معلومة

ما هي الخيارات الموجودة للكشف الكمي عن نشاط الإنزيم في أنسجة الحشرات غير النموذجية؟

ما هي الخيارات الموجودة للكشف الكمي عن نشاط الإنزيم في أنسجة الحشرات غير النموذجية؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

شخص التطور / علم الجينوم هنا: ما هي الخيارات لقياس نشاط أو وجود فئات واسعة من الإنزيمات - مثل البيروكسيدات أو الكاتلاز - النشطة في نسيج معين (في حشرة غير نموذجية)؟

أفهم أن الأجسام المضادة ، على سبيل المثال ELISA ، قد يكون نهجًا واحدًا ولكني لست متأكدًا مما إذا كان هو الخيار الأفضل أو ما هي البدائل. هل أي نهج قائمة على التسلسل متاحة ، إذا كنت أعرف تسلسل الببتيد (أو على الأقل مجال وظيفة معين ، مثل Pfam ID)؟


الحدود في علم وظائف الأعضاء

انتماءات المحرر والمراجعين هي الأحدث التي يتم توفيرها في ملفات تعريف بحث Loop وقد لا تعكس موقفهم في وقت المراجعة.



مشاركه فى

خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


I. مقدمة

قبل عشرين عامًا ، تم ترتيب ونشر النسخة الأولى من الجينوم البشري (Venter وآخرون، 2001). منذ ذلك الحين ، أصبحت تقنيات التسلسل ومجموعات بيانات omics التي تنتجها لا غنى عنها للبحث البيولوجي. أدى التقدم ، على مدار العقدين الماضيين ، من تسلسل Sanger إلى تسلسل الجيل التالي (NGS) ، ومؤخراً ، التسلسل طويل القراءة للحمض النووي والحمض النووي الريبي إلى خفض التكلفة وتحسين إمكانية الوصول والتقدم التكنولوجي وتوافر الأدوات والموارد الداعمة . تم تطوير العديد من حزم البرامج مفتوحة المصدر وخطوط أنابيب الشرح ، ليس فقط لعلم الجينوم ولكن أيضًا للعائلة الأوسع من تخصصات omics بما في ذلك البروتينات والأيض (على سبيل المثال الجليكوميكس والدهون) وغيرها. لأغراض هذه المراجعة ، يشير مصطلح "omics" بشكل صارم إلى مناهج علم الجينوم وعلم النسخ والبروتيوميات التي أصبحت شائعة بشكل متزايد في أدبيات الالتصاق الحيوي على مدار العقد الماضي. لا يشكل توصيف الجينات أو البروتينات المنفردة بمعزل عن علم الجينوميات أو البروتينات. تنتج دراسات Omics بيانات للنظام بأكمله قيد التحقيق ، والتي يتم تنقيحها بعد ذلك بوسائل مختلفة للكشف عن الجينات أو البروتينات ذات الأهمية ووظائفها. ترانسكريبتوميكس عبر يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) طريقة "من أسفل إلى أعلى" لتحديد البروتينات المفترضة بناءً على مبدأ استخدام جزيئات الحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) لترجمة الجينات إلى بروتينات بشكل كمي إلى حد ما. يتم بعد ذلك إفراز البروتينات في حالة غير معدلة ، أو كمتغيرات معدلة بعد الترجمة والتي يمكن التعرف عليها من خلال البروتينات. يمكن استهداف الجينات ذات الأهمية بوسائل مختلفة ، ولكن في كثير من الأحيان عن طريق الجمع بين طرق أخذ عينات الأنسجة التفاضلية والتحليل والتنبؤ.

في وقت كتابة هذا التقرير ، كان أكثر من 55000 سجل جينوم (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/) متاحة للجمهور على خوادم المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI). عدد مجموعات بيانات النسخ والبروتيوم المتاحة للجمهور أقل وضوحًا بسبب ترسيب البيانات في مجموعة متنوعة من المحفوظات. ومع ذلك ، فإن الأرقام الإجمالية لهذه الأنواع من مجموعات البيانات هي أيضًا بالآلاف. على سبيل المثال ، البحث في أرشيف NCBI SRA بالكلمة الرئيسية ، "transcriptomic" يوفر روابط لأكثر من 5000 BioProjects وأكثر من 11000 مجموعة بيانات بروتينية متاحة على خادم EMBL-EBI PRIDE. تمثل هذه الأرقام مثالاً على "ثورة omics في جميع أنحاء العلوم الحيوية ، من دراسة الأمراض البشرية إلى إنتاج نبات المحاصيل والاكتشاف المركب الجديد (فوكوشيما) وآخرون. ، 2009 تاناكا ، 2010). لذلك ، ليس من المستغرب أن يتم اعتماد نهج omics أيضًا في إطار أبحاث التصاق الحيوي ، وقد حان الوقت للتساؤل عن تأثير ذلك على فهمنا الأساسي لآليات الالتحام الحيوي.

التصاق عبر قد يكون اللاصق الحيوي الكيميائي المفرز إما قابلاً للعكس أو لا رجوع فيه ، مما يسهل التعلق المؤقت أو الدائم (Hennebert وآخرون., 2015ب Lengerer & Ladurner ، 2018). تستخدم العديد من الأنواع الالتصاق للعمليات الأساسية التي يعتمد عليها بقاؤها. من المحتمل أن يكون الالتصاق البيولوجي قد تطور عدة مرات بشكل مستقل ، وفي كل حالة ، كان تكيفًا لعملية فسيولوجية أخرى موجودة مسبقًا. لذلك ، في حين أن آليات الالتحام البيولوجي متنوعة ومعقدة ، إلا أنها متجذرة أيضًا في العمليات الفسيولوجية الأساسية التي يمكن استجوابها باستخدام النهج القائمة على أوميكس. في الواقع ، من الممكن أن "دراسات الالتصاق المستندة إلى omics يمكن أن تحدد إما العمليات الفسيولوجية القديمة ، مثل إفراز اللعاب (Sehnal & Akai ، 1990 Yan وآخرون. ، 2020) ، والتي نشأ منها الالتصاق في سلالات مختلفة ، أو أوجه التشابه بين السلالات من خلال وجود المجالات الجينية والبروتينية الوظيفية. لا يتم توفير الخصائص المرغوبة للواجهات اللاصقة الحيوية في الطبيعة عن طريق الكيمياء وحدها ، بالطبع. يسمى "ويت" (Wilhelm وآخرون. ، 2017) و "جاف" (Labonte وآخرون. ، 2016) تعتمد أنظمة الالتصاق على الميكانيكا لتحسين أدائها: تعديل منطقة التلامس اللاصقة (كروفورد وآخرون. ، 2016) ، وتبديد الطاقة تحت الضغط في الميكرو- (Cohen وآخرون. ، 2019) والمقاييس النانوية (Phang وآخرون، 2010) وتمكين الانفصال الخاضع للرقابة (Federle & Labonte ، 2019). المقياس مهم ، لأن الاستقراء من التجارب على المقياس النانوي لن يعكس على الأرجح الخصائص الحقيقية على المقاييس الدقيقة أو الكبيرة (ديزموند) وآخرون. ، 2015). تقع هذه الظواهر الميكانيكية خارج نطاق هذه المراجعة ، والتي ينصب تركيزها على تحديد وتوصيف المواد السرية.

تحتوي المواد اللاصقة التي تفرزها اللافقاريات المائية على البروتينات والجليكان (السكريات) والدهون بنسب متفاوتة. غالبًا ما تكون المعادن متورطة ولها دور فعال في الربط المتشابك (Richter، Grunwald & von Byern، 2018). كان الدافع وراء الاهتمام بالمواد اللاصقة الحيوية إلى حد كبير هو الطلب على المواد اللاصقة المحاكية الحيوية الجديدة بقدرات تتجاوز المواد اللاصقة الاصطناعية المتاحة حاليًا للمستهلكين. يعتبر فهم الآليات التي تتحكم في الالتصاق في الأنظمة المائية أمرًا أساسيًا في تطوير المواد اللاصقة المستوحاة من المواد الحيوية للبناء والمواد الحيوية والصناعات التحويلية ، وكذلك للعلاجات السريرية (Palacio & Bhushan ، 2012). العديد من المواد اللاصقة الاصطناعية الحالية تضر بالأسطح التي يتم تطبيقها عليها وهي ملوثة أو سامة أو خطرة على البيئة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن معظم تلك المتوفرة حاليًا لها فعالية منخفضة على الأسطح الرطبة. وبالتالي ، فإن الاستبدال بمواد لاصقة مستوحاة من الحيوية يمكن أن يوفر بدائل أكثر ملاءمة واستدامة (ريختر وآخرون., 2018 ).

تمت مراجعة المواد اللاصقة البحرية ذات الاهتمام بالمحاكاة الحيوية مؤخرًا بواسطة Almeida و Reis & Silva (2020). الغرض من هذه المراجعة ليس تقديم نظرة عامة مماثلة تركز على التطبيق. بدلاً من ذلك ، نهدف إلى تحديد الاتجاهات في أبحاث الالتحام الحيوي التي أبلغت الفهم الحالي ونسأل ، "أين بعد ذلك؟". إن التركيز المتجدد على البيولوجيا الأساسية لأنظمة الالتصاق المائي مرحب به وكان مدفوعًا جزئيًا بثورة omics. ولكن حان الوقت الآن للنظر إلى ما هو أبعد من استخدام هذه البيانات ، لتحديد طرق بناء الدقة والاتساق في التحليلات ، وللتأكد من أن استنتاجات الدراسات كافية وذات مغزى. لذلك تغطي هذه المقالة نقاط القوة والفرص والقيود والتحديات المستقبلية التي تقدمها "omics في سياق بحث bioadhesion". لتوضيح بعض النقاط الرئيسية بشكل أكثر فعالية ، قمنا بتضمين البيانات والتحليلات الأصلية عند الاقتضاء.


الكواشف والحلول

أول حبلا عازلة ، 5 ×

  • 375 ملي بوكل
  • 15 ملي مجكل2
  • 250 ملي تريس · الكلور ، الرقم الهيدروجيني 8.3
  • يخزن لمدة تصل إلى 1 سنة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية

عازلة pfu-sso7d ، 5 ×

  • 0.5 ملغ / مل من الألبومين المصل البقري (BSA Sigma B6917)
  • 50 ملي بوكل
  • 10 ملم MgSO4
  • 50 ملي خلات الأمونيوم
  • 150 ملي تريس · الكلور ، الرقم الهيدروجيني 10
  • 0.5٪ (حجم / حجم) Triton X-100
  • تخزين ما يصل إلى 1 سنة عند -20 درجة مئوية

محلول سترات الصوديوم ، درجة الحموضة 6.4 ، 0.1 م

شراء مونوهيدرات حامض الستريك (210.14 جم / مول) وثنائي سترات الصوديوم (294.12 جم / مول). تحضير 80 مل من الماء المقطر في وعاء مناسب. أضف 0.21 جم من مونوهيدرات حامض الستريك إلى المحلول. أضف 2.65 جم من ثنائي سترات الصوديوم إلى المحلول. ضبط الحل إلى الرقم الهيدروجيني المطلوب النهائي باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم. أضف الماء المقطر حتى يصبح الحجم 0.1 لتر.


استراتيجيات خالية من الخلايا للتصنيع الحيوي للمواد المستدامة

لقد طورت الخلايا والكائنات الحية إنزيمات شديدة التعقيد وعمليات التمثيل الغذائي التي تولد كيمياء حيوية متنوعة للغاية. قد يؤدي استكشاف هذه الكيمياء الحيوية الطبيعية إلى تطورات أساسية مهمة في فهمنا لتوليف المنتجات الطبيعية. تعتبر الاكتشافات التأسيسية في الجينوميات الوظيفية ، والتمثيل الغذائي الخلوي ، وتوليف المنتجات الطبيعية مهمة أيضًا ، لأنها قد تلهم تصميمات جديدة لمسارات التخليق الحيوي لإنتاج المواد البيولوجية. في البيولوجيا التركيبية ، يمكن لنهج الهندسة الأيضية الخالية من الخلايا (CF-ME) إعادة تشكيل مسارات التخليق الحيوي بالكامل باستخدام إما مستخلصات خلوية من أنواع متنوعة وخلايا مُهندَسة و / أو إنزيمات مؤتلفة مركبة خالية من الخلايا (Karim and Jewett، 2018 Martin et al.، 2018 Yim et al.، 2019 Bowie et al.، 2020) (الشكل 1). أيضًا ، يمكن الجمع بين تخليق البروتين الخالي من الخلايا وتفاعلات التحول الأحيائي لمستخلص الخلايا لإنشاء تفاعلات خالية من الخلايا أكثر تعقيدًا (كريم وجويت ، 2018 Kelwick et al. ، 2018). ميزة أخرى مهمة في استخدام الأساليب الخالية من الخلايا هي أنه يمكن تحديد اختناقات تفاعل المسار ، من خلال الإضافة المباشرة للإنزيمات المؤتلفة المطلوبة ، أو العوامل المساعدة للإنزيم أو الركائز الكيميائية اللازمة لكل مرحلة من مسار التخليق الحيوي (Dudley et al. ، 2015) ). تم نشر استراتيجيات CF-ME التوافقية المعقدة بشكل متزايد ، جنبًا إلى جنب مع الأتمتة عالية الإنتاجية ، وعمق البيانات العميقة وتصميم التجارب (DoE) لتحسين التفاعل الخالي من الخلايا (Caschera et al.، 2018 Jiang et al.، 2018 Dopp et آل ، 2019). أدت هذه التطورات إلى تحسن كبير في جدوى إعادة البناء وتحسين المسارات الكيميائية أو الطبيعية للمنتج الحيوي خلال أطر زمنية قصيرة (Dudley et al.، 2015 Korman et al.، 2017 Moore et al.، 2017a Wilding et al.، 2018).

تم أيضًا توجيه مناهج البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا نحو من جديد الإنتاج الحيوي للمواد البيولوجية ، بما في ذلك البوليمرات الحيوية أو مونومراتها والمواد السليلوزية والجسيمات النانوية (الجدول 1). ومع ذلك ، كان الحد الأقصى من غلات الإنتاج الحيوي الخالية من الخلايا أو كفاءات التفاعل للعديد من المواد المبلغ عنها منخفضة أو غير محددة بشكل عام. تتضمن أمثلة المواد المنتجة الخالية من الخلايا وعوائدها الإنتاجية القصوى وكفاءة التفاعل المبلغ عنها من السليلوز الحيوي (3.726 & # x00B1 0.05 جم / لتر 57.68٪) (Ullah et al. ، 2015) ، الكيتين (لم يُذكر العائد) (Jaworski et al.، 1963 Endoh et al.، 2006)، lactic acid (6.6 & # x00B1 0.1 mM 47.4 & # x00B1 3.9٪) (Kopp et al.، 2019)، gold nanoparticles (العائد غير مذكور) (Chauhan et al. 2011 Krishnan et al.، 2016)، (ص) -3-hydroxybutyrate-CoA (32.87 & # x00B1 6.58 & # x03BCM) (Kelwick et al. ، 2018) ، وجسيمات الفضة النانوية (المحصول غير محدد) (Costa Silva et al. ، 2017) وفبروين الحرير (العائد غير محدد) (جرين وآخرون ، 1975 ليزاردي وآخرون ، 1979). يمكن أن يكون ضعف الإنتاج الخالي من الخلايا وكفاءته ناتجًا عن مجموعة متنوعة من العوامل بما في ذلك الاستنفاد السريع لمكونات مزيج طاقة التفاعل (على سبيل المثال ، ATP ، والأحماض الأمينية) ، وتشكيل نفايات مثبطة (على سبيل المثال ، الفوسفات غير العضوي) أو التفاعلات الجانبية غير المرغوب فيها التي تحويل تدفقات التفاعل بعيدًا عن المسارات المرغوبة (Caschera and Noireaux ، 2014). بسبب هذه القيود ، قد لا تكون البيولوجيا التخليقية الخالية من الخلايا طريقة إنتاج مثالية لبعض المواد البيولوجية. ومع ذلك ، في حين أن غلة إنتاج المواد الخالية من الخلايا الفعلية يمكن أن تكون منخفضة نسبيًا ، إلا أن هذه الأساليب لا تزال مفيدة لنماذج أولية لمسارات التخليق الحيوي المختلفة أو الركائز أو ظروف التفاعل لتعزيز كليهما. في المختبر وعوائد إنتاج الخلايا الكاملة. ومن الأمثلة على ذلك استخدام المقايسات الخالية من الخلايا لوصف مسارات التخليق الحيوي متعدد الهيدروكسيل (PHAs) من phaCAB Operons التي تم تحسينها أيضًا في الجسم الحي إنتاج PHA (كيلويك وآخرون ، 2018). علاوة على ذلك ، أظهرت نفس الدراسة أيضًا أن التحول الحيوي لخلاصة مصل اللبن المتخلل إلى 3 هيدروكسي بوتيرات (3HB) ، يمكن أن يقترن في وقت واحد بتخليق البروتين الخالي من الخلايا لإنزيم إعادة تدوير Acetyl-CoA محتمل (Kelwick et al. ، 2018 ). وبالتالي ، فإن تسليط الضوء على أن تنسيقات التفاعل الخالي من الخلايا يمكن أن تكون استراتيجية مفيدة للنماذج الأولية لمسار البلاستيك الحيوي وتحسينه.

