography retains anions using positively charged functional group:

Note that the ion strength of either C+ or A- in the mobile phase can be adjusted to shift the equilibrium position, thus retention time.

The ion chromatogram shows a typical chromatogram obtained with an anion exchange column.

Before ion-exchange chromatography can be initiated, it must be equilibrated. The stationary phase must be equilibrated to certain requirements that depend on the experiment that you are working with. Once equilibrated, the charged ions in the stationary phase will be attached to its opposite charged exchangeable ions. Exchangeable ions such as Cl- or Na+. Next, a buffer should be chosen in which the desired protein can bind to. After equilibration, the column needs to be washed. The washing phase will help elute out all impurities that does not bind to the matrix while the protein of interest remains bounded. This sample buffer needs to have the same pH as the buffer used for equilibration to help bind the desired proteins. Uncharged proteins will be eluted out of the column at a similar speed of the buffer flowing through the column. Once the sample has been loaded onto to the column and the column has been washed with the buffer to elute out all non-desired proteins, elution is carried out to elute the desired proteins that are bound to the matrix. Bound proteins are eluted out by utilizing a gradient of linearly increasing salt concentration. With increasing ionic strength of the buffer, the salt ions will compete with the desired proteins in order to bind to charged groups on the surface of the medium. This will cause desired proteins to be eluted out of the column. Proteins that have a low net charge will be eluted out first as the salt concentration increases causing the ionic strength to increase. Proteins with high net charge will need a higher ionic strength for them to be eluted out of the column. [16] It is possible to perform ion exchange chromatography in bulk, on thin layers of medium such as glass or plastic plates coated with a layer of the desired stationary phase, or in chromatography columns. Thin layer chromatography or column chromatography share similarities in that they both act within the same governing principles there is constant and frequent exchange of molecules as the mobile phase travels along the stationary phase. It is not imperative to add the sample in minute volumes as the predetermined conditions for the exchange column have been chosen so that there will be strong interaction between the mobile and stationary phases. Furthermore, the mechanism of the elution process will cause a compartmentalization of the differing molecules based on their respective chemical characteristics. This phenomenon is due to an increase in salt concentrations at or near the top of the column, thereby displacing the molecules at that position, while molecules bound lower are released at a later point when the higher salt concentration reaches that area. These principles are the reasons that ion exchange chromatography is an excellent candidate for initial chromatography steps in a complex purification procedure as it can quickly yield small volumes of target molecules regardless of a greater starting volume. [2]

Comparatively simple devices are often used to apply counterions of increasing gradient to a chromatography column. Counterions such as copper (II) are chosen most often for effectively separating peptides and amino acids through complex formation. [19]

A simple device can be used to create a salt gradient. Elution buffer is consistently being drawn from the chamber into the mixing chamber, thereby altering its buffer concentration. Generally, the buffer placed into the chamber is usually of high initial concentration, whereas the buffer placed into the stirred chamber is usually of low concentration. As the high concentration buffer from the left chamber is mixed and drawn into the column, the buffer concentration of the stirred column gradually increase. Altering the shapes of the stirred chamber, as well as of the limit buffer, allows for the production of concave, linear, or convex gradients of counterion.

A multitude of different mediums are used for the stationary phase. Among the most common immobilized charged groups used are trimethylaminoethyl (TAM), triethylaminoethyl (TEAE), diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl (QAE), aminoethyl (AE), diethylaminoethyl (DEAE), sulpho (S), sulphomethyl (SM), sulphopropyl (SP), carboxy (C), and carboxymethyl (CM). [1]

Successful packing of the column is an important aspect of ion chromatography. Stability and efficiency of a final column depends on packing methods, solvent used, and factors that affect mechanical properties of the column. In contrast to early inefficient dry- packing methods, wet slurry packing, in which particles that are suspended in an appropriate solvent are delivered into a column under pressure, shows significant improvement. Three different approaches can be employed in performing wet slurry packing: the balanced density method (solvent’s density is about that of porous silica particles), the high viscosity method (a solvent of high viscosity is used), and the low viscosity slurry method (performed with low viscosity solvents). [20]

Polystyrene is used as a medium for ion- exchange. It is made from the polymerization of styrene with the use of divinylbenzene and benzoyl peroxide. Such exchangers form hydrophobic interactions with proteins which can be irreversible. Due to this property, polystyrene ion exchangers are not suitable for protein separation. They are used on the other hand for the separation of small molecules in amino acid separation and removal of salt from water. Polystyrene ion exchangers with large pores can be used for the separation of protein but must be coated with a hydrophilic substance. [21]

Cellulose based medium can be used for the separation of large molecules as they contain large pores. Protein binding in this medium is high and has low hydrophobic character. DEAE is an anion exchange matrix that is produced from a positive side group of diethylaminoethyl bound to cellulose or Sephadex. [22]

Agarose gel based medium contain large pores as well but their substitution ability is lower in comparison to dextrans. The ability of the medium to swell in liquid is based on the cross-linking of these substances, the pH and the ion concentrations of the buffers used. [21]

Incorporation of high temperature and pressure allows a significant increase in the efficiency of ion chromatography, along with a decrease in time. Temperature has an influence of selectivity due to its effects on retention properties. The retention factor (ك = (رص g − رم g )/(رم g − رext)) increases with temperature for small ions, and the opposite trend is observed for larger ions. [23] [24]

Despite ion selectivity in different mediums, further research is being done to perform ion exchange chromatography through the range of 40–175 °C. [25]

An appropriate solvent can be chosen based on observations of how column particles behave in a solvent. Using an optical microscope, one can easily distinguish a desirable dispersed state of slurry from aggregated particles. [20]

A "strong" ion exchanger will not lose the charge on its matrix once the column is equilibrated and so a wide range of pH buffers can be used. "Weak" ion exchangers have a range of pH values in which they will maintain their charge. If the pH of the buffer used for a weak ion exchange column goes out of the capacity range of the matrix, the column will lose its charge distribution and the molecule of interest may be lost. [26] Despite the smaller pH range of weak ion exchangers, they are often used over strong ion exchangers due to their having greater specificity. In some experiments, the retention times of weak ion exchangers are just long enough to obtain desired data at a high specificity. [27]

Resins (often termed 'beads') of ion exchange columns may include functional groups such as weak/strong acids and weak/strong bases. There are also special columns that have resins with amphoteric functional groups that can exchange both cations and anions. [28] Some examples of functional groups of strong ion exchange resins are quaternary ammonium cation (Q), which is an anion exchanger, and sulfonic acid (S, -SO2OH), which is a cation exchanger. [29] These types of exchangers can maintain their charge density over a pH range of 0–14. Examples of functional groups of Weak ion exchange resins include diethylaminoethyl (DEAE, -C2ح4N(CH2ح5)2), which is an anion exchanger, and carboxymethyl (CM, -CH2-COOH), [30] which is a cation exchanger. These two types of exchangers can maintain the charge density of their columns over a pH range of 5–9. [ بحاجة لمصدر ]

In ion chromatography, the interaction of the solute ions and the stationary phase based on their charges determines which ions will bind and to what degree. When the stationary phase features positive groups which attracts anions, it is called an anion exchanger when there are negative groups on the stationary phase, cations are attracted and it is a cation exchanger. [31] The attraction between ions and stationary phase also depends on the resin, organic particles used as ion exchangers.

Each resin features relative selectivity which varies based on the solute ions present who will compete to bind to the resin group on the stationary phase. The selectivity coefficient, the equivalent to the equilibrium constant, is determined via a ratio of the concentrations between the resin and each ion, however, the general trend is that ion exchangers prefer binding to the ion with a higher charge, smaller hydrated radius, and higher polarizability, or the ability for the electron cloud of an ion to be disrupted by other charges. [32] Despite this selectivity, excess amounts of an ion with a lower selectivity introduced to the column would cause the lesser ion to bind more to the stationary phase as the selectivity coefficient allows fluctuations in the binding reaction that takes place during ion exchange chromatography.