ومن المثير للاهتمام ، في بعض الحالات ، أن الإنتاج الحيوي الخالي من الخلايا قد يكون في الواقع طريقًا صناعيًا مرغوبًا فيه أكثر. على سبيل المثال ، عدة في المختبر أفادت دراسات إنتاج الجسيمات النانوية من الذهب أو الفضة بخصائص الجسيمات النانوية المرغوبة (على سبيل المثال ، الحجم / زيتا) و / أو بروتوكولات التنقية الأسهل ضمن تفاعلات الإنتاج الحيوي الخالية من الخلايا مقارنة بأساليب إنتاج الخلية الكاملة (Krishnan et al. ، 2016 Costa Silva et al. ، 2017 ). يمكن أيضًا إجراء الإنتاج الحيوي الخالي من الخلايا في المقاييس الصناعية ذات الصلة ، كما هو موضح من قبل شركة Sutro biopharma التي طورت منصة تصنيع بروتينات خالية من الخلايا ومتوافقة مع ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) ، لإنتاج البروتينات العلاجية في حدود 100 لتر من أحجام تفاعل المفاعل الحيوي (زوادة وآخرون ، 2011). لإنتاج مواد خالية من الخلايا ، تم تطوير وحدة كيمياء حيوية تركيبية عالية الكفاءة لتحويل الجلوكوز إلى مواد كيميائية حيوية ، بما في ذلك مونومر بولي هيدروكسي بويتير متعدد الهيدروكسيل (PHA) (PHA) (Opgenorth et al. ، 2016). لتحقيق ذلك ، تم استخدام إنزيمات المؤتلف المنقى لإعادة تكوين العناصر الأساسية لمسارات البنتوز ، بيفيدو ، تحلل السكر و PHB (Opgenorth et al. ، 2016). كانت عائدات إنتاج PHB الخالية من الخلايا (40 جم / لتر) والكفاءات (90 ٪) مثيرة للإعجاب وقريبة بشكل واعد من المقاييس الجذابة صناعيًا (Opgenorth et al. ، 2016). هذه التحسينات في إنتاج PHB مرحب بها أيضًا لأن PHB ، بالإضافة إلى البوليمرات الحيوية PHAs الأخرى ، قابلة للتحلل ويمكن استخدامها كبدائل للبلاستيك المشتق من الزيت (على سبيل المثال ، تغليف المواد الغذائية) أو كمواد حيوية للأنسجة الهندسة (Choi SY et al. ، 2019 Tarrahi et al. ، 2020). تعد PHAs أيضًا مثالًا مثيرًا للاهتمام نظرًا لأهميتها الصناعية وتنوع الاستراتيجيات الخالية من الخلايا التي تم تطبيقها على أبحاث PHAs (الجدول 1). بناءً على هذه الأمثلة ، يمكن استخدام مناهج CFME لاستكشاف تنوع أكبر من البوليمرات الحيوية PHA نظرًا لأن البوليمرات الحيوية PHA يمكن أن تتكون من مجموعة متنوعة من الأنواع البرية المختلفة و / أو المونومرات الاصطناعية (& # x223C160 توجد مونومرات مختلفة) لإنشاء بوليمرات مشتركة معقدة ، مع مجموعة من الخصائص المادية (Choi SY وآخرون ، 2019). من المرجح أن تؤدي الاستكشافات المستقبلية للبيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا لـ PHA إلى إطلاق بوليمرات حيوية جديدة لـ PHAs بخصائص فريدة (Chen and Hajnal ، 2015) وبالتالي تسريع تطوير مواد البلاستيك الحيوي.

جرثومي (في الجسم الحي) تم تصنيع إنتاج PHA تجاريًا على المستويات الصناعية على مدى العقود العديدة الماضية. لسوء الحظ ، تم حظر التأثير التجاري للبلاستيك الحيوي القائم على PHA تاريخيًا بسبب ارتفاع تكاليف إنتاجها مقارنة بالبلاستيك المشتق من النفط (Chen et al. ، 2020). ومع ذلك ، فقد تم وضع عمليات إنتاج PHA أكثر كفاءة من خلال التصميم العقلاني لـ phaCAB مسارات التخليق الحيوي (Hiroe et al.، 2012 Kelwick et al.، 2015b Li et al.، 2016 Tao et al.، 2017 Zhang X. et al.، 2019) ، عمليات إعادة تدوير المستقلبات الرئيسية (على سبيل المثال ، Acetyl-CoA) (Matsumoto وآخرون ، 2013 بيكرز وآخرون ، 2016) ، مضيفات إنتاج جرثومية بديلة (على سبيل المثال ، هالوموناس sp.، Tan et al.، 2011) واستخدام مواد أولية منخفضة التكلفة من مصادر صناعية (مثل مصل اللبن) (Wong and Lee، 1998 Ahn et al.، 2000 Kim، 2000 Nikel et al.، 2006 Cui et al.، 2016 Nielsen et al.، 2017). ومن المثير للاهتمام ، أن العديد من استراتيجيات إنتاج PHA الميكروبية تتوافق أيضًا مع تفاعلات البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا. على وجه الخصوص ، قد يساعد استخدام المواد الأولية منخفضة التكلفة من مصادر محلية (على سبيل المثال ، مصل اللبن) في جعل إنتاج PHA القائم على خلاصة الخلايا أكثر قابلية للتطبيق من الناحية الاقتصادية (Kelwick et al. ، 2018). تم بالفعل تجريب نهج مماثل لإنتاج حمض اللاكتيك الخالي من الخلايا من القهوة المستهلكة (Kopp et al. ، 2019) ويمكن أن يصبح استراتيجية عامة للإنتاج الحيوي للمواد الخالية من الخلايا المستدامة (الشكل 2). قد نجادل في أن الجمع بين المستخلصات الخالية من الخلايا والمواد الأولية المحلية يتيح الوصول الفوري إلى كيمياء حيوية خلوية متنوعة للغاية وركائز منخفضة التكلفة (على سبيل المثال ، مخلفات المواد الأولية) ، والتي يمكن استخدامها في التصنيع الحيوي المستدام لمجموعة متنوعة من المواد البيولوجية (يان) and Fong، 2015 Le Feuvre and Scrutton، 2018). علاوة على ذلك ، مثلما تتيح التفاعلات الخالية من الخلايا المجففة بالتجميد إنتاج العلاجات الحيوية عند الطلب (Pardee et al. ، 2016b) ، فإننا نتصور أيضًا أن التفاعلات الخالية من الخلايا قد تؤدي يومًا ما إلى إنتاج مواد بيولوجية سريعة وموزعة حسب الطلب أو التفعيل الحيوي.

الشكل 2. التصنيع الحيوي المستدام الخالي من الخلايا للمواد البيولوجية. رسم تخطيطي يصور التصنيع الحيوي المحلي للمواد البيولوجية بوساطة خالية من الخلايا عند الطلب. يمكن استخدام المواد الأولية المحلية كبدائل لمكونات مزيج طاقة التفاعل باهظة الثمن ، أو لتوفير العوامل المساعدة الأنزيمية وركائز المسار التخليقي الحيوي اللازمة لإنتاج المواد البيولوجية ذات الأهمية.


طرق المواد و أمبير

زراعة الحشرات ونمو البكتيريا وإجراء عدوى الإناث

جميع الحشرات المستخدمة في هذه الدراسة كانت من مزارع مخزون تم الحفاظ عليها في ظروف معملية قياسية (24 ± 2 درجة مئوية ، 70٪ رطوبة نسبية في الظلام الدائم). تم توفيرها بالشهرة الإعلانية بدقيق النخالة والماء وتكملها مرة في الأسبوع بالتفاح.

تم تحضير الإناث بإيجابية الجرام Bacillus thuringiensis (Bt) وسالب الجرام Serratia entomophila (حد ذاتها). ومن المعروف أن هذه البكتيريا من مسببات الأمراض الطبيعية تي. مولتور [30] وتحرض استجابات فتيلة مناعية متناقضة داخل وبين الأجيال في هذه الحشرة [15،16،19]. تم الحصول على جميع البكتيريا من معهد باستير (Bt: CIP53.1 حد ذاتها: CIP102919) والمعلقات من أجل التحضير المناعي كما هو موصوف في [15]. باختصار ، نمت البكتيريا طوال الليل عند 28 درجة مئوية في وسط مرق سائل (10 جم جرثومي تريبتون ، 5 جم مستخلص خميرة ، 10 جم كلوريد الصوديوم في 1000 مل من الماء المقطر ، درجة الحموضة 7).ثم تم إبطال مفعولها في 0.5٪ فورمالديهايد محضر في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة وشطفها ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني. تم اختبار التثبيط عن طريق طلاء عينة من المحلول البكتيري على وسط مرق معقم بنسبة 1٪ من الآجار البكتيري وتحضينها عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تم الاحتفاظ بالقسمات عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

بالنسبة لجميع التجارب ، تم إجراء التحضير المناعي على الإناث البكر (10 ± 2 أيام بعد ظهورها) عن طريق تبريدها أولاً على الجليد لمدة 10 دقائق لغرض تجميد الحركة ثم عن طريق حقن معلق 5 ميكرولتر من البكتيريا المعطلة (Bt أو حد ذاتها) أو من المخزن المؤقت فقط (التحكم الإجرائي لتأثير الحقن). تم إجراء الحقن من خلال الغشاء الجنبي بين الجزء الثاني والثالث من البطن باستخدام شعيرات زجاجية معقمة تم سحبها إلى نقطة دقيقة باستخدام مجتذب قطب كهربائي (Narashige PC-10). لكل من البكتيريا المحقونة ، تم تعديل التركيز إلى 10 8 كائنات حية دقيقة لكل مل باستخدام غرفة عد الخلايا المحسنة Neubauer [16]. مباشرة بعد العلاج ، تم إقران الإناث بذكر عذراء ساذج مناعيًا من نفس العمر وسمح لها بإنتاج البيض في طبق بتري مزود بدقيق القمح والتفاح والماء في ظروف معملية قياسية (24 درجة مئوية ، 70٪ رطوبة نسبية داكنة) ).

من جديد تجميع تي. مولتور نسخة إلومينا (RNAseq)

في حالة عدم وجود الجينوم ، مرجع تي. مولتور كانت قاعدة بيانات النسخ (الشكل 1-1) ضرورية لتحديد البروتينات المرشحة من الدراسة البروتينية. نظرًا لأننا كنا نهدف إلى إنشاء قاعدة بيانات غنية بالنصوص المشاركة في الاستجابات المناعية والتوتر ، فقد تم إجراء التسلسل على الحمض النووي الريبي المجمَّع من أفراد من مختلف مراحل النمو (يرقات الطور الثالث ، والشرانق ، والبالغون) ، والجنس (ذكور وإناث) والظروف الفسيولوجية. بتعبير أدق ، مجموعات مكونة من 10 أفراد من يرقات الطور الثالث ، ذكور أو إناث بالغة ، إما لم تعالج أو تُحقن بها ب. تورينجينسيس، أو مع س. انتوموفيلا البكتيريا كما هو موصوف أعلاه ، أو حقنها بعقار الفينوباربيتال (0.1٪) ، المعروف أنها تحفز استجابة إزالة السموم من الحشرات [69]. استخدمنا أيضًا الحمض النووي الريبي من 30 خادرة (غير معالجة بسبب حساسيتها العالية للإجهاد) ، مما أدى إلى إجمالي 150 فردًا. تم استخراج الحمض النووي الريبي بعد 48 ساعة من التحضير ، باستخدام طريقة trizol (TRIzol LS Reagent ، Invitrogen) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة.

تم إجراء التسلسل على منصة Illumina HiSeq2000 Genome Analyzer باستخدام تقنية قراءة ثنائية الطرف (2x100bp) مع RNA مجزأ إلى متوسط ​​380 نيوكليوتيد. تم تنفيذ تسلسل نسختين تقنيتين بواسطة Eurofins-mwg-operon وأسفر عن إجمالي 70 و 51 مليون قراءة نهائية مزدوجة. تم تنفيذ تدابير مراقبة الجودة ، بما في ذلك تصفية القراءات عالية الجودة بناءً على نقاط الجودة الواردة في ملفات fastq (FactQC ، الإصدار 0.10.1) ، وإزالة القراءات التي تحتوي على تسلسلات التمهيدي / المحول وتقليص طول القراءة ، باستخدام Trimmomatic (الإصدار 0.3.1 [70]). تمت إزالة القراءة بنقاط تشبه Phred & lt20 وطول قراءة أقل من 40 نيوكليوتيدات. بعد ترشيح الجودة هذا ، نتج عن النسختين التقنيتين ما مجموعه 58 و 44 مليون قراءة تم تجميعها للحصول على نسخة مرجعية. ال من جديد تم إجراء تجميع النسخ باستخدام Trinity (الإصدار 2014/09/07 [71]) مع k-mers بحجم 25 و T = 50 ومعامل تشابه Jaccard (خيار من الثالوث لتقليل النسخ الوهمية). لنا من جديد يحتوي الترنسكريبتوم على 110،963 نسخة مع N50 (طول تسلسل أقصر كونتيج بنسبة 50 ٪ من إجمالي طول النسخ) من 1261 نيوكليوتيدات و ExN50 من 1135 نيوكليوتيد. استخدمنا Bowtie (الإصدار 0.12.9 [72]) لمحاذاة القراءات في النسخة النصية الخاصة بنا. يمكن العثور على المقاييس الكاملة في الجدول 1. لتقليل عدد النصوص ، أجرينا تجميعًا فائقًا باستخدام TGICL (الإصدار 2.1 [73]) باستخدام الإعدادات الافتراضية.

تم إجراء ترجمة النسخ باستخدام FrameDP (الإصدار 1.2.0 [74]) وتم استخدام Uniprot (uniprot.org ، إصدار 29 أبريل 2015) كقاعدة بيانات لمرحلة التعلم الآلي لاكتشاف أفضل رمز وراثي. تمت مقارنة البروتينات المتوقعة الناتجة (45505) باستخدام BLASTP (الإصدار 2.2.30+ ، القيمة الإلكترونية 10 −5) و آر. كاستانيوم البروتين متوفر في Uniprot (الإصدار 14 أبريل 2015). تم توقع شرح البروتين الوظيفي باستخدام InterProScan (الإصدار 5 [75]) على منصة GALAXY-BBRIC INRA (bbric.toulouse.inra.fr) باستخدام قاعدة بيانات InterPro (الإصدار 52). تم استخدام تحليل CEGMA للتحقق من جودة البروتين البروتيني [76]. تم استخدام النسخة المرجعية الخاصة بنا والبروتينات والتعليقات التوضيحية كمورد للجينات والبروتينات المرشحة في التجارب التالية. وهي متاحة للتنزيل على موقع مختبر IHPE على الويب (http://ihpe.univ-perp.fr/acces-aux-donnees) وعلى قاعدة بيانات NCBI ضمن BioProject ID PRJNA646689 بأرقام SRA SRR12235350 و SRR12235349.

تحليل بروتين البيض العالمي و AMPs

أجريت التحاليل البروتينية والببتيدومية على بيض تم وضعه أو استخراجه مباشرة من المبايض من إناث معدة وضابطة. تم إجراء تجربتين تكميليتين ، 2D-DiGE (الشكل 1-2 أ) وقياس الطيف الكتلي (الشكل 1-2 ب) ، لتوصيف البروتينات والببتيدات الوفيرة بشكل تفاضلي بين البيض الناشئ من إناث معدة وتلك الموجودة في مجموعة التحكم ، على التوالي.

معتبرا أن تي. مولتور تم الإبلاغ عن قيام الإناث بحماية بيوضهن من خلال TGIP من اليوم الثاني إلى اليوم الثامن بعد تحضير الأمهات [17] ، تم فقط جمع البويضات التي تم إنتاجها بعد اليوم الثالث بعد العلاج المناعي للأم (الشكل 6 أ). كان يتم جمع البيض إما مباشرة في المبايض أو وضعها حديثًا في طبق بتري. في الحالة الأخيرة ، يتم جمع البيض البياض دائمًا في غضون 16 ساعة بعد وضعه للتأكد من أن الجنين لم يبدأ نموه. ولتحقيق ذلك ، تم نقل الأزواج إلى طبق بتري جديد مزود بالدقيق الطازج والتفاح والماء بعد ثلاثة أيام من علاج الأم. تم جمع البيض المنتج في طبق بتري الجديد بعد 16 ساعة من نقل الزوجين (الشكل 6 أ). في لحظة جمع البويضات ، تم تبريد الإناث على الجليد لمدة 10 دقائق ثم تشريحها في PBS المثلج لإزالة المبايض. تم بعد ذلك شطف البويضات المعزولة من المبايض في برنامج تلفزيوني بارد ونظيف لإزالة أنسجة المبيض اللزجة الصغيرة ثم تجفيفها برفق لبضع ثوانٍ على ورق ترشيح معقم قبل جمعها وتجميدها على الفور في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. الإناث المستخدمة في جمع البيض لم يتم تشريحها. تم نخل بيضهم ومعاملته على النحو الوارد أعلاه.

تشير استراتيجيات أخذ عينات البيض للنهج البروتيني (اللوحة A) ، والنشاط المضاد للميكروبات بعد تجربة RNAi (اللوحة B) ، وحركية التعبير الجيني بواسطة RT-qPCR (اللوحة C) والنشاط المضاد للبكتيريا بعد تحضير الأمهات (اللوحة D). ويرد وصف كامل للإجراء لكل تجربة بالتفصيل في الجزء المقابل من قسم المواد والطرق.

تم استخدام أسلوب الفصل الكهربائي للهلام بالاختلاف ثنائي الأبعاد (2D-DiGE) لتحديد الوفرة التفاضلية للبروتينات نوعًا وكميًا (بحجم يتراوح من

10 إلى 150 كيلو دالتون) بين الظروف (بيض من إناث معدة ضد بيض من إناث ساذجة ، بيض معدة Bt مقابل بيض معدي حد ذاتها). يستخدم 2D-DiGE وضع العلامات المباشرة على البروتينات ذات الأصباغ الفلورية (CyDyes: Cy2 و Cy3 و Cy5) قبل تركيزها الكهربائي المتساوي لحل مشكلة الكميات والتكاثر المعروفة للرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد.

تم جمع ما مجموعه 433 بيضة بعد 3 أيام من التحضير (70-74 لكل حالة) من 117 أنثى مختلفة (16-24 لكل حالة) تم حقنها في 2 أو 5-7 تواريخ مختلفة للبيض في المبايض ووضعها حديثًا (تم أخذ عينات من داخلها. 16 ساعة بعد زرع) ، على التوالي. لكل حالة ، تم تجميع البيض في 6 مكررات بيولوجية مختلفة ، كل منها يتكون من 11-17 بيضة من 2-7 إناث مختلفة تم حقنها في نفس التاريخ إن أمكن. تتوفر جميع المعلومات حول تاريخ فتيلة الإناث وأخذ عينات البيض والتجميع في جدول S6. لكل مكرر ، تم طحن البيض في محلول UTTC (اليوريا ، 7 M ثيوريا ، 2 M Tris ، 30 ملي CHAPS ، 4 ٪ pH 8.5) باستخدام مدقة معقمة وحضنت في RT لمدة ساعتين. بعد الطرد المركزي (5 دقائق عند 10000 جم) ، تم جمع المادة الطافية وتم تحديد كمية تركيز البروتين باستخدام مجموعة 2D-Quant Kit (GE Healthcare) باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، قبل تخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تم تصنيف خمسين ميكروغرامًا من البروتينات باستخدام Cy3 أو Cy5 بينما تم تصنيف 50 ميكروغرام من مجموعة متساوية من البروتينات من جميع المستخلصات بـ Cy2 كمعيار داخلي. تم إجراء الحد الأدنى من ملصقات CyDye للبروتينات النقية باتباع تعليمات الشركة المصنعة (GE Healthcare). تم إجراء مقايضة الصبغة للتأكد من أن الاختلافات الملحوظة بين الظروف الأولية الثلاثة المختلفة للبويضات الموضوعة والبيض في المبايض لم تكن بسبب كفاءة وضع العلامات المختلفة للأصباغ. إعداد وضع العلامات DiGE متاح في جدول S6. تم بعد ذلك خلط البروتينات الموصوفة معًا وتم تخفيفها إلى حجم نهائي قدره 340 ميكرولتر مع محلول إعادة التميؤ (اليوريا ، 7 M ثيوريا ، 2 M CHAPS ، 4 ٪ DTT ، 65 مم) تحتوي على 0.2 ٪ من Bio-Lyte 3/10 أمفوليت (Bio- راد). تم إجراء تركيز Isoelectrofocusing كما هو موضح سابقًا [77]. باختصار ، تم تحميل العينة على شريط ReadyStrip IPG مقاس 17 سم مع تدرج غير خطي من 3 إلى 10 درجة حموضة (Bio-Rad) للإماهة السلبية (5 ساعات) والإماهة النشطة (14 ساعة عند 50 فولت). تم إجراء التركيز باستخدام البرنامج التالي: 50 فولت لمدة ساعة واحدة ، و 250 فولت لمدة ساعة واحدة ، و 8000 فولت لمدة ساعة واحدة ، وخطوة أخيرة عند 8000 فولت لإجمالي 50000 فولت مع جهد تدعيم بطيء (زيادة تربيعية الجهد) عند كل خطوة. تم إجراء كل من معالجة الجفاف والتركيز على نظام خلايا البروتيين IEF (Bio-Rad). بعد الاختزال باستخدام DTT والألكلة باستخدام iodoacetamide للبروتينات ، تم تحميل شرائط فوق 12٪ / 0.32٪ أكريلاميد / بيبرازين هلام ثنائي أكريلاميد وتشغيلها عند 25 مللي أمبير / جل لمدة 30 دقيقة متبوعة بـ 75 مللي أمبير / جل لمدة 8 ساعات باستخدام نظام Protean II XL (Bio-Rad). تم تحميل معايير البروتين (معايير البروتين الدقيقة غير الملوثة (Bio-Rad)) على أوراق Whatman الموضوعة على الجزء الأيسر من المواد الهلامية. تم فحص المواد الهلامية باستخدام ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) المرتبط بإصدار برنامج Image Lab الإصدار 4.0.1 (Bio-Rad) باستخدام الأزرق (مرشح 530/28) والأخضر (مرشح 605/50) والأحمر (695 / 55 مرشح) معلمات إضاءة epi لمسح البروتينات المسمى Cy2 و Cy3 و Cy5 ، على التوالي. تم إجراء التحليل المقارن النوعي والكمي لخرائط البروتينات الرقمية باستخدام برنامج تحليل الصور PDQuest 7.4.0 (Bio-Rad). تم النظر فقط في البقع بشكل كبير (p & lt 0.05 ، اختبار Mann-Whitney) 1.5 أضعاف وفيرة بشكل تفاضلي بين الظروف. من أجل تحديد البروتينات في المواقع المختلفة ذات الأهمية ، تم إجراء 2D-SDS-PAGE الكلاسيكي على كل حالة على حدة وتم تلوين المواد الهلامية بعد إجراء تلطيخ الفضة المتوافق مع مقياس الطيف الكتلي الموصوف سابقًا في [77]. تم استئصال البقع باستخدام Onetouch Plus Spot Picker القابل للتصرف (جهاز Harvard) المجهز بنصائح محددة مغسولة بالميثانول بقطر 1.5 مم. لكل بقعة ، تم هضم البروتين في المكونات الهلامية عن طريق التربسين وتم تحليل الببتيدات المهضومة باستخدام نظام nano-LC1200 مقترن بمطياف الكتلة Q-TOF 6550 المجهز بمصدر نانوسبيري وواجهة مكعب رقاقة HPLC (تقنيات Agilent) كما سبق وصفها [77]. تم إجراء تحديد البروتين عن طريق استخراج قوائم الذروة والمقارنة مع تي. مولتور قاعدة بيانات النسخ المترجمة باستخدام منضدة عمل البروتينات البروتينية 7.5 استوديو PEAKS (Bioinformatics Solutions Inc. ، بناء 20150615). تم إجراء عمليات البحث باستخدام المعلمات المحددة التالية: خصوصية الإنزيم ، وسمح التربسين بثلاثة انقسامات مفقودة بتعديل ثابت ، وتعديلات متغيرة لميثيل الكارباميدوميثيل (C) ، والأكسدة (M) ، والتسامح الشامل أحادي النظير من E و Q للأيونات السليفة ، وكتلة 20 جزء في المليون التسامح مع أيونات الشظايا ، وضع مسح MS 50 جزء في المليون ، وضع المسح الرباعي و MS / MS ، وقت الرحلة. تم اعتبار الضربات المهمة فقط ذات معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR 1 ٪) لقطع الببتيد والبروتين (−logP ≥ 13 (المقابلة لقيمة p 0.05) وعدد الببتيدات الفريدة ≥ 3) لأفضل النتائج. لضمان التحديد الصحيح للبروتينات ، تم إجراء بحث BLAST ضد قاعدة بيانات NCBI nr وتم استرداد المجالات المحفوظة للتسلسل باستخدام NCBI CD-search المتاح على https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure /cdd/wrpsb.cgi [78]. لكل بروتين ، تم حساب pI والكتلة الجزيئية باستخدام أداة ExPASy Compute pI / Mw (متوفرة على http://web.expasy.org/compute_pi).

يتمثل أحد حدود نهج 2D-DiGE في عدم قدرته على الكشف بشكل موثوق عن البروتينات الصغيرة (& lt10 كيلو دالتون) والببتيدات ، والتي تتضمن AMPs التي تم بالفعل إثبات دورها في TGIP [8،16،21،23،27،29،79 ، 80]. لقد درسنا مدى وفرتها في البيض الذي تم وضعه حديثًا (تم أخذ عينات منه في غضون 16 ساعة بعد الوضع) من قبل الأمهات بعد 3 أيام Bt و حد ذاتها فتيلة مقارنة مع معبي برنامج تلفزيوني. تم تحضير نسختين من 51 و 31 بيضة و 49 و 43 بيضة للسيطرة و ب. تورينجينسيس الشروط ، على التوالي. فقط 52 بيضة كانت متوفرة من س. انتوموفيلا-الأمهات الأوائل وهن يشكلن التكرار الوحيد لهذه الحالة. نشأ البيض من إجمالي 54 أنثى مختلفة تم تحضيرها في 8 تواريخ مختلفة (الجدول S6). نظرًا للعدد المحدود من التكرارات ، تم استقراء الاختلافات النوعية فقط من البيانات لتحديد البروتينات المرشحة. قمنا أولاً باحتضان كل حوض بيض في حمض الخليك ثلاثي الفلور (TFA) بنسبة 0.1٪ لإجراء استخلاص حمضي من الببتيدات التي تم تنقيتها بعد ذلك باستخدام Sep-Pak C.18 بالإضافة إلى خرطوشة الضوء (المياه) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تمت إزالة الببتيدات في 5 مل أسيتونيتريل 60٪ / TFA 0.1٪ وتم تجميدها طوال الليل. تم تقدير تركيز البروتين من خلال امتصاصها عند 205 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific) ، مما يشير إلى أننا استخلصنا تقريبًا. 60 ميكروجرام من البروتين لكل عينة بيضة. تم تعليق الببتيدات بعد ذلك في 50 ميكرولتر من الأسيتونيتريل 2 ٪ / TFA 0.1 ٪ وتم تقييم جودتها لأول مرة بواسطة MALDI-TOF (تأين امتصاص الليزر بمساعدة المصفوفة - وقت الرحلة) باستخدام مصفوفة HCCA Biotyper (Bruker Daltonic ، ألمانيا) مختلطة مع ثلاث تخفيفات مختلفة لكل عينة. تم تشغيل تحليل MALDI على Autoflex III Smartbeam (Bruker) يتحكم فيه برنامج Bruker Compass 1.4. بمجرد التحقق من صحتها ، تم تخفيف العينات في بيكربونات الأمونيوم (ABC) 100 ملي مولار ، وخفضها بإضافة DTT (تركيز نهائي 11 ملي مولار ، الحضانة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية) ، وألكلة باستخدام يودواسيتاميد (34 ملي مولار نهائي ، ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة ، في داكن). تم تحمض العينات بعد ذلك باستخدام TFA المخفف ، وطردها بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق 15000 جم عند 4 درجات مئوية ، وتم تقليل حجم المادة الطافية بواسطة فراغ السرعة. ثم تم تحليل المواد الطافية بواسطة LC-MS / MS من أعلى إلى أسفل: تم حقن عُشر كل عينة على نظام Ultimate 3000 nano-HPLC مجهز بـ 75 ميكرومتر.18 عمود ومتصل بمطياف الكتلة عالي الدقة Q-Exactive Orbitrap يعمل في الوضع الإيجابي للاكتساب المعتمد على البيانات (كل ذلك من Thermo Scientific ، ألمانيا). تم وصف المكونات والمذيبات ومعلمات التشغيل لتحليل nano-LC-MS / MS كما هو موضح بواسطة [81]. تمت مطابقة الأطياف من ملفات MS / MS المكتسبة مع تسلسل قاعدة بيانات تي. مولتور البروتينات التي أنشأناها لهذه الدراسة ، باستخدام برنامج Proteome Discoverer (الإصدار 1.4) الذي تم تعيينه بالمعلمات التالية: لا يوجد إنزيم و 12/144 من الأحماض الأمينية بأطوال ببتيد دنيا / قصوى ، على التوالي ، تحمل 10 جزء في المليون / 0.02 Da للسلائف والجزء مجموعة الأيونات ، وميثيل الكارباميدوميثيل للسيستين كتعديل ثابت ، ووسط البروتين الطرفي C ، وتعيين أكسدة الميثيونين والتربتوفان كتعديلات متغيرة ، والتحليل في وضع الثقة العالية (معدل الاكتشاف الخاطئ 1٪). تم استخدام خوارزمية Sequest HT المطبقة في برنامج Proteome Discoverer للبحث في قاعدة البيانات. تم استخراج قائمة مختصرة من خمسة عشر بروتينًا معروفًا أو مرشحًا لـ AMPs من قاعدة البيانات هذه ، عن طريق فحص التعليقات التوضيحية التي تم الحصول عليها باستخدام قاعدة البيانات النصية ومن خلال البحث في الأدبيات. تشير الدرجات العالية إلى تحديد موثوق ووفرة الببتيدات المطابقة ، مما قد يعكس وفرة عالية من البروتين ذي الصلة. تشير الدرجات المنخفضة ، عادةً أقل من 20 ، إلى تحديد ضعيف للبروتين و / أو وفرة منخفضة في العينة. لأسباب تتعلق بقابلية القراءة ، تم إبراز الدرجات الأعلى من 20 فقط في الجدول 3 ولكن تمت مناقشة جميع الدرجات (منخفضة وعالية). تم إيداع بيانات بروتيوميات قياس الطيف الكتلي في ProteomeXchange Consortium عبر مستودع شريك PRIDE مع معرف مجموعة البيانات PXD018772.

الإبطال الوظيفي للجينات المناعية المرشحة باستخدام تداخل الحمض النووي الريبي

هدفت هذه التجربة إلى اختبار مساهمة جينات AMP المرشحة في حماية البيض من خلال TGIP عن طريق هدم تعبيرها باستخدام تقنية RNAi (الشكل 1-3). على الرغم من جهود التحقيق المكثفة ، حالت الاختلافات الفردية المهمة في مستويات تعبير AMPs دون ملاحظة التأثير الراسخ لحقن AMP ds-RNA واحد على عدم التعبير عن AMPs في الأمهات. تضمنت الجهود المبذولة لتقليل التباين استخدام طريقة توصيل غير تدخلية لابتلاع الرنا المزدوج الجديلة [60 ، 61] ، واختبار تأثير التعرض الفردي أو المزدوج للـ dsRNA واختبار عدة نقاط زمنية بعد التعرض لـ dsRNA. لم تؤد أي من هذه التجارب إلى اختلافات منخفضة في مستويات تعبير AMP لدى الأمهات وفي تأثير معتد به على نشاط مضادات الميكروبات في البيض. من الجدير بالذكر أنه تم عرضه في ذبابة الفاكهة نموذجًا مفاده أن هدم جينات TEP (البروتين المحتوي على Thioester) ذات الوظائف الزائدة لم تكن كافية للتأثير بشكل كبير على النمط الظاهري للحشرة وأن التغيير في مقاومة العدوى الميكروبية لوحظ فقط عند هدم جميع جينات TEP الأربعة في وقت واحد [ 82]. لذلك ، قررنا حقن الإناث بمزيج من جينات AMP المرشحة المختلفة لتعظيم تأثير النمط الظاهري المحتمل على البيض. لهذا الغرض ، في اليوم الأول ، تم حقن الإناث بعد الظهور لمدة 10 أيام بـ 5 ميكرولتر من أي من 1) PBS كعنصر تحكم لإجراء الحقن ، 2) GFP-dsRNA (0.6 ميكروغرام / ميكرولتر) كعنصر تحكم في dsRNA غير ذي الصلة ، أو ثالثا) كوكتيل من الحمض الريبي النووي النقال من tenecins 1 و 4, كوليوبتريسين A و B و أتاسين -2 (0.12 ميكروغرام / ميكرولتر لكل منهما ، 0.6 ميكروغرام / ميكرولتر لإجمالي ds-RNA) ، بعد تبريده على الجليد لمدة 10 دقائق. تم تصنيع RNA مزدوج الشريطة (dsRNA) بواسطة في المختبر النسخ باستخدام مجموعة MEGAscript T7 (Ambion ، المملكة المتحدة) وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة. تم تصنيع مناطق حوالي 200 نقطة أساس من تينيسين -1 (رقم انضمام GenBank Q27023) ، تينيسين -4 (رقم انضمام GenBank AB669089) ، كوليوبتريسين- A (رقم انضمام GenBank KF957599.1) ، كوليوبتريسين- ب (رقم انضمام GenBank KF957600.1) ، و أتاسين -2 (رقم انضمام GenBank MF754108.1). يتكون الرنا المزدوج الجديلة غير ذي الصلة المستخدم كعنصر تحكم سلبي من 208 نقطة أساس من بروتين قنديل البحر الأخضر الفلوري (gfp5) RNA (رقم انضمام GenBank L29345).

تم وضع الإناث بشكل فردي في طبق من 12 بئراً ، يحتوي على دقيق النخالة وقطرة 10 ميكرولتر من الجلوز للترطيب (1٪ أجار أجار ، 10٪ سكروز) حتى اليوم الثالث. تعليق 5 ميكرولتر من المعطل ب. تورينجينسيس (10 8 بكتيريا / مل) كما هو موضح أعلاه (الشكل 6 ب). في اليوم الرابع ، تم حقن الإناث مرة أخرى باستخدام إما 1) PBS كعنصر تحكم لإجراء الحقن ، 2) GFP-dsRNA (0.6 ميكروغرام / ميكرولتر) كعنصر تحكم في الرنا المزدوج الجديلة غير ذي الصلة ، أو ثالثًا) مزيج من الرنا المزدوج الجديلة من الرنا المزدوج الجديلة. tenecins 1 و 4, كوليوبتريسين أ و ب، و أتاسين -2 ثم يتم نقلها بشكل فردي إلى أطباق بتري بقطر 55 مم تحتوي على ذكر واحد عمره 15 يومًا ودقيق نخالة وجيلوز للترطيب (الشكل 6 ب). تم الاحتفاظ بالأزواج في أطباق بتري للسماح بالتكاثر حتى اليوم السابع ، عندما تم فصل الإناث عن الذكور ووضعها في أطباق بتري فردية طازجة تحتوي على دقيق النخالة والجيلوز لإنتاج البيض. تمت إزالة الإناث من أطباق بتري في اليوم التاسع ووضع البيض بعد 6 أيام من الحفاظ على التحضير المناعي في أطباق بتري لمدة 3-4 أيام من النضج. تم عزل البيض (من 3 إلى 4 أيام) عن طريق نخل الدقيق (حجم الشبكة 600 ميكرومتر) [31] وتم تجميده على الفور في النيتروجين السائل لتحليل نشاطه المضاد للميكروبات في المستقبل (الشكل 6 ب). تم استخدام ما مجموعه 33 أنثى ، مما أدى إلى وضع 123 بيضة ، لكل علاج (التحكم ، GFP-dsRNA و AMPs-dsRNA).

الديناميات الزمنية لتعبير الجينات المناعية المرشحة

لتحديد الديناميكيات الزمنية لاستجابة TGIP في بيض الأمهات المستعدين ، قمنا بتقييم إنتاج نسخ الجينات المناعية المرشحة التي تم التعبير عنها بشكل مختلف على المستوى البروتيني في التجارب السابقة في كل من الإناث والبيض (الشكل 1-4). أردنا تحديدًا كميًا إنتاج هذه النصوص في كل من الإناث والبيض في اليوم 1 و 5 و 12 بعد التحضير ، مما يسمح بالحصول على البيض قبل الحماية ، بأقصى حماية وعندما تنتهي الحماية ، على التوالي [17] (الشكل 6 ج) ). بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن الحماية المضادة للبكتيريا في البيض الجاهز للأم تختلف باختلاف الوقت بعد وضع البيض (عمر البويضات) وفقًا للعامل الممرض الذي قام بتهيئة المناعة للأم [19] ، قمنا بتقييم تأثير عمر البويضات على كمية النصوص (الشكل 6 ج). لهذا الغرض ، كانت المجموعات المكونة من 10 أيام (± 2 يومًا) من الإناث البكر بعد النشوء ، كما هو موضح أعلاه ، محصنة عن طريق الحقن باستخدام ب. تورينجينسيس (العدد = 44) أو س. انتوموفيلا (N = 47) أو حقنها ببرنامج تلفزيوني كعنصر تحكم (N = 43). ثم تم إقران كل أنثى مع ذكر ساذج مناعيًا وبكر من نفس العمر مباشرة بعد الحقن الأولي ، وتم السماح لها بإنتاج البيض. ضمن كل طريقة علاج مناعي ، تم التضحية بشكل عشوائي بما لا يقل عن 9 أزواج في اليوم 1 و 5 و 12 بعد التهيئة ، بينما تم تقديم 6 بيضات. تم نقل الأزواج المتبقين إلى طبق بتري جديد في اليوم السابق لتضحياتهم للسيطرة على عمر البيض. مباشرة بعد التضحية بكل أنثى ، تم تخزينها في نيتروجين سائل ومن كل منهما ، تم أيضًا تجميد بيضتين وتخزينهما في نيتروجين سائل. تم السماح للبيض المتبقي (2 لكل نقطة زمنية) بالعمر لمدة 3 أيام أو 7 أيام بعد وضع البيض قبل تخزينها في النيتروجين السائل. ومن ثم ، في كل تسلسل لوضع البيض ، ساهمت كل أنثى في تكوين البويضات التي سمح لها بالعمر لمدة 1 أو 3 أو 7 أيام بعد وضع البيض قبل تجميدها في النيتروجين السائل لفحصها لاحقًا. تتوفر تفاصيل الإناث وعدد البيض المستخدم وتواريخ الحقن في جدول S6.

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من كل من الإناث البالغة والبيض باستخدام مجموعة Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research ، Irvine ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). باختصار ، تم تحفيز البيض المجمد أو الإناث البالغة باستخدام طاحونة الأنسجة في كاشف TRIzol (Life Technologies ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم بعد ذلك تنقية الحمض النووي الريبي وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة ، بما في ذلك العلاج الاختياري في العمود DNAse I ، وتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية. تم التحكم في تركيز ونقاوة الحمض النووي الريبي عن طريق قياس الامتصاصية باستخدام مقياس الطيف الضوئي Epoch (Biotek ، Winooski ، VT ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء النسخ العكسي لـ RNA إلى (كدنا) باستخدام Maxima H ناقص أول مجموعة توليف cDNA (TermoFisher Scientific ، Waltham ، MA ، USA) باستخدام hexamer عشوائي وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. اعتمادًا على كمية الحمض النووي الريبي المستخرج ، تم استخدام 1 ميكروغرام لـ RT عندما يكون ذلك ممكنًا (من أنثى بالغة وبيضة أكبر سنًا) أو كمية أقل (من بيض أصغر سنًا).

تم إجراء تحليلات PCR الكمية في منصة "qPCR Haut Débit (qPHD) Montpellier GenomiX" باستخدام معالج السائل Labcyte Echo 525 لإعداد ما قبل PCR ونظام LightCycler 480 (Roche ، بازل ، سويسرا) لتشغيل PCR. تم إجراء تفاعلات PCR بحجم إجمالي 1.5 ميكرولتر يشتمل على 0.5 ميكرولتر من cDNA (المخفف 1:80 أو 1:20 بالماء عالي النقاوة من الأم البالغة أو من البيض ، على التوالي) و 0.75 ميكرولتر من No Rox SYBR MasterMix dTTP Blue (Takyon Eurogentec ، لييج ، بلجيكا) ، و 100 نانومتر لكل كتاب تمهيدي. تم إنشاء كفاءات تضخيم PCR لكل جينة مستهدفة ومنازل عن طريق منحنيات المعايرة باستخدام تخفيفات متسلسلة مرتين لـ cDNA (من 1:20 إلى 1: 2580) في ثلاث نسخ. تم حساب كفاءات التضخيم باستخدام قيم الانحدار للجزء اللوغاريتمي الخطي لمنحنيات المعايرة بواسطة الإصدار LightCycler 480 Software 1.5 (Roche). تم الاحتفاظ فقط بالأزواج التمهيدي بكفاءة تضخيم 2. تم الإبلاغ عن جميع التفاصيل حول الاشعال المستخدمة في الجدول S7. كان برنامج التدوير على النحو التالي: خطوة تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، 45 دورة تضخيم (خطوة تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، خطوة التلدين والاستطالة عند 60 درجة مئوية لمدة 45 ثانية). تم إنهاء PCR الكمي بخطوة منحنى انصهار من 65 إلى 97 درجة مئوية بمعدل تسخين 0.11 درجة مئوية / ثانية وقياس التألق المستمر. لكل حالة ، استخدمت تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) 6-18 مكررات بيولوجية للإناث البالغة و3-4 مكررات بيولوجية للبيض (تجمع من 6 بيضات من 3 إناث مختلفة ، بيضتان لكل أنثى) ، بالإضافة إلى ثلاث مكررات تقنية. تم حساب متوسط ​​قيمة Ct. تم فحص منحنيات الانصهار المصححة باستخدام طريقة استدعاء Tm لإصدار برنامج LightCycler 4801.5. تم حساب التعبير النسبي لكل جين باستخدام طريقة Ct حيث قدمت كفاءة جميع البادئات (جينات الهدف والتدبير المنزلي) نفس كفاءة تضخيم PCR. لكل جين مستهدف ، تم حساب ΔCt فيما يتعلق بالقيمة المتوسطة لتشفير جينات مرجعية لـ 18S و 28S الريبوسوم RNA. بالنسبة للأم البالغة ، تم حساب ΔΔCt فيما يتعلق بقيم ΔCt لأمهات حالة التحكم (حقن PBS) التي تم التضحية بها بعد الحقن لمدة يوم واحد. بالنسبة للبيض ، تم حساب ΔΔCt بشكل مستقل لكل يوم وضع ، فيما يتعلق بقيم ΔCt للبيض الذي وضعته الأمهات المحقنات PBS. تم حساب قيم التعبير النسبي (R) للجينات بين الظروف المختلفة وفقًا للصيغة R = 2 -Ct [83].

فحص مضاد للجراثيم

تم قياس النشاط المضاد للبكتيريا في البيض ، والذي يسمح بفحص حماية البيض على المستوى الظاهري ، باستخدام مقايسة منطقة الانتشار القياسية [16 ، 17 ، 19]. من ناحية ، سمح هذا الاختبار باختبار تأثير إبطال الحمض النووي الريبي على نشاط البويضات المضاد للبكتيريا في التجربة التي تهدف إلى إبطال التعبير عن AMPs المرشحة في البيض الذي تم وضعه بعد 5 أيام من تحضير الأمهات و 3 أيام بعد وضع البيض (الشكل 6 ب). من ناحية أخرى ، تم استخدامه في التجربة للسماح بربط نشاط البيض المضاد للبكتيريا ، من السذاجة ومن PBS ، ب. تورينجينسيس و س. انتوموفيلا- عولجت الأمهات عند وضعها في 1 و 5 أيام بعد التحضير و 7 أيام بعد وضع البيض (الشكل 6 د) ، مع القياس الكمي لنصوص الجينات المرشحة لـ AMP في البيض من الأمهات اللاتي عولجن بالمثل (الشكل 6 ج).

تم إذابة عينات البيض الفردية على الجليد ، وتم تحضير مستخلصات البيض عن طريق هرس البيض في محلول حمض الأسيتيك (0.05٪ ، 5 مل لكل بيضة). بعد الطرد المركزي (3500 جم ، 2 دقيقة ، 4 درجات مئوية) ، تم استخدام 2 مل من المادة الطافية لقياس النشاط المضاد للبكتيريا في منطقة لوحات التثبيط المصنفة بالبكتيريا المفصليات الكروية الشكل، تم الحصول عليها من معهد باستير (CIP105365). تمت إضافة مزرعة للبكتيريا طوال الليل إلى وسط مرق يحتوي على 1٪ أجار لتحقيق تركيز نهائي من 10 5 خلايا لكل مل. ثم تم سكب ستة مليلتر من هذا الوسط المصنف في طبق بتري واتركه حتى يصلب. تم عمل عينات من الآبار باستخدام ماصة باستير مزودة بمضخة كروية. ثم تم تحضين الألواح طوال الليل عند 28 درجة مئوية. ثم تم قياس قطر مناطق التثبيط لكل عينة.

تحاليل احصائية

تم تحليل حجم مناطق التثبيط بعد معاملات تداخل الحمض النووي الريبي باستخدام اختبار شابيرو-ويلك للحالة الطبيعية واختبار الطالب T لاختبار الاختلافات في منطقة حجم التثبيط (p & lt0.05) ، في حين تم تحليل نسبة البيض الذي يظهر نشاطًا مضادًا للبكتيريا وفقًا تم تحليل معالجات تداخل الحمض النووي الريبي باستخدام اختبارات فيشر الدقيقة (p & lt0.05). وجود نشاط مضاد للجراثيم بين البيض الذي تم وضعه عن طريق التحكم ، PBS- ، ب. تورينجينسيس- و س. انتوموفيلا- تم تحليل الإناث المعالجة بعد يوم واحد أو 5 أيام بعد التهيئة باستخدام الانحدار اللوجستي ذي الحدين.

تمت مقارنة التعبير عن AMPs بواسطة RT-qPCR بعد علاج RNAi في الأمهات بين الأمهات المعالجات بـ dsAMP والأمهات المعالجات باستخدام اختبار Mann Whitney مع الأخذ في الاعتبار أن هذه البيانات لم يتم توزيعها بشكل طبيعي وفقًا لاختبار Shapiro-Wilk (p & lt0.01).

تم قياس التعبير النسبي للجينات المناعية الـ 11 المرشحة في الإناث البالغة مع ب. تورينجينسيس و س. انتوموفيلا وفي بيضهم البالغ من العمر 7 أيام الذي تم وضعه بعد 1 و 5 و 12 يومًا بعد التحضير بالنسبة للإناث المحقونة بالحقن PBS تم تحليلها باستخدام اختبارات Mann-Whitney (p & lt0.05) ، بعد التحقق من الحالة الطبيعية باستخدام اختبار Shapiro-Wilk. تم إجراء التحليلات باستخدام برنامج IBM® SPSS® Statistics 19.


تحليل الحساسية لقيم k max vivo

تحليل تقلب الجريان.

يتطلب FBA وظيفة موضوعية للتحسين ، وهناك بدائل مختلفة (على سبيل المثال ، الكتلة الحيوية ، ومعدل النمو ، وعائد ATP ، وما إلى ذلك). يقلل pFBA من المجموع الإجمالي للتدفقات وقد ثبت أنه يتفق جيدًا مع التدفقات المقاسة وبيانات التعبير في بكتريا قولونية (63 ، 65). في الخوارزمية البخل ، مساحة الحل صغيرة جدًا. ومع ذلك ، لا يزال من الممكن أن ينحرف التدفق بشكل كبير بالنسبة لبعض التفاعلات ، وبالتالي يؤثر على قيمة الجسم الحي k max. لتقدير التباين في حل pFBA الخاص بنا ، نقوم بإجراء تحليل متغير التدفق (FVA) لجميع التفاعلات بقيم k max vivo المقاسة. لهذا نحسب الحد الأدنى من التدفق (v min) وأقصى تدفق (v max) مدعومًا بكل تفاعل في الحالة التي تم فيها الحصول على k max vivo. نحن نقيد النموذج بمجموع إجمالي ثابت من التدفقات (من pFBA) ومعدل النمو الثابت والظروف البيئية (من القياسات). لكل تفاعل ، نحصل على نطاق لـ k max vivo: نطاق k max vivo = [v min E ، v max E]. [S1] يوضح الشكل S2 مدى k max vivo بالنسبة للقيمة التي تم الحصول عليها من محلول pFBA الأصلي. pdxH هو الإنزيم الوحيد الذي يظهر تباينًا كبيرًا. لأن بكتريا قولونية يحتوي على إنزيم لاهوائي بديل لهذا التفاعل (71) ، خلال v min pdxH يمكن أن تنخفض إلى الصفر (أي عند استخدام الإنزيم اللاهوائي فقط) ، مما يؤدي إلى تباين كبير في k max vivo لـ pdxH. نظرًا لأننا نستخدم الظروف الهوائية فقط في تحليلنا ، فمن المحتمل أن يكون التباين المقترح غير ذي صلة.

نطاق k max vivo بالنسبة لقياسات k cat. تم إجراء تحليل تقلب التدفق لحل pFBA لجميع التفاعلات (ن = 132). نقاط البيانات تتوافق مع الشكل 2 في النص الرئيسي. ال ذ = x يظهر الخط بخط بني متقطع باللون الأسود يمثل أفضل ملاءمة من خلال الانحدار المتعامد في سجل 10 أشرطة خطأ (عادةً ما تكون صغيرة جدًا بحيث تكون في حدود حجم النقاط نفسها) تمثل النطاق بين تقديرات k max vivo العلوية والسفلية.

متطلبات ATP.

تم تعيين متطلبات ATP ذات الصلة بعدم النمو (المعروف أيضًا باسم متطلبات ATP للصيانة) في نموذج iJO1366 لدعم 3.15 ملي مول gCDW −1 h −1 من ATP ، بناءً على البيانات التجريبية (23). ومع ذلك ، قد تتغير هذه القيمة عبر الشروط. نظرًا لأن تحليلنا لمعدلات تحفيز الإنزيم يتم إجراؤه عبر العديد من الظروف ، فقد أجرينا تحليل الحساسية عن طريق حساب قيم k max vivo المعطاة 0 ٪ أو 200 ٪ من التدفق من خلال تفاعل ATP - الصيانة في النموذج ، ووجدنا تأثيرًا ضئيلًا على k max قيم الجسم الحي ، كما يتضح من الشكل S3.

متطلب ATP المتعلق بعدم النمو له تأثير ضئيل على قيم k max vivo. (أ) قيم k القصوى في الجسم الحي المعطاة تدفق 6.30 ملي مول جم / جم سي دي دبليو -1 ساعة -1 (200 ٪ من قيمة الصيانة المبلغ عنها ، x المحور) مقارنة بـ 3.15 ملي مول جم سي دي دبليو -1 ساعة -1 (ذ المحور) من خلال تفاعل صيانة ATP. (ب) قيم أقصى k فيفو معطاة تدفق الصفر (x المحور) مقارنة بـ 3.15 ملي مول جم سي دي دبليو -1 ساعة -1 (ذ المحور) من خلال تفاعل صيانة ATP. يشير الخط الأزرق إلى ذ = x خط.


نتائج ومناقشة

التسلسل والتجميع

تضمنت بيانات الإدخال لتجميع الجينوم الكامل خمس مكتبات (انظر الجدول S1). كانت معظم البيانات عبارة عن تسلسلات من نهايات أجزاء قصيرة (400 نقطة أساس). لقد أنشأنا أيضًا ثلاث مكتبات مجزأة أطول من 3 و 10 و 12.5 كيلو بايت والتي ساعدت بشكل كبير في ربط contigs بالسقالات. بعد التشذيب لإزالة البيانات منخفضة الجودة ، احتوت مجموعة البيانات على 248 مليون زوج أو حوالي 500 مليون قراءة من 151 نقطة أساس. بالنظر إلى حجم الجينوم المقدر بـ 606 ميغابت في الثانية ، فإن هذا يمثل تغطية 120 × تقريبًا للجينوم. كان الطول الإجمالي للجينوم المُجمع 667 ميجا بايت ، أي أطول بحوالي 10٪ أو 24٪ من حجم الجينوم المقدر باستخدام قياس التدفق الخلوي (606 ميجا بايت) (Horjales وآخرون. ، 2003) أو كتوزيع أكثر عمقًا للقراءات المتسلسلة (538-540 ميجا بايت الشكل S1) ، على التوالي. أنتج كل من MaSuRCA و SOAPdenovo2 تجميعات جيدة ، لكن تجميع MaSuRCA كان له حجم سقالة N50 يبلغ 366541 مقابل 355832 لـ SOAPdenovo2. كاختبار للجودة ، قمنا بمحاذاة القراءات من إحدى المكتبات ذات النهاية المزدوجة إلى كلا التجميعين وحوالي 12٪ أكثر من أزواج القراءات المحاذاة بشكل ثابت - على المسافة والاتجاه الصحيحين - لتجميع MaSuRCA. لذلك اخترنا تجميع MaSuRCA كأساس للتعليق التوضيحي والتحليل اللاحق. ومع ذلك ، كان تجميع SOAPdenovo2 متفوقًا على الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء ، حيث قام بتجميع البلاستيدات الخضراء في جزيء واحد والميتوكوندريا في سبعة كونتيجات. استخدمنا هذه التجمعات العضوية النهائية وأزلنا جميع السقالات من مجموعة MaSuRCA التي تطابق العضيات. كان للتجميع الأولي حجم كونتيج N50 يبلغ 44398 وحجم سقالة N50 يبلغ 366541 نقطة أساس ، بناءً على حجم الجينوم المقدر بـ 606 ميجا بايت في الثانية (الجدول 2). حددت AMOScmp 5426 سقالة متداخلة تم دمجها في 237 سقالة أكبر. في خطوة السقالات باستخدام النسخة المجمعة ، تم ربط 2397 سقالة في 1063 سقالة بناءً على محاذاة النص. احتوى التجميع النهائي على 27 032 سقالة تزيد عن 1000 نقطة أساس ، بطول إجمالي يبلغ 667 ميجابت في الثانية وحجم N50 يبلغ 464955 نقطة أساس (استنادًا إلى حجم جينوم يبلغ 606 ميجابت في الثانية). كان إجمالي contigs المجمع 687 ميجا بايت ، بطول N50 يبلغ 46148 نقطة أساس وإجمالي 221640 contigs. الخريطة المادية الجوز (Luo وآخرون. ، 2015) هو مورد تكميلي محتمل لمجموعة بندقية الجينوم بأكملها (WGS). في المجموع ، يرتبط 26596 تسلسلًا نهائيًا للكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC) J. ريجيا تم الحصول على BioSample SAMN00188677 من NCBI. من بين هؤلاء ، تم تحديد 22050 مع سقالات في J. ريجيا خريطة البدنية. في المجموع 20 821 من هذه المتواليات الطرفية BAC المعينة فعليًا محاذاة بشكل فريد مع 4005 سقالة في تجميع المسودة. بالإضافة إلى ذلك ، 145 BAC تنتهي بمحاذاة أكثر من سقالة. الطول المجمع ، الذي يمثل تعيينًا فريدًا لـ BAC ينتهي بالسقالات ، بلغ إجمالي السقالات المستهدفة 546 ميغابايت (ملف S1) ، وهي أغلبية (79٪) من التسلسل في مجموعة WGS الخاصة بنا.

حجم الجينوم المقدر (ميغابايت) 606
عدد الكروموسوم (2ن) 32
الحجم الإجمالي للكونتيج المجمعة (ميغا بايت) 687
عدد contigs 221 640
أكبر contig (BP) 603 060
طول N50 (كونتيج) (بي بي) 46 148
عدد السقالات 186 636
الحجم الإجمالي للسقالات المجمعة (ميغابايت) 712
عدد السقالات & GT1000 نقطة أساس 27 032
الحجم الإجمالي للسقالات المجمعة (& GT1000 نقطة أساس) (ميغا بايت) 667
طول N50 (سقالات) 464 955
أطول سقالات (ميغا بايت) 3
عدد الفجوات 35 004
متوسط ​​طول الفجوات (بي بي) 712
الحجم الإجمالي للفجوات (ميغا بايت) 25
محتوى GC (٪) 37

التحقق من الجمعية

أظهرت إستراتيجية التحقق الخاصة بنا باستخدام قراءات PacBio المتوافقة مع التجميع أن حوالي 88٪ من التجميع تمت تغطيته بواسطة قراءات PacBio ، بمتوسط ​​هوية يبلغ حوالي 80.2٪. قمنا أيضًا بتقييم إمكانية ربط قراءات PacBio من خلال محاذاة مجموعات فرعية من 1000 قراءة للتجميع الحالي باستخدام ثلاثة محاذاة مختلفة (nucmer و bwa و blasr) وإحصاء عدد قراءات PacBio المحاذاة لأكثر من سقالة واحدة. اختلفت النتائج بشكل كبير بين التقويمات (الجدول S2). بشكل عام ، كان لدى ما بين 0.18 و 1.35٪ من قراءات PacBio إمكانية ربط.

تسلسل النسخ والتجميع

تم تسلسل أكثر من مليار قراءة (1062838572) نهاية مزدوجة عبر 19 مكتبة. بعد مراقبة الجودة والتشذيب ، تم تقليل عدد القراءات إلى 978128921. جمعت شركة Trinity 132 041 772 نقطة أساس في 111944 نسخة بمتوسط ​​طول 1180 نقطة أساس و N50 لعام 1833. من بين هذه النصوص ، كان 78645 جينات فريدة من نوعها ". أنتج الكشف عن إطارات القراءة المفتوحة الحقيقية (ORFs) وتقنيات التحقق 35836 ORFs (الجدول 3) ، منها 16594 كاملة الطول (46٪). إن N50 للتسلسلات كاملة الطول هو 1449. تم سقالة الجينوم باستخدام 29785 ORFs جزئية وكاملة الطول (تمثل ORFs فريدًا) وتم تحليلها بشكل أكبر.

مجموع
إجمالي القراءات 1 062 838 572
إجمالي القراءات بعد مراقبة الجودة 978 128 921
مجموع لا. من النصوص 111 944
مجموع لا. من جينات الثالوث 78 645
N50 (الكل) 1833
كل contigs ، متوسط ​​الطول 750
كل contigs يعني 1180
جميع contigs ، قواعد مجمعة 132 041 772
مجموع لا. متواليات كاملة الطول 16 594
مجموع لا. من تسلسل ORF 35 836
مجموع لا. من تسلسل الإطار المحدد 29 785
مجموع لا. من التسلسلات غير الملوثة 28 932
مجموع لا. من التسلسلات المشروحة 25 373
مجموع لا. من التسلسلات بدون تعليق توضيحي 4140
مجموع لا. عدد الزيارات غير المفيدة (وظيفة غير معروفة) 9379

شرح الجينوم

قمنا بتوضيح الجينوم المُجمَّع باستخدام خط أنابيب شرح الجينوم شبه الآلي MAKER-P باستخدام علامة التسلسل المعبر عنها (EST) وتسلسل البروتين من أقارب الأنواع (الجدول S3) والمجموعة المجمعة. J. ريجيا النسخ ، والتي أسفرت عن 32498 نموذجًا جينيًا. تم شرح ما مجموعه 5172 سقالة 5000 نانومتر بنموذج جيني واحد على الأقل (النطاق 1-325 تعليقًا توضيحيًا ، متوسط ​​6.28).تم استكشاف العديد من ميزات الجينات للتحقق من صحة نماذج MAKER: الاكتمال (كودونات البداية والإيقاف الأساسية) ، ودعم النسخ ، ودليل البروتين (التشابه مع الخروع COMMUNIS, كرمة العنب الاوروبي أو نبات الخيار البروتينات) ومجالات البروتين التي يمكن التعرف عليها (PfamA و / أو قاعدة بيانات النمر) (الجدول 4). لقد تجاهلنا اثنين من الجينات الأحادية الخارجية ذات المجالات المرتبطة بالعناصر الرجعية. بناءً على هذه الميزات ، قمنا بتصنيف 32496 نموذجًا جينيًا إلى ثلاث فئات: (1) جينات عالية الجودة كاملة الطول (16852 تسلسلًا) متعددة الأوجه أو أحادية الصوت ، كاملة ، مدعومة ببيانات التعبير أو دليل البروتين ومشار إليها بـ at مجال بروتيني على الأقل (2) جينات جزئية عالية الجودة (8782 تسلسلًا) متعددة الأوجه ، وجزئية ، ومدعومة ببيانات التعبير أو دليل بروتيني ومشروحة بمجال بروتيني على الأقل و (3) جينات منخفضة الجودة (6862 تسلسلًا) والتي متعددة الأوجه أو أحادية الصوت ، كاملة أو جزئية ، غير مدعومة ببيانات التعبير أو دليل البروتين أو غير مشروحة بمجال بروتيني.

متعدد exonic أحادي exonic مجموع الجينات
عدد الجينات 26 249 6247 32 496
كاملة (تحتوي على أكواد بدء / إيقاف أساسية) 15 555 5964 21 519
بدعم من بيانات تسلسل الجوز RNA 19 884 3982 23 866
تحتوي على مجال / مجالات Pfam و / أو Panther 21 516 4332 25 848
بدعم من دليل البروتين 25 772 6240 32 012

كانت السمات الجينومية مماثلة لتلك الموجودة في الجينومات النباتية المتسلسلة الأخرى (الجدول 5). كانت مناطق ترميز البروتين المشروحة حوالي 5٪ فقط من الجينوم وحوالي 28٪ من المساحة الجينية الكلية ، بسبب طول الإنترونات الأطول (الجدول S4). كانت معظم تقاطعات intron / exon عبارة عن وصلات لصق متعارف عليها GT-AG (الجدول S5). ومن المثير للاهتمام ، أن التقاطعات التالية الأكثر شيوعًا كانت GC ، و AT ، و AC ، والتي تشبه نسب الوصلات البديلة غير المتعارف عليها GC-AG و AT-AC الموصوفة في الأنواع النباتية الأخرى (لاحظ أن٪ AG-3 -٪ GT-5 ′ = 0.0573٪ مشابه لـ٪ GC-5 ′ = 0.0516٪ و٪ AT-5 ′ = 0.0072٪ مشابه لـ٪ AC-3 ′ = 0.0079٪) (Sparks and Brendel، 2005).

Juglans ريجيا Pyrus communis بيريوس بريتشنايديري فراغاريا فيسكا مالوس × domestica كرمة العنب الاوروبي سينينسيس الحمضيات
الجينات المتوقعة 32 496 43 419 42 812 34 809 54 921 30 434 29 445
متوسط ​​طول الجين (بي بي) (بما في ذلك الإنترونات) 4358 3320 2776 2792 2802 3399 3041.21
متوسط ​​طول CDS (BP) 1222 1209 1172 1160 1155 1255
عدد exons 172 273 221 804 202 169 174 375 273 226 149 351 258 142
متوسط ​​طول exon (بي بي) 229.5 237 248 232 273 130 312
عدد الجينات أحادية إكسون 6249 10 909 12 310 5915 10 378
عدد الإنترونات 139 775 178 385 159 357 139 567 218 353 118 917 213 755
الإنترونات لكل جين (متعدد إكسون) 5.3 5.49 5.22 4.83 4.9 5.8
متوسط ​​طول إنترون (بي بي) 730 398 386 407 491 213 359

تم تقييم اكتمال نماذج الجينات MAKER باستخدام CEGMA (الجدول S6). كانت تغطية 248 مجموعة فائقة الحفظ من الجينات الأساسية حقيقية النواة (CEG) 82٪ (تغطية كاملة) و 99٪ (تغطية جزئية). أظهر تحليل مماثل للنسخة المستخدمة للتعليق التوضيحي (28932) وجميع ORFs المحددة (35836) تغطية أقل قليلاً ، مما يشير إلى أن MAKER زادت بشكل طفيف من التغطية التي يوفرها تجميع النسخ. قمنا بتحليل مساهمة مجموعات البيانات المختلفة (البروتينات النباتية و من جديد نسخة) إلى نماذج MAKER النهائية (الشكل 2). من بين نماذج MAKER عالية الجودة (16852) ، تم دعمها جميعًا بأدلة بروتينية من أنواع نباتية أخرى وحوالي 80٪ بواسطة مجموعة النسخ (الشكل 2). من بين نماذج MAKER المغطاة بالكامل ، تم تقليل الدعم من دليل البروتين ولكن ليس دعم النسخ ، حيث تمت تغطية المزيد من النماذج بالكامل. عندما كانت التغطية 100٪ مطلوبة لكلٍ من طرازي النسخ و MAKER ، فإن 35٪ من الطرز مغطاة بنسخة كاملة الطول.

تحليل نماذج الأدلة من MAKER.

النسبة المئوية لنماذج MAKER كاملة الطول وعالية الجودة (16852) مغطاة بالبروتين (دليل خارجي ، أخضر) أو تسلسل الحمض النووي الريبي (أحمر) في أي تغطية ، 100٪ (cv100) وتغطية 100٪ لكل من النموذج والنسخة ( كلاهما cv100).

من طرازات MAKER ، تمت تغطية 6959 (41.29٪ شكل 2) بالكامل بنصوص مجمعة و 12209 نصًا تمت تغطيتها بالكامل بواسطة نماذج MAKER ، مما يشير إلى أن نماذج الجينات أطول من النصوص وأن MAKER يمكنها `` توسيع '' المعلومات المقدمة بواسطة بيانات التعبير. يتوافق هذا مع متوسط ​​طول تسلسل الترميز المرصود (نماذج MAKER) البالغ 1222 nt ، ومتوسط ​​طول النص (RNA-seq) البالغ 965 nt. من بين 32496 نموذجًا جينيًا ، قمنا بتعليق 30843 ببروتين نباتي باستخدام قواعد البيانات بناءً على نتائج enTAP. كرمة العنب الاوروبي, R. communis و نبات الأرابيدوبسيس thaliana ساهم بشكل كبير في الشرح الوظيفي (الشكل S2). كان هناك 4716 نموذجًا مع نتائج غير إعلامية (تم شرحها كبروتينات افتراضية أو متوقعة أو غير مميزة) و 1650 لم يكن لها أي إصابة ، مما قد يمثل J. ريجيا- بروتينات محددة. من أصل 346 جينًا تم تحديدها على أنها J. ريجيا- محددًا باستخدام تحليل Markov Cluster Algorithm (MCL) (الموصوف أدناه) ، تم تمثيل 230 بواسطة هذه الجينات بدون إصابة ، مما يدعم مساهمتها في J. ريجيا. في المجموعة الكاملة من الجينات ، تم شرح 24234 بواحد على الأقل من 3542 مدخلات Interpro مختلفة و 3558 بواحد من 713 رمز إنزيم مختلف من قاعدة بيانات تسمية الإنزيم (Bairoch ، 2000).

أسفر التصنيف الوظيفي للجينات المشروحة عن 11 421 نموذجًا مشروحًا بـ 3771 مصطلحًا مختلفًا في علم الوجود الجيني (GO). كانت الوظائف الجزيئية الأكثر وفرة هي الارتباط (19.4٪) والربط بالنيوكليوتيدات (17.7٪). الأيض (25.4٪) ، الخلوية (22.1٪) والتخليق الحيوي (16٪) كانت أكبر العمليات البيولوجية ومكونات الأغشية (18.6٪) كانت الأكثر وفرة بين المكونات الخلوية (الشكل S3). كانت أكثر مجالات InterProScan وفرة هي IPR000719 (مجال بروتين كينيز) و IPR002885 (تكرار خماسي الببتيد) و IPR001128 (السيتوكروم P450) ، والتي كانت في 708 و 589 و 369. J. ريجيا الجينات ، على التوالي. كانت النماذج ذات التكرار الغني باللوسين (LRR) وفيرة أيضًا تم شرح 527 جينًا باستخدام مدخلات IPR001611 أو IPR013210. تم تمثيل مسارات الفسفرة بشكل كبير بناءً على تخصيص رمز الإنزيم ، وهذا ليس بالأمر غير المعتاد بالنسبة للنباتات. من بين 4716 نموذجًا جينيًا تم شرحها على أنها غير مفيدة و 1650 بدون إصابة ، كان لدى 2587 و 167 على التوالي مجال بروتين Pfam أو Panther معروف ، مما يساهم في توصيفها على الرغم من افتقارها إلى التشابه العالمي مع البروتينات المميزة.

شمل تحليل عائلة الجينات المتعامدة ، الذي تم إجراؤه عبر TRIBE-MCL ، كل من J. ريجيا نماذج MAKER ومجموعة من البروتينات من تسعة نباتات أرضية متسلسلة (الشكل 3). تتألف الأنواع التسعة من مزيج من monocots و dicots و bryophyte. كان هناك 1046 عائلة من الحجم الخامس وأكبر ، مما أسفر عن 9910 عائلة بعد تصفية العائلات التي تحتوي على عناصر رجعية. من بين هؤلاء ، يتألف 9153 من بروتينات من أكثر من نوعين. فقط 20 عائلة (165 بروتين) كانت فريدة من نوعها J. ريجيا (الجدولان 6 و 7). من بين هؤلاء ، تم شرح 12 من خلال مجال بروتين وصفي واحد على الأقل. لم يتم تحديد مجال البروتين في ثمانية J. ريجيا- عائلات محددة (66 بروتين). واحد وفير J. ريجيا- مجموعة محددة تضمنت جينات مقاومة مميزة تحتوي على مجالات LRR و / أو NB-ARC (PF12799 ، PF13855 ، PF08263 و PF00931 أربع عائلات ، 24 بروتين). أظهر الفحص الإضافي لنتائج شرح بلاست (مع تغطية 70٪ على الأقل على مستوى البروتين) لهذه البروتينات أن 12 من الـ 24 جينات مقاومة للأمراض.

مخطط Venn لمجموعات البروتين المتعامد لكل نوع تم تحديده في تحليل مجموعة ماركوف (MCL) باستخدام Juglans ريجيا نماذج MAKER ومجموعة البروتين لتسعة أنواع نباتية متسلسلة.

كانت الأنواع النباتية التسعة المتسلسلة على النحو التالي: نبات الأرابيدوبسيس thaliana (في)، J. ريجيا (JR) ، أرز أسيوي (نظام التشغيل) ، باتينز فيسكوميتريلا (PP) ، Populus trichocarpa (بتوقيت المحيط الهادئ) ، الخروع COMMUNIS (RC) ، ثيوبروما، الكاكاو (ح) ، كرمة العنب الاوروبي (VV) ، زيا ميس (ZM) و جلايسين ماكس (GM). يمثل المركز عدد العائلات المشتركة بين جميع الأنواع في وقت واحد. تم النظر فقط في العائلات التي تحتوي على خمسة أعضاء أو أكثر من البروتين. أظهر تحليل العائلات المكونة من عضوين أو أكثر أن 5205 عائلة مشتركة بين جميع الأنواع في وقت واحد.

عائلة البروتين نماذج الجوز معرف Pfam [عدد Pfam] وصف Pfam
2906 19 PF12796 [8] Ank_2
7392 10 PF03140 [10] DUF247
7940 10 PF12776 [1] Myb_DNA- ربط_3
7946 10 لا بفام
7948 10 PF07777 [1] MFMR
7966 10 لا بفام
8408 9 لا بفام
8504 8 PF00171 [1] الديه
8677 8 لا بفام
8735 8 لا بفام
8737 8 لا بفام
8754 7 PF00646 [6] صندوق F
8861 7 PF12799 [4] LRR_4
8975 7 PF00931 [2] NB-ARC
PF13855 [1] LRR_8
8980 7 لا بفام
9091 6 PF14577 [1] SEO_C
9318 6 لا بفام
9633 5 PF13855 [1] LRR_8
9785 5 PF02892 [1] zf-سرير
9863 5 PF08263 [3] LRRNT_2
PF12799nn [1] LRR_4
اسم العنصر اسم العائلة تكرر الطول الإجمالي (بي بي) نسبة الجينوم
- 57 LINE / L1 14 754 13 626 865 1.98
119 LTR / الغجر 15 566 10 789 195 1.57
Reju_rnd-2_family-14 LTR 7952 8 167 833 1.19
Reju_rnd-3_family-29 LINE / L1 7037 7 495 511 1.09
118 LTR / الغجر 13 456 7 324 814 1.06
Reju_rnd-3_family-5 LTR / الغجر 4371 7 247 731 1.05
- 49 LTR 11 849 7 007 548 1.02
80- عائلة LINE / L1 4799 6 822 652 0.99
58 LTR 8977 5 941 064 0.86
89- علي LTR / الغجر 4203 5 250 213 0.76
-64 LTR / كوبيا 2912 5 086 047 0.74
Reju_rnd-6_family-1 الحمض النووي 15 957 4 219 485 0.61
Reju_rnd-4_family-7 LINE / L1 15 016 4 169 235 0.61
Reju_rnd-5_family-10 الحمض النووي 14 524 3 857 295 0.56
رجوع_ند-3_الأسرة -301 LINE / L1 3953 3 637 049 0.53
Reju_rnd-3_family-7 الحمض النووي 15 243 3 303 322 0.48
126 DNA / CMC-EnSpm 5152 3 256 473 0.47
Reju_rnd-3_family-210 الحمض النووي 6166 2 720 074 0.40
271 LTR / الغجر 2209 2 685 568 0.39
231 الحمض النووي 16 304 2 644 048 0.38

شرح الجينات في J. ريجيا إنزيمات ترميز الجينوم تشارك في التخليق الحيوي للفينولات غير الهيكلية

بما يتفق مع مجموعة غنية من المركبات الفينولية في J. ريجيا، ثماني عائلات تحتوي على 133 بروتينًا تحتوي على مجال UDP-glucuronosyltransferase (UDPGT PF00201) المرتبط بنشاط UDP glycosyltransferase. كانت المجالات الأخرى المرتبطة بشكل شائع بهذه المجموعة من العائلات هي المجال الطرفي N لعائلة glycosyltransferase (Glyco_transf_28 PF03033) والمجال الحفاز المحفوظ هيكليًا لكينازات البروتين (Pkin PF00069). أقل تواترًا كان مجال ferrodoxin المحفوظ (Fer2 PF00111) ، وهو مجال اللولب الحلزوني الحلزوني من عائلة كبيرة من البروتينات المرتبطة بالكالسيوم (EF-hand_5 PF13202) والمجال التحفيزي لعائلة البروتياز Ulp1 (Peptidase_C48 PF02902). قمنا بتعليق أحد أعضاء هذه المجموعة باستخدام UDPGT (PF0021) كـ WALNUT_00000341-RA على سقالة jcf7180001222233. ارتبط هذا البروتين بعملية التمثيل الغذائي (GO: 0008152) وتوقعه InterProScan باعتباره UDP-glucuronosyl / UDP-glucosyltransferase (IPR002213). من المثير للاهتمام أن بروتينات الثدييات التي تظهر هذا المجال مصنفة على أنها UDP-glucuronosyl transferase (EC: 2.4.1.17) فهي تنقل حمض الجلوكورونيك إلى ركائز محبة للدهون وتزيل السموم من الأدوية والمواد المسرطنة (Burchell وآخرون. ، 1991). ومع ذلك ، في النباتات ، يتم تصنيف أفراد هذه العائلة على أنها فلافونول -3ا-Gluosyltransferases (EC: 2.4.1.91) ونقل جزء الجلوكوز من UDP-glucose إلى فلافانول ، وهو تفاعل لوحظ في التخليق الحيوي للأنثوسيانين (Hu وآخرون. ، 2011). تم تخصيص بروتينين إضافيين لعائلة واحدة وتم تجميعهما مع 63 بروتينًا من جينومات أخرى بواسطة MCL. تم شرح هذه البروتينات كـ WALNUT_00030240-RA و WALNUT_00029754-RA بواسطة MAKER. تم تحديد ثلاثة مجالات Pfam مرتبطة بإنزيمات PPO في كل بروتين: مجالات tyrosinase (PF00264) و PPO1_KFDV (PF12143) و PPO1_DWL (PF12142). ترتبط هذه المجالات بالأكسدة / الاختزال ونشاط أوكسيديز الكاتيكول في جينات PPO وتوجد في إنزيمات PPO الأساسية. تتناقض هذه النتيجة مع تقرير يحدد جينًا واحدًا فقط من إنزيم بوليفينول أوكسيديز (JrPPO1) باستخدام التحليل الجنوبي (Escobar وآخرون، 2008). توصيف شامل لـ JrPPO1، مما يؤكد وجود جين واحد أو أكثر من جين PPO في جيه ريجيا ، يرد أدناه. بينما نحن واثقون من أن نتائجنا تدعم وجود جين PPO إضافي ، فإننا ندرك أن اكتشافنا تم تمكينه فقط من خلال تسلسل J. ريجيا الجينوم وتحديد المجالات المحفوظة باستخدام في السيليكو أساليب.

شرح تسلسل ميرنا في ملف J. ريجيا الجينوم

حددنا 5229 من سلائف ميرنا المحتملة مع MIRENA بالمقارنة مع متواليات ميرنا النباتية المعروفة في MirBase. لم يكن أي منها مطابقًا تمامًا لـ miRNAs المعروفة (تحتوي جميعها على عدم تطابق واحد أو اثنين). يتم سرد الأنواع النباتية ذات المساهمة الأكبر في التعريفات في الجدول S7. يوضح الشكل 4 (أ) توزيع الحجم لجميع miRNAs الناضجة المحددة المتوقعة من السلائف. نتائجنا منحازة نحو اختيار التسلسلات القصيرة (مقارنة مع الطول النموذجي 21 nt من miRNAs في الأنواع الأخرى) وعدم وجود بيانات التعبير يعيق التحقق من الصحة. لذلك ، طبقنا معايير صارمة للتصفية. أولاً ، اخترنا فقط السلائف التي تحتوي على تسلسلات ناضجة بأحجام وظيفية موصوفة سابقًا (20 ، 21 ، 22 أو 24 nt ، 2881 سلائف). ثانيًا ، اخترنا السلائف التي تحتوي على ميرنا ناضج مع تشابه تسلسلي مع miRNAs الأكثر حفظًا بين النباتات (330 سلائف الجدول S8). ثالثًا ، تمت مراجعة الهياكل الثانوية للحمض النووي الريبي يدويًا لتحديد السلائف التي تفي بالمتطلبات الهيكلية للـ microRNA (الشكل 4 ب) ، مما أسفر عن 205 و 66 موقعًا عالي الجودة ومنخفض الجودة ، على التوالي (الجدول S8) تم تجاهل 20. انهار اثنان وسبعون من السلائف أيضًا إلى 37 موقعًا مختلفًا بسبب تحديد كل من خيوط ميرنا المزدوجة على نفس السلائف (الشكل 4 ج). تم وضع علامة على خمسة سلائف طويلة ذات مؤشرات طاقة خالية من الطي قليلة للغاية (MFEI) منخفضة الجودة لأنها تشبه بنية الينقولات الخلفية القابلة للطي (الشكل 4 د) ، والتي يمكن الخلط بينها وبين سلائف ميرنا الحقيقية. قد تميز بيانات تعبير الحمض النووي الريبي الصغيرة في التحليل المستقبلي عن سلائف الحمض النووي الريبي الصغيرة المتداخلة والتحقق من صحة المجموعة الكاملة لمواقع ميرنا المحددة في هذه الدراسة. MiR156 موجود في كل الأنواع النباتية تقريبًا بعدد نسخ مرتفع ، ولكنه كان وفيرًا بشكل خاص J. ريجيا. تم شرح واحد وعشرون نموذجًا من طراز MAKER كبروتينات مرتبطة بمروج الصدفية (SPL) ، والتي يتم استهدافها عادةً بواسطة miRNA (Kozomara and Griffiths-Jones ، 2014). إذا تم التحقق من صحة هذه البيانات تجريبياً ، فقد يسلط ذلك الضوء على أهمية جينات SPL و miR156 في العمليات التنموية في J. ريجيا. تتضمن النتائج المتسقة الأخرى وفرة من miR168 (تم تحديد موقعين من miRNA) ، وهو مكون رئيسي في آلية الإسكات التي تستهدف بروتينات Argonaute (Vaucheret ، 2008) (تم تحديد سبعة نماذج). يعتبر MiR395 شديد التنوع بين الأنواع ، حيث يتراوح من ستة نسخ فقط في نبات الأرابيدوبسيس إلى 17 بوصة برونوس بيرسيكا. يساعد هذا الحمض الريبي النووي الريبي في تنظيم امتصاص الكبريتات في نبات الأرابيدوبسيس (ماثيومان وآخرون. ، 2012) والسلائف السبعة عشر عالية الجودة المحددة في J. ريجيا تشير إلى دور مهم لتنظيم التمثيل الغذائي للكبريت من خلال إسكات الجينات. تم تحديد أربعة نماذج جينية مشروحة على أنها ATP-sulfurylases (المستهدفة بواسطة miR395 في الأنواع الأخرى) ، وهو نفس عدد الجينات كما هو موضح في جينوم Arabidopsis (Lamesch وآخرون., 2012 ).

تحديد ميرنا في جينوم الجوز.

(أ) توزيع طول متواليات miRNA الناضجة المستمدة من السلائف المتنبأ بها حسابيًا ، لمجموعة كاملة من miRNAs المحددة (الحمراء) والمحفوظة يدويًا في الأنواع الأخرى (الأزرق).

(ب) ، (ج) الهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي لاثنين من السلائف التي اجتازت مرشح الجودة. تم تحديد كل من ميرنا والشريط التكميلي حسابيا للسلائف (ج).

يكرر جنبا إلى جنب

حددنا 6.77 ميغابت في الثانية من التكرارات الترادفية ، والتي تشكل 0.95 ٪ من الجينوم. كان متوسط ​​التكرار الترادفي 25 نقطة أساس. تمثل الأقمار الصناعية الصغيرة (9-100 نقطة أساس) (Vergnaud and Denoeud ، 2000) أكبر جزء مادي من الجينوم (0.51٪) ، تليها الأقمار الصناعية (& gt100 bp ، 0.28٪) (Csink and Henikoff ، 1998) والأقمار الصناعية الدقيقة (1-8) بي بي ، 0.15٪) (Morgante and Olivieri، 1993) (الجدول S9). بين السواتل المكروية ، كان تكرار ثنائي النوكليوتيد أكثر انتشارًا عند 25 ٪ من جميع التكرارات الترادفية و 0.8 ميجا بت في الجينوم. كانت متواليات الإجماع الستة الأكثر شيوعًا لها حجم الفترة الثانية وتشتمل AT ثنائية النوكليوتيد على 0.23 ميجا بايت (0.03 ٪) من الجينوم (الجدول S10 الشكل S4). Juglans ريجيا لديها كثافة سواتل دقيقة أعلى بكثير من A. thaliana, C. Sativus, خامسا فينيفيرا أو P. تريوكاربا (فيجرزين وآخرون. ، 2014) (الشكل 5). كانت مكررات ثنائي النوكليوتيد والبنتانوكليوتيد أكثر كثافة بشكل ملحوظ في J. ريجيا مقارنة بالجينومات النباتية الأخرى ، بينما كانت السواتل الدقيقة الأخرى موجودة بكثافات مماثلة أو منخفضة. بلغ متوسط ​​عدد النسخ للقمر الصناعي الصغير 14.75 ، بينما بلغ متوسط ​​عدد النسخ للأقمار الصناعية الصغيرة والأقمار الصناعية 2.84 و 2.30 على التوالي.

مقارنة بين كثافة الأقمار الصناعية الدقيقة عبر الأنواع.

تم حل التكرارات المتداخلة عن طريق تحديد العنصر بدرجة أعلى من Tandem Repeat Finder. يتكرر الترادف مع التكرارات المتناثرة التي تداخلت على أقل من 15٪ من طولها. تمت مقارنة هذه البيانات مع مجموعة مختارة من كاسيات البذور المتسلسلة.

يتكرر يتخللها

التكرارات المتناثرة هي عادةً عناصر متحركة تنتشر باستخدام الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي الوسيط. كشف تحليلنا أن 51.19٪ (50.38٪ تتخللها بالإضافة إلى 0.95٪ ترادفيًا) J. ريجيا الجينوم متكرر. هذا التقدير أعلى من التقدير السابق البالغ 28.9٪ باستخدام تسلسل BAC (Wu وآخرون. 2012) هو أيضًا أكبر من P. trichocarpa (42٪) (توسكان وآخرون. ، 2006) ولكنها تشبه أوكالبتوس غرانديز (50.1٪ ميبورج وآخرون. ، 2014) و خامسا فينيفيرا (55.02٪). كان هناك 930517 تكرارًا متقطعًا تم تحديده في الجينوم (754453 كامل الطول و 176064 تكرارًا جزئيًا) ، بطول إجمالي يبلغ 346567115 زوج أساس. نسب من جديد وشروح التشابه 92.49٪ و 7.51٪ على التوالي. عدد فريد من جديد التكرارات التي تم الحصول عليها من RepeatModeler كانت 811 ، بينما تم تحديد عناصر تكرار فريدة لعام 2009 باستخدام بحث تشابه Repbase (الشكل S5). من بين التكرارات المتقطعة ، التكرارات كاملة الطول تمثل 531515460 نقطة أساس (7.7٪) وتكرارات جزئية لـ 293415655 نقطة أساس (42.6٪) (الشكل 6). كان هناك 27473 تكرارًا متقطعًا (40 عنصرًا فريدًا) التي لم يتم تصنيفها (627733 بطول كامل و 3548903 جزئيًا) ، تمثل 0.6٪ من الجينوم. كانت التكرارات المتناثرة 50.38٪ من الجينوم ، منها 35.38٪ ينقالات رجعية و 14.35٪ ، ينقولات DNA وتكرارات غير مميزة. من بين الترانسبوزونات الطويلة (LTR) ، كان الغجر وكوبياس أكثر وفرة بنسبة 8.40٪ (721 عنصرًا فريدًا) و 6.57٪ (701 عنصرًا فريدًا) من الجينوم. كانت نسبة تغطية الجينوم لعناصر الغجر إلى كوبيا 1.27 (الجدول S11). ومع ذلك ، كان عدد LTRs غير المميزة 7.09٪ من الإجمالي بعد بحث تشابه وتنظيم يدوي. كشف تأريخ LTRs أن عناصر Copia كان متوسط ​​تباعد LTR بنسبة 4.6٪ مقارنة مع 5.5٪ لعناصر الغجر ، مما يشير إلى أن Copias قد يكون أصغر سنًا (ملف S2). ومع ذلك ، فإن عدد العناصر ونسبة الجينوم التي تغطيها LTRs غير المميزة قد تؤثر على نتائج التأريخ.

تتخللها محتويات مكررة بتنسيق Juglans ريجيا.

الانهيار الكامل (باستخدام قطع 80-80-80 (Wicker وآخرون. ، 2007) ، المسمى على أنه كامل) وجميع العناصر (الكاملة زائد الطول الجزئي ، المسمى الكل) المتكررات المتناثرة في الجينوم. تم تصنيف عناصر التكرار إلى الفئة الأولى (الينقولات العكسية) والفئة الثانية (الينقولات الحمض النووي). يوضح الشكل أيضًا محتوى الرنا الريباسي وعناصر التكرار غير المصنفة بتنسيق J. ريجيا.

لا تحتوي العناصر غير LTR على مناطق LTR وتنتهي بتكرار تسلسل بسيط مثل poly (A). بدلاً من النسخ العكسي للـ RNA الذي يتوسطه RNA ، والمُشفَّر بعنصر و Integrase ، يحدث النسخ العكسي لـ RNA في موقع الإدراج (Kejnovsky وآخرون. ، 2012). كانت نسبة الينقولات العكسية غير LTR في الجينوم 10.47٪. L1 / LINE هي أكبر فصيلة فرعية غير LTR retrotransposon ، بنسبة 7.6 ٪ من الجينوم. بين ترانسبوزونات الحمض النووي (14.35٪ من الجينوم ، 263 عنصرًا فريدًا) ، En / Spm (محسن مثبط - متحور) و hAT (روبن) وآخرون. ، 2001) هي عناصر الحمض النووي الرئيسية بنسبة 2.23٪ و 2.08٪ من الجينوم ، على التوالي.

اكتشاف SNP

وجدنا 965861 SNPs عالية الجودة موزعة في 7123 سقالة. لتقدير تغاير الزيجوت في SNP ، قمنا بتكييف جميع المواقع بعمق أدنى مطلوب يبلغ 80 وجودة رسم خرائط بحد أدنى 20 ، مما أسفر عن 398173095 موقعًا عبر 16777 سقالة يمكن استدعاء تعدد الأشكال عالية الجودة عليها. أدى ذلك إلى تقدير إجمالي تغاير الزيجوت SNP قدره 0.0024. بما في ذلك تعدد الأشكال منخفضة الجودة في نفس المنطقة ، زاد التقدير قليلاً إلى 0.0025. كما هو متوقع ، كان هناك ارتباط قوي بين طول السقالة وعدد النيوكلوتايد. تميل السقالات التي لا تحتوي على تعدد أشكال النيوكلوتايد إلى أن تكون صغيرة ، وتمثل 41٪ من حيث العدد ولكن 9.9٪ فقط بطول السقالات التي تزيد عن 5000 نقطة أساس (انظر الشكل S6 لمعرفة تغاير الزيجوت الجينومي ، الملحق S1). فقط 38 سقالة أطول بين 100 و 673 كيلو بايت لا تحتوي على SNPs. أكدت هذه النتائج أن معظم السقالات التي لا تحتوي على تعدد أشكال النيوكلوتايد قصيرة وتشير إلى أن الأصل المشترك هو في الغالب في الماضي البعيد. كانت معظم الجينات على سقالة مع SNP: 14469 جينًا احتوت على 177702 متعدد الأشكال عالية الجودة داخل منطقتهم الجينية. تحتوي مجموعة فرعية من 10 130 جينًا على SNPs ضمن تسلسل الترميز المشروح.

حدث تكرار الجينوم الكامل

هناك أدلة ، تستند إلى السجل الأحفوري ، لتكرار الجينوم الكامل على Juglans النسب التي حدثت منذ حوالي 60 مليون سنة (Luo وآخرون. ، 2015). لفحص الأدلة بشكل شامل لتكرار الجينوم الكامل داخل J. ريجيا تم إجراء مقارنات ذاتية في الجينوم لتحديد مناطق التخليق المحفوظة بين المناطق المتجانسة في الجينوم. حددنا 8459 زوجًا من الجينات المماثلة (syntelogs ، 12084 جينًا) ، باستثناء الازدواجية الترادفية داخل السقالة. من بين هؤلاء ، حدث 3688 (30.5٪) جينًا أكثر من مرتين. توزيع التغييرات المرادفة المقدرة لكل موقع مرادف (كس) لكل من 4111 زوجًا (8093 جينًا) من syntelogs مع كس & lt 1 (الشكل 7). ضمن هذه المجموعة ، حدث 423 (5.2٪) جينًا فقط أكثر من مرتين. اثنين من القمم الواضحة موجودة. ربما تمثل القمة الثانوية ، بالقرب من الأصل ، أنماطًا فردانية أليلية غير مندمجة في تجميع جينوم منفرد. الذروة الرئيسية ، التي تمثل غالبية syntelogs ، لديها وضع في كس = 0.33. يتوافق هذا بشكل مدهش مع تقدير متوسط ​​الاختلاف لـ 14 زوجًا من الجينات المتعادلة (كس = 0.274 ± 0.09) (لو وآخرون. ، 2015). مصطلحات علم الوجود الجيني التي تم تمثيلها بشكل مفرط في 8093 جينًا مع كس & lt 1 تضمنت بروتينات ذات وظائف في تنظيم النسخ ومكونات نقل الإشارة (الشكل S7) ، مماثلة لتلك المحددة في جينومات النباتات الأخرى (Blanc and Wolfe ، 2004 Seoighe and Gehring ، 2004 Bekaert وآخرون. ، 2011). توفر نتائجنا دعمًا قويًا لتكرار الجينوم الكامل ودرجة الاختلاف بين syntelogs. هناك حاجة إلى البيانات الجينومية من الأعضاء الآخرين في Juglandaceae لتحديد تاريخ أكثر دقة وموضع النشوء والتطور لتكرار الجينوم بأكمله.

تحديد GGT ، وهو إنزيم يحفز الخطوة الملتزمة في التخليق الحيوي لـ HTs

يتم تصنيع حمض الغاليك ، وهو مقدمة لتخليق غالو وإيلاغيتانين ، من حمض 3-ديهيدرو شيكيميك ثم تحويله إلى β-glucogallin (1-ا-galloyl-β- d -glucose) ، الوسيط الرئيسي لتركيب HTs (Niemetz and Gross ، 2005 Muir وآخرون. ، 2011). ظهر مؤخرًا أن ترانسفيراز الجلوكوزيل يحفز تكوين β-glucogallin (Mittasch وآخرون، 2014). تنقل عائلة إنزيمات glycosyltransferase (GT) شقوق السكريد من الجزيئات المانحة النشطة إلى الجزيئات المستقبلة (Lairson وآخرون، 2008). تصنف Glycosyltransferases إلى 97 عائلة من خلال قاعدة بيانات إنزيمات الكربوهيدرات النشطة (CAZy) (لومبارد). وآخرون. ، 2014) ، منها 1-glycosyltransferases ، أو UDP المعتمد على Glycosyltransferases (UGTs) ، وهي الأكبر في المملكة النباتية (Ross وآخرون، 2001 Yonekura-Sakakibara and Hanada ، 2011). تنقسم هذه UGTs إلى 16 مجموعة (A - P) (روس وآخرون. ، 2001 كابوتي وآخرون. ، 2012). تمتلك Dicots مجموعة واسعة من جينات UGT المفترضة في جينوماتها (C. Sativus لديه 85 Malus domestica، 241 ، إلخ. Caputi وآخرون. ، 2012). حدد تحليل حديث على مستوى الجينوم لـ UGTs في الذرة 147 جينًا (Li وآخرون، 2014). استخدمنا UGT84A13 (QrGGT) ، وهي مجموعة L UGT من Quercus robur (البلوط الإنجليزي) (Mittasch وآخرون. ، 2014) ، للاستعلام عن ملف J. ريجيا النسخ وتحديد جينات UGT في الجينوم باستخدام خوارزمية تكرارية (انظر الإجراءات التجريبية). تحتوي UGTs على جزء محفوظ من 42 من الأحماض الأمينية ، ممثلة في شكل PSPG (نبات ثانوي مزعوم glycosyltransferase) (الشكل 8 أ). باستخدام عزر PSPG ، حددنا حوالي 130 جينًا مختلفًا لـ UGT معبرًا عنها في J. ريجيا الجينوم (الشكل 8 ب). يتم التعبير عن نسخ UGTs بشكل تفاضلي في معظم الأنسجة ، مع التعبير عن عدد كبير في الجذور (الجدول S12). تُظهر شجرة النشوء والتطور (الشكل 8 ج) تقريبًا نفس عدد المجموعات كما تم الإبلاغ عنه سابقًا (Caputi وآخرون. ، 2012). كنا مهتمين بشكل خاص بـ UGTs التي تعرض نشاط GGT ، مما يحفز تكوين 1-ا-جلوكوز- د- د- جلوكوز. جينان في J. ريجيا، c48329_g2_i1 (JrGGT1) و c48329_g1_i1 (JrGGT2) ، كانت أقرب التطابقات إلى QrGGT وكانت تنتمي إلى مجموعة L من UGTs (Caputi وآخرون. ، 2012 Mittasch وآخرون، 2014). المجموعة L UGTs لها أنشطة أنزيمية على مجموعة متنوعة من المستقلبات بما في ذلك فينيل بروبانويدس (ليم وآخرون. ، 2003) ، بنزوات (ليم وآخرون، 2002) و indole-3-acetic acid (Jackson وآخرون، 2001). ومع ذلك ، لا يمكن أن تتنبأ مجموعة النشوء والتطور بالأنشطة الكيميائية الحيوية الواسعة لريسفيراترول / هيدروكسي سيناميك حمض الجلوكوزيل ترانسفيراز ثنائي الوظيفة من عنب كونكورد (Hall and De Luca ، 2007). تم تسليط الضوء على تحذير مماثل من قبل قاعدة بيانات CAZy ، التي تنصح بأن "تعدد الأنواع (إنزيمات ذات مانح و / أو متقبل مختلف موجود في نفس العائلة) أمر شائع بين عائلات glycosyltransferase ، مما يجعل التنبؤات الوظيفية الدقيقة غالبًا غير موثوقة أو غير دقيقة" (http: // www .cazy.org / GlycosylTransferases.html). وبالتالي ، فإن الاختلاط وخصوصية الركيزة الواسعة (Chakraborty and Rao ، 2012) لهذه الإنزيمات تتطلب توصيفًا كيميائيًا حيويًا مناسبًا عند تصنيف خصائصها التحفيزية.

تحليل تسلسل الجلوكوزيل ترانسفيرازات (GT) في Juglans ريجيا.

(أ) ملف تعريف إيجابي لـ 42 من البقايا المحفوظة في متواليات GT.

(ب) محاذاة التسلسل المتعدد الجزئي للمنطقة المحفوظة لتسلسلات بروتين GT.

(ج) تحليل النشوء والتطور الجزيئي بأسلوب الاحتمال الأقصى. تضمن التحليل 130 سلسلة من الأحماض الأمينية. كان هناك 757 وظيفة في مجموعة البيانات النهائية. أجريت التحليلات التطورية في MEGA6. المجموعة L UDP-glycosyltransferases مظللة باللون الأحمر.

لاستكشاف الأساس الجزيئي للتباين في خصوصية الركيزة لـ JrGGT1 و JrGGT2 ، قمنا بنمذجة الجينات باستخدام SWISS-MODEL (Arnold) وآخرون. ، 2006) مع PDBid: 2PQ6 من ميديكاغو truncatula (الذي له أقرب هوية إلى UGT84A13) كقالب. في السابق ، اقترحنا طريقة لاقتراح الطفرات في بروتين لمنحه وظيفة تحفيزية محددة بناءً على التناظر الهيكلي والكهروستاتيكي للبقايا في الموقع النشط لتلك الخاصة ببروتين معروف بالوظيفة المرغوبة (تشاكرابورتي ، 2012). اخترنا ذرات Cα للبقايا كالذرة التمثيلية لكل بقايا لمقارنة موحدة. تحتوي المواقع النشطة لهذه البروتينات على مواقع ارتباط متميزة بين المانحين والمستقبلين (Li وآخرون. ، 2007). قمنا بتطبيق تحويلات (تشاكرابورتي ، 2012) لمحاذاة ثلاث بقايا (H378 و F400 و D402) المتضمنة في موقع ربط المانحين (Li وآخرون. ، 2007). يتم حفظ هذه المخلفات تمامًا في كل من بروتينات JrGGT. تتوافق H378 و W381 مع بقايا الموقع النشط له و Trp التي وصفها Ghose وآخرون. (2015) ، والتي تعتبر حاسمة بالنسبة للجليكوزيل في فينيل بروبانويد سيكويسولاريسيريسينول.

قدم هذا التراكب المتعدد للبروتينات إطارًا مرجعيًا واحدًا لمقارنة GTs ، مما يدل بوضوح على التماثل الهيكلي العام (الشكل 9). لذلك ، فمن المنطقي أن نستنتج أن الاختلافات بين هذه البروتينات هي م. truncatula الايسوفلافونويد جي تي مقابل Q. ربار و J. ريجيا تكمن بروتينات GGT في مواقعها النشطة. بعد التراكب ، أخذنا بقايا داخل دائرة نصف قطرها 5 Å من الثالوث (H378 و F400 و D402). لكل بقايا في PDBid: 2PQ6 ، وجدنا أقرب بقايا في JrGGT1 و JrGGT2 ، بتركيب البروتينات ، ثم قارننا البقايا في المواقع النشطة للبروتينات الثلاثة. تشغل بعض المناصب بقايا مختلفة كيميائيًا مجسمًا ، مما يوفر سببًا معقولًا للاختلاف في خصوصية الركيزة عند مقارنة GT و GGTs (Gouran وآخرون، 2014). على سبيل المثال ، D201 كبير سالب الشحنة في PDBid: يتم استبدال 2PQ6 ببقايا سيرين قطبية صغيرة في J. ريجيا و س: روبر GGTs. لقد صممنا أربعة أزواج من بادئات PCR استنادًا إلى التسلسل الجيني لتأكيد وجود هذه الجينات: لكل جين ، تم تصميم مجموعة واحدة من البادئات لتضخيم منطقة الترميز فقط والأخرى لتضخيم الجين و 2 كيلو بايت في المنبع و 1 كيلو بايت أسفل منطقة التشفير (انظر الملحق S2 ، الأشكال S8 – S15 ، الجداول S15 – S19). قامت البادئات (JrGGT1-F-cd و JrGGT1-R-cd JrGGT2-F-cd و JrGGT2-R-cd) بتضخيم نطاقات مفردة تمثل منطقة ترميز GGT من الحمض النووي الجينومي المعزول من مختلف J. ريجيا الأصناف (انظر الملحق S2). كان JrGGT1 موجودًا على سقالة 7209 bp المعينة jcf7180001222249 وكان JrGGT2 موجودًا على سقالة 7350-bp المعينة jcf7180001222233 (انظر الملحق S2).

محاذاة تسلسل متعددة لتسلسلات الغاليت 1-β-glucosyltransferase (GGT).

(أ) محاذاة متواليات الأحماض الأمينية JrGGT1 و JrGGT2 من Juglans ريجيا مع QrGGT من Quercus robur (ميتاش وآخرون. ، 2014) و Medicago flavonoid glucosyltransferase (GT) بهيكل ثلاثي الأبعاد معروف. البقايا المميزة باللون الأزرق تتوافق مع المخلفات في (ب). يشير اللون الأزرق الداكن إلى بقايا الموقع النشطة الثلاثة التي تم اختيارها لترسيخ المحاذاة ثلاثية الأبعاد معًا في نمذجة DECAAF. المنطقة المحفوظة المستخدمة لبناء شجرة النشوء والتطور (الشكل 10) تقع داخل المنطقة المربعة الصفراء.

(ب) التراكب الناتج عن DECAAF ، الذي تم الحصول عليه عن طريق تراكب ذرات Cα (F302 و H378 و D402) من موقع ربط المانحين لـ GT (PDBid: 2PQ6). [PDBid: 2PQ6 باللون الأحمر ، QrGGT (بلوط) باللون الأخضر ، JrGGT1 باللون الأزرق و JrGGT2 باللون البرتقالي]. * هذه البقايا مختلفة كيميائيًا مجسمًا في بنك بيانات البروتين (PDB).

تحديد وتوصيف JrPPO1 الجين فيها J. ريجيا

لتحديد جينات PPO في J. ريجيا الجينوم ، استخدمنا تسلسل النوكليوتيدات لـ JrPPO1 (GenBank ACN86310.1) ، تم العثور عليه مسبقًا باستخدام التحليل الجنوبي (Escobar وآخرون، 2008). كان هذا التسلسل بمثابة استعلام BLASTN لملف J. ريجيا تجميعات الجينوم. سقالة مفردة 18 263 نقطة أساس (jcf7180001214880) تحتوي على JrPPO1 وجد. الثالوث من جديد التجمع كونتج c55545_g1_i1 ، والتي تطابقت JrPPO1، ويسمى هنا WALNUT_00030240-RA ، محاذاة تمامًا للسقالة الجينومية. يحتوي هذا الجين على المجالات المميزة الثلاثة لـ JrPPO1، PF00264: tyrosinase ، PF12143: PPO1_KFDV و PF12142: PPO1_DWL ، وفقًا لبحث NCBI CDD (Marchler-Bauer وآخرون. ، 2015) ، والتحقق من صحة شرح الجينوم الذي تم الحصول عليه باستخدام MAKER-P.

بلاستن من JrPPO1 تسلسل الترميز إلى الثالوث من جديد تجميع J. ريجيا حدد النسخ ثلاثة نصوص إضافية متوقعة: c44803_g1_i1 و c44803_g2_i1 و c44803_g3_i1. وقد تطابقت هذه مع الاستعلام بحوالي 80٪ من هوية التسلسل وجميعها تتماشى مع ORF الجينومي الفردي الذي قمنا بتعيينه JrPPO2. ييتس (تشاكرابورتي وآخرون. ، 2015) قطعة من التداخل بين c44803_g2_i1 و c44803_g3_i1 ، مما يشير إلى أنها جزء من نفس ORF كما هو موضح بشكل مستقل من خلال تصور القراءات التي تشكل JrPPO1 و JrPPO2 على السقالات المستقلة باستخدام عارض الجينوم المتكامل (IGV ، انظر الملحق S2). JrPPO2 موجود على سقالة مفردة 22390 نقطة أساس (jcf7180001216434). إنه يشفر جين PPO متميزًا عن JrPPO1 لكن يتقاسمون حوالي 71٪ من هوية تسلسل الأحماض الأمينية (انظر الملحق S2). قام MAKER-P بتعليق منطقة تشفير 1833-bp بالكامل JrPPO2 على هذه السقالة كجين منفرد exon ، WALNUT_00029754-RA ، يحتوي على ثلاثة مجالات InterProScan (IPR022739 و IPR022740 و IPR002227).

لتأكيد وجود الجينات التي تشفر JrPPO1 و JrPPO2 ، قمنا بتطوير بادئات PCR خاصة بالجينات كما هو موصوف لـ GGT (انظر الملحق S2). هذه البادئات (JrPPO1-F-cd و JrPPO1-R-cd JrPPO2-F-cd و JrPPO2-R-cd) تضخيم النطاقات المفردة التي تمثل مناطق تشفير JrPPO من الحمض النووي الجيني المعزول من مختلف J. ريجيا الأصناف (انظر الملحق S2). استهداف تفاعل البلمرة المتسلسل للتسلسلات التنظيمية لـ JrPPO1 أسفرت أمبليكونس للجميع J. ريجيا ومع ذلك ، فإن الأصناف التي تستهدف PCR JrPPO2 فشلت المناطق التنظيمية في تضخيم اثنين من أصل خمسة أصناف تم اختبارها ، مما يشير إلى التباين بين الأصناف في التسلسل التنظيمي لـ JrPPO2. تسلسل سانجر جرببو أمبليكونس دعم وجود كليهما JrPPO1 و JrPPO2 مع تسلسلات محفوظة بدرجة عالية ولكنها ليست متطابقة كما تنبأ بها WGS. لم يتم العثور على تكرارات في السقالة الجينية التي تحتوي على JrPPO1 و 43 SNPs عالية الجودة لا تحدث أي منها في منطقة الترميز JrPPO1.

JrPPO1 و JrPPO2 متمايزان نسبيًا (الشكل 10) ولكن كلاهما مرتبطان ارتباطًا وثيقًا بأشكال أسلاف جينات نبات PPO. تم الإبلاغ عن مجموعة متنوعة من جينات PPO في باتينز فيسكوميتريلا, جلايسين ماكس, Populus trichocarpa والجينومات الأخرى ، مع تباين في أطوال التسلسل وتوزيع واسع للإنترونات في كل من الأنساب أحادية النواة و eudicot ، على سبيل المثال في P. trichocarpa (PtPPO13) وكيريمويا (أنونا شيريمولا أكبو) (تران وآخرون. ، 2012). قد ينتج هذا التنوع الملحوظ عن دفعات مستقلة من الازدواج الجيني استجابة للتكيف البيئي وتنوع الوظائف الأنزيمية (Tran وآخرون., 2012 ).

تحليل النشوء والتطور الجزيئي بأسلوب الاحتمال الأقصى.

تم الاستدلال على التاريخ التطوري باستخدام طريقة الاحتمال القصوى بناءً على نموذج تصحيح بواسون (زوكيركاندل وبولينج ، 1965). يتم أخذ شجرة الإجماع التمهيدية المستنبطة من 1000 مكررة لتمثيل التاريخ التطوري للتصنيف الذي تم تحليله (Felsenstein ، 1985). تم طي الفروع المقابلة للأقسام المستنسخة في أقل من 50٪ من نسخ التمهيد. تم الحصول على الشجرة (الشجرات) الأولية للبحث الاسترشادي تلقائيًا عن طريق تطبيق طريقة البخل القصوى. اشتمل التحليل على 118 متوالية من الأحماض الأمينية. كان هناك 749 وظيفة في مجموعة البيانات النهائية. أجريت التحليلات التطورية في MEGA6 (Tamura وآخرون., 2013 ).

من تقييم التعبير الجيني في الأنسجة المختلفة ، يتم التعبير عن نسختين PPO المقابلة بشكل تفاضلي ، مع التعبير عن JrPPO1 في معظم الأنسجة الخضراء و JrPPO2 المعبر عنه بشكل أكثر تحديدًا في نسيج الكالس ، حيث يكون التعبير عن JrPPO1 أقل (الجدول 8). تشير محاذاة التسلسل المتعدد (الشكل 11) إلى أن كلا البروتينين مترجمان إلى الثايلاكويد وأنهما يحتويان على ببتيدات عبور مزدوجة نموذجية لمثل هذه البروتينات. احتوت سقالة jcf7180001216434 على 123 تعدد الأشكال عالي الجودة ، مع وجود الغالبية في منطقة الجين غير المشفرة. نتج عن أحد SNP داخل منطقة تشفير JrPPO2 تغيير غير مرادف: تغير الجلوتامين إلى ليسين (Q-33K) ، الموجود في ببتيد إشارة الثايلاكويد ، المشقوق. لتقييم العلاقة بين البنية والوظيفة لبقايا الموقع النشطة ، قمنا بنمذجة متواليات بروتين JrPPO1 و JrPPO2 باستخدام PPOs جيدة التوصيف من خامسا فينيفيرا و إيبوميو باتاتاس (معرفات PDB 2P3X و 1BT2 ، على التوالي) في SWISS-MODEL (Biasini وآخرون، 2014). يتكون الموقع النشط لهذه الإنزيمات من نطاقات فرعية ثنائية مرتبطة بالنحاس (الشكلان 11 و 12). تعتبر محاذاة بقايا الأحماض الأمينية في منطقة ربط CuA و CuB بين البروتينات الأربعة ذات أهمية خاصة. يتم حفظ بقايا الهيستيدين في المواضع 87 و 108 و 117 التي تربط CuA بدرجة عالية ، وكذلك بقايا الهيستيدين في المواضع 239 و 243 و 272 من المجال الفرعي CuB. يمكن تحديد خصوصية الركيزة من خلال الاختلافات في المخلفات في الموضعين 109 و 244. قمنا بفحص بقايا الموقع النشط عن طريق إرساء بنية فينيل ثيوريا ، مثبط PPO معروف ، إلى JrPPO1 باستخدام DOCLASP (تشاكرابورتي ، 2014). لتقليد التغييرات في الموقع النشط بسبب ارتباط فينيل ثيوريا ، استخدمنا هيكل PPO من I. الخفافيش مع فينيل ثيوريا المربوط (PDB ID: 1BUG Klabunde وآخرون. ، 1998) ، لطراز JrPPO1 مع SWISS-MODEL. يتم ربط ذرة الكبريت في فينيل ثيوريا بواسطة أيونات النحاس (الشكل 12 ب ، الجدول S13) ، مما يؤدي إلى تغييرات توافقية (الجدول S14). كلابوندي وآخرون. (1998) اقترح أن الحلقة العطرية لـ F259 تتحكم في الوصول إلى مركز المعدن الحفاز ، وتشكل حلقة فينيل من F259 وحلقة إيميدازول لـ H243 تفاعلات كارهة للماء مع الحلقة العطرية للمثبط بعد إجراء تغييرات توافقية وأخيراً يحل كبريت فينيل ثيوريا محل الجسر المائي الموجود في الإنزيم. وبالتالي ، نفترض أن PPOs من الأنواع المختلفة تشترك في ملف تعريف مثبط مماثل ، على الرغم من الاختلافات الواضحة في التسلسل والنشاط الأنزيمي المعروف

النصوص م CI CK م فلوريدا HC HL HP HU لو جنيه LM LY PK PL PT RT SE VB
c55545_g1_i1 63 44 1844 0 1657 36 530 140 44 287 1748 52 1519 2 0 19 19 1 1355
c44803_g1_i1 839 873 80 0 343 46 14 2 19 8 12 2 24 64 0 0 112 96 77
c44803_g2_i1 1719 647 131 0 312 57 19 1 9 7 15 1 23 64 3 0 538 124 93
c44803_g3_i1 804 242 56 0 154 22 7 0 6 2 6 1 10 25 0 0 223 53 37
  • CE ، الكالس الخارجي CI ، الكالس الداخلي CK ، catkins EM ، الجنين FL ، الزهرة pistillate HC ، قشرة بدن HL ، بدن غير ناضج HP ، قشر البدن HU ، تفكيك البدن IF ، الفاكهة غير الناضجة LE ، الأوراق LM ، الأوراق الناضجة LY ، أوراق الشباب PK ، تعبئة الأنسجة الناضجة PL ، pellicle PT ، تعبئة الأنسجة غير الناضجة RT ، الجذر SE ، الجنين الجسدي VB ، البرعم الخضري.

محاذاة تسلسل متعدد كامل الطول لتسلسلات البوليفينول أوكسيديز (PPO) من Juglans ريجيا, كرمة العنب الاوروبي و إيبوميو باتاتاس.

يتم عرض تسلسل الأحماض الأمينية PPO غير الناضجة بالطول الكامل قبل أي تعديل لاحق للترجمة على الببتيدات المؤشرة. يتم عرض الببتيد الذي يشير إلى البلاستيدات الخضراء (CSP) بواسطة شريط أخضر داكن والببتيد الذي يشير إلى الثايلاكويد (TSP) بواسطة شريط أخضر فاتح. تتم الإشارة إلى حلزونات ألفا بواسطة الكتل السميكة ، ويشار إلى صفائح بيتا بواسطة الأسهم السميكة ويتم الإشارة إلى المنعطفات غير المنظمة بواسطة الأسهم الرفيعة. يبدأ تعداد الأحماض الأمينية عند أول حمض أميني (Ala) للبنية البلورية 2P3X ، يتم اشتقاق الأرقام المقابلة لسندات ثاني كبريتيد وجسر thioester من بنية 2P3X. تتوافق حلزونات ألفا وأوراق بيتا مع الميزات الموضحة لـ VvPPO (2P3X) بواسطة Virador وآخرون. (2010). مواقع الانقسام المعروفة لـ Vv2P3X (Virador وآخرون.، 2010) و JrPPO1 (Zekiri وآخرون. ، 2014b) تتم الإشارة إلى CSP و TSP و C-terminus برمز "|" أسود يُشار إلى مواقع الانقسام المتوقعة في JrPPO2 برمز "|" أحمر.

نمذجة تسلسل البروتين JrPPO1 و JrPPO2 و 2P3X.

(أ) رسم خرائط لبقايا الموقع النشطة بالقرب من منطقتي ربط CuA و CuB لـ JrPPO1 و JrPPO2 مقارنة مع بوليفينول أوكسيديز العنب (PPO) (2P3X). تتم أيضًا مقارنة مناطق الموقع النشطة مع البطاطا الحلوة (1BT1).

(ب) إرساء phenylthiourea إلى JrPPO1 باستخدام DOCLASP: تم تصميم JrPPO1 باستخدام PPO من البطاطا الحلوة (PDB ID: 1BUG) بواسطة SWISS-MODEL. * تختلف هذه البقايا من الناحية الكيميائية الفراغية في قاعدة بيانات بروتين واحدة.


الآليات الكيميائية الحيوية والجزيئية لتحمل الإجهاد في مفصليات القطب الجنوبي

بالمقارنة مع الحشرات المعتدلة ، لم تحظ الآليات الجزيئية لتحمل الإجهاد في المفصليات القطبية الجنوبية باهتمام كبير. ومع ذلك ، تميزت الدراسات المبكرة في الثمانينيات بالعلامات البيوكيميائية للإجهاد البيئي ، واستفادت الدراسات الحديثة من التقدم في علم الأحياء الجزيئي. هنا ، سنراجع الآليات الفسيولوجية لتحمل الإجهاد في مفصليات الأرجل الأرضية في أنتاركتيكا ونبرز بعض السبل للبحث في المستقبل.

مثل نظرائهم في المناطق المعتدلة ، فإن التراكم الموسمي والناجم عن الإجهاد للمواد الواقية من الأسمدة منخفضة الوزن الجزيئي هو السمة المميزة لمفصليات الأرجل في القطب الجنوبي. كل الأنواع التي تم تحديدها حتى الآن تتراكم نوعًا من المركب الواقي من التناضح ، على الرغم من أن النوع والكمية يختلفان من نوع إلى نوع. على سبيل المثال ، العث A. القطب الجنوبي يستخدم الجلسرين في المقام الأول باعتباره مادة واقية للتناضح ، وتتراكم مستويات تزيد عن 0.5 مول لتر (Block and Convey ، 1995). وبالمثل ، فإن collembolan جيم القطب الجنوبي يستخدم الجلسرين باعتباره العامل الرئيسي للوقاية من التجمد ، كما يقوم أيضًا بتجميع الجلوكوز والتريهالوز استجابةً للجفاف (Elnitsky et al. ، 2008a). على النقيض من ذلك ، فإن الذروة ب. أنتاركتيكا تتراكم مستويات منخفضة جدًا من الجلسرين وبدلاً من ذلك تعتمد بشكل أساسي على الجلوكوز والإريثريتول والتريهالوز كمواد مقاومة للتناضح (Lee and Baust، 1981 Baust and Lee، 1983). أحد الموضوعات التي ظهرت من الدراسات التي أجريت على كل من الكائنات الحية التي تتحمل الجفاف في المناطق القطبية والمدارية هو أهمية التريهالوز باعتباره عاملًا مضادًا للتضخم أثناء الجفاف. تم إثبات أن مجموعة من الكائنات الحية ، بما في ذلك بعض البكتيريا والفطريات والنباتات والميتازوان ، تتراكم trehalose استجابة للجفاف (Elbein et al. ، 2003). في المفصليات ، يعمل التريهالوز عادةً كسكر في الدم وهو العامل الرئيسي للوقاية من التناضح في المفصليات القادرة على الإصابة بمرض اللامائية (Clegg ، 2001). الدراسات الحديثة في جيم القطب الجنوبي (Elnitsky et al. ، 2008a) و ب. أنتاركتيكا (Benoit et al.، 2007b Elnitsky et al.، 2008b) أوضحت أهميتها أثناء الجفاف الشديد في مفصليات الأرجل القطبية الجنوبية أيضًا.

في السنوات الأخيرة ، استفادت الدراسات الفسيولوجية لمفصليات الأرجل في القطب الجنوبي من التقدم في البيولوجيا الجزيئية وتكنولوجيا "omics" ، على الرغم من أن التجارب الجزيئية قد أجريت فقط في نوعين ، collembolan جيم القطب الجنوبي والجذع ب. أنتاركتيكا. بغض النظر ، بدأت هذه الدراسات في تقديم أدلة حول آليات تحمل الإجهاد في بعض مفصليات الأرجل الأكثر تطرفاً في العالم. يتم توفير ملخص للجينات المستجيبة للإجهاد المحددة في مفصليات القطب الجنوبي في الجدول 1.

التجارب الجزيئية في جيم القطب الجنوبي يقتصر على دراستين ميكروأري لتحمل البرد. في الأول ، تمت مقارنة الحيوانات ذات نقاط التبريد الفائق `` المنخفضة '' (& lt − 15 ° C) مع الحيوانات ذات نقاط التبريد الفائق `` العالية '' (& gt − 15 ° C) ، لتحديد الجينات المسؤولة عن خفض نقاط التبريد الفائق (Purać et al. ، 2008). احتوت هذه المصفوفة الدقيقة على مجموعة فرعية من 672 علامة تسلسل معبر عنها (ESTs) ، وبالتالي لم تكن شاملة. ومع ذلك ، تشير أنماط التعبير إلى تنظيم عدد من البروتينات الجلدية والمكونات الهيكلية الأخرى في المجموعة "المنخفضة" ، مما يؤكد أهمية البشرة ودورة الذوبان في تنظيم قدرة التبريد الفائق في القطب الجنوبي Collembolans (Worland and Convey ، 2008). تشمل الجينات الأخرى المنتظمة في المجموعة "المنخفضة" بالنسبة للمجموعة "العالية" العديد من جينات الميتوكوندريا المشاركة في تخليق ATP ، مما يشير إلى أن زيادة إنتاج الطاقة قد يكون أحد مكونات البقاء على قيد الحياة في درجات حرارة منخفضة. تشمل الجينات المنتظمة المحددة التي أكدها qPCR بروتينًا جلديًا و CHK1 ، وهو نقطة تفتيش متجانسة تشارك في تنظيم دورة الخلية. تم إجراء تجربة مماثلة في وقت لاحق باستخدام مصفوفة ميكروأري أكبر (تحتوي على 5400 ESTs) ، ومرة ​​أخرى ، تم تنظيم عدد من الجينات الجليدية والجينات المشاركة في دورة الذوبان في collembolans المتكيف مع البرودة (Burns et al. ، 2010). في هذه الدراسة ، تم تأكيد ثلاثة جينات (بروتين سكري هيكلي للجسيم الداخلي SgAbd-4 ، وبروتين جلدي 49Ah و peritrophin A المرتبط بالكيتين) للتنظيم بواسطة qPCR ، بينما تم التحقق من ترميز mRNA لبروتين المصفوفة خارج الخلية tenebrin للتنظيم.

بالنسبة لمفصليات الأرجل الأخرى في أنتاركتيكا ، سلسلة جبال القطب الجنوبي ب. أنتاركتيكا خضع لأكبر عدد من الدراسات الجزيئية. كما هو الحال في الحشرات المعتدلة ، فإن بروتينات الصدمة الحرارية هي وسطاء مهمون لتحمل الإجهاد في ب. أنتاركتيكا. ومع ذلك ، في حين أن معظم الحشرات تعبر عن جينات تشفر بروتينات الصدمة الحرارية عند مستويات منخفضة جدًا حتى تكون هناك حاجة إلى