Following table shows the commonly used ion exchangers [33]

Sr. No اسم نوع المجموعة الوظيفية
1 DEAE Cellulose (Anion exchanger) Weakly basic DEAE (Diethylaminoethyl)
2 QAE Sephadex (Anion exchanger) Strongly basic QAE (Quaternary aminoethyl)
3 Q Sepharose (Anion exchanger) Strongly basic Q (Quaternary ammonium)
4 CM- Cellulose (Cation exchanger) Weakly acidic CM (Carboxymethyl)
5 SP Sepharose (Cation exchanger) Strongly acidic SP (Sulfopropyl)
6 SOURCE S (Cation exchanger) Strongly acidic S (Methyl sulfate)

A sample is introduced, either manually or with an autosampler, into a sample loop of known volume. A buffered aqueous solution known as the mobile phase carries the sample from the loop onto a column that contains some form of stationary phase material. This is typically a resin or gel matrix consisting of agarose or cellulose beads with covalently bonded charged functional groups. Equilibration of the stationary phase is needed in order to obtain the desired charge of the column. If the column is not properly equilibrated the desired molecule may not bind strongly to the column. The target analytes (anions or cations) are retained on the stationary phase but can be eluted by increasing the concentration of a similarly charged species that displaces the analyte ions from the stationary phase. For example, in cation exchange chromatography, the positively charged analyte can be displaced by adding positively charged sodium ions. The analytes of interest must then be detected by some means, typically by conductivity or UV/visible light absorbance.

Control an IC system usually requires a chromatography data system (CDS). In addition to IC systems, some of these CDSs can also control gas chromatography (GC) and HPLC.

A type of ion exchange chromatography, membrane exchange [34] [35] is a relatively new method of purification designed to overcome limitations of using columns packed with beads. Membrane Chromatographic [36] [37] devices are cheap to mass-produce and disposable unlike other chromatography devices that require maintenance and time to revalidate. There are three types of membrane absorbers that are typically used when separating substances. The three types are flat sheet, hollow fibre, and radial flow. The most common absorber and best suited for membrane chromatography is multiple flat sheets because it has more absorbent volume. It can be used to overcome mass transfer limitations [38] and pressure drop, [39] making it especially advantageous for isolating and purifying viruses, plasmid DNA, and other large macromolecules. The column is packed with microporous membranes with internal pores which contain adsorptive moieties that can bind the target protein. Adsorptive membranes are available in a variety of geometries and chemistry which allows them to be used for purification and also fractionation, concentration, and clarification in an efficiency that is 10 fold that of using beads. [40] Membranes can be prepared through isolation of the membrane itself, where membranes are cut into squares and immobilized. A more recent method involved the use of live cells that are attached to a support membrane and are used for identification and clarification of signaling molecules. [41]

Ion exchange chromatography can be used to separate proteins because they contain charged functional groups. The ions of interest (in this case charged proteins) are exchanged for another ions (usually H + ) on a charged solid support. The solutes are most commonly in a liquid phase, which tends to be water. Take for example proteins in water, which would be a liquid phase that is passed through a column. The column is commonly known as the solid phase since it is filled with porous synthetic particles that are of a particular charge. These porous particles are also referred to as beads, may be aminated (containing amino groups) or have metal ions in order to have a charge. The column can be prepared using porous polymers, for macromolecules over 100,000 the optimum size of the porous particle is about 1 μm 2 . This is because slow diffusion of the solutes within the pores does not restrict the separation quality. [42] The beads containing positively charged groups, which attract the negatively charged proteins, are commonly referred to as anion exchange resins. The amino acids that have negatively charged side chains at pH 7 (pH of water) are glutamate and aspartate. The beads that are negatively charged are called cation exchange resins, as positively charged proteins will be attracted. The amino acids that have positively charged side chains at pH 7 are lysine, histidine and arginine. [43]

The isoelectric point is the pH at which a compound - in this case a protein - has no net charge. A protein’s isoelectric point or PI can be determined using the pKa of the side chains, if the amino (positive chain) is able to cancel out the carboxyl (negative) chain, the protein would be at its PI. Using buffers instead of water for proteins that do not have a charge at pH 7, is a good idea as it enables the manipulation of pH to alter ionic interactions between the proteins and the beads. [44] Weakly acidic or basic side chains are able to have a charge if the pH is high or low enough respectively. Separation can be achieved based on the natural isoelectric point of the protein. Alternatively a peptide tag can be genetically added to the protein to give the protein an isoelectric point away from most natural proteins (e.g., 6 arginines for binding to a cation-exchange resin or 6 glutamates for binding to an anion-exchange resin such as DEAE-Sepharose).

Elution by increasing ionic strength of the mobile phase is more subtle. It works because ions from the mobile phase interact with the immobilized ions on the stationary phase, thus "shielding" the stationary phase from the protein, and letting the protein elute.

Elution from ion-exchange columns can be sensitive to changes of a single charge- chromatofocusing. Ion-exchange chromatography is also useful in the isolation of specific multimeric protein assemblies, allowing purification of specific complexes according to both the number and the position of charged peptide tags. [45] [46]

Gibbs–Donnan effect Edit

In ion exchange chromatography, the Gibbs–Donnan effect is observed when the pH of the applied buffer and the ion exchanger differ, even up to one pH unit. For example, in anion-exchange columns, the ion exchangers repeal protons so the pH of the buffer near the column differs is higher than the rest of the solvent. [47] As a result, an experimenter has to be careful that the protein(s) of interest is stable and properly charged in the "actual" pH.

This effect comes as a result of two similarly charged particles, one from the resin and one from the solution, failing to distribute properly between the two sides there is a selective uptake of one ion over another. [48] [49] For example, in a sulphonated polystyrene resin, a cation exchange resin, the chlorine ion of a hydrochloric acid buffer should equilibrate into the resin. However, since the concentration of the sulphonic acid in the resin is high, the hydrogen of HCl has no tendency to enter the column. This, combined with the need of electroneutrality, leads to a minimum amount of hydrogen and chlorine entering the resin. [49]

Clinical utility Edit

A use of ion chromatography can be seen in the argentation ion chromatography. [ بحاجة لمصدر ] Usually, silver and compounds containing acetylenic and ethylenic bonds have very weak interactions. This phenomenon has been widely tested on olefin compounds. The ion complexes the olefins make with silver ions are weak and made based on the overlapping of pi, sigma, and d orbitals and available electrons therefore cause no real changes in the double bond. This behavior was manipulated to separate lipids, mainly fatty acids from mixtures in to fractions with differing number of double bonds using silver ions. The ion resins were impregnated with silver ions, which were then exposed to various acids (silicic acid) to elute fatty acids of different characteristics.

Detection limits as low as 1 μM can be obtained for alkali metal ions. [50] It may be used for measurement of HbA1c, porphyrin and with water purification. Ion Exchange Resins(IER) have been widely used especially in medicines due to its high capacity and the uncomplicated system of the separation process. One of the synthetic uses is to use Ion Exchange Resins for kidney dialysis. This method is used to separate the blood elements by using the cellulose membraned artificial kidney. [51]

Another clinical application of ion chromatography is in the rapid anion exchange chromatography technique used to separate creatine kinase (CK) isoenzymes from human serum and tissue sourced in autopsy material (mostly CK rich tissues were used such as cardiac muscle and brain). [ بحاجة لمصدر ] These isoenzymes include MM, MB, and BB, which all carry out the same function given different amino acid sequences. The functions of these isoenzymes are to convert creatine, using ATP, into phosphocreatine expelling ADP. Mini columns were filled with DEAE-Sephadex A-50 and further eluted with tris- buffer sodium chloride at various concentrations (each concentration was chosen advantageously to manipulate elution). Human tissue extract was inserted in columns for separation. All fractions were analyzed to see total CK activity and it was found that each source of CK isoenzymes had characteristic isoenzymes found within. Firstly, CK- MM was eluted, then CK-MB, followed by CK-BB. Therefore, the isoenzymes found in each sample could be used to identify the source, as they were tissue specific.

Using the information from results, correlation could be made about the diagnosis of patients and the kind of CK isoenzymes found in most abundant activity. From the finding, about 35 out of 71 patients studied suffered from heart attack (myocardial infarction) also contained an abundant amount of the CK-MM and CK-MB isoenzymes. Findings further show that many other diagnosis including renal failure, cerebrovascular disease, and pulmonary disease were only found to have the CK-MM isoenzyme and no other isoenzyme. The results from this study indicate correlations between various diseases and the CK isoenzymes found which confirms previous test results using various techniques. Studies about CK-MB found in heart attack victims have expanded since this study and application of ion chromatography.

Industrial applications Edit

Since 1975 ion chromatography has been widely used in many branches of industry. The main beneficial advantages are reliability, very good accuracy and precision, high selectivity, high speed, high separation efficiency, and low cost of consumables. The most significant development related to ion chromatography are new sample preparation methods improving the speed and selectivity of analytes separation lowering of limits of detection and limits of quantification extending the scope of applications development of new standard methods miniaturization and extending the scope of the analysis of a new group of substances. Allows for quantitative testing of electrolyte and proprietary additives of electroplating baths. [52] It is an advancement of qualitative hull cell testing or less accurate UV testing. Ions, catalysts, brighteners and accelerators can be measured. [52] Ion exchange chromatography has gradually become a widely known, universal technique for the detection of both anionic and cationic species. Applications for such purposes have been developed, or are under development, for a variety of fields of interest, and in particular, the pharmaceutical industry. The usage of ion exchange chromatography in pharmaceuticals has increased in recent years, and in 2006, a chapter on ion exchange chromatography was officially added to the United States Pharmacopia-National Formulary (USP-NF). Furthermore, in 2009 release of the USP-NF, the United States Pharmacopia made several analyses of ion chromatography available using two techniques: conductivity detection, as well as pulse amperometric detection. Majority of these applications are primarily used for measuring and analyzing residual limits in pharmaceuticals, including detecting the limits of oxalate, iodide, sulfate, sulfamate, phosphate, as well as various electrolytes including potassium, and sodium. In total, the 2009 edition of the USP-NF officially released twenty eight methods of detection for the analysis of active compounds, or components of active compounds, using either conductivity detection or pulse amperometric detection. [53]

Drug development Edit

There has been a growing interest in the application of IC in the analysis of pharmaceutical drugs. IC is used in different aspects of product development and quality control testing. For example, IC is used to improve stabilities and solubility properties of pharmaceutical active drugs molecules as well as used to detect systems that have higher tolerance for organic solvents. IC has been used for the determination of analytes as a part of a dissolution test. For instance, calcium dissolution tests have shown that other ions present in the medium can be well resolved among themselves and also from the calcium ion. Therefore, IC has been employed in drugs in the form of tablets and capsules in order to determine the amount of drug dissolve with time. [54] IC is also widely used for detection and quantification of excipients or inactive ingredients used in pharmaceutical formulations. Detection of sugar and sugar alcohol in such formulations through IC has been done due to these polar groups getting resolved in ion column. IC methodology also established in analysis of impurities in drug substances and products. Impurities or any components that are not part of the drug chemical entity are evaluated and they give insights about the maximum and minimum amounts of drug that should be administered in a patient per day. [55]


شاهد الفيديو: Фактите за алкохола, които се оказаха ЛЪЖА! (أغسطس 2022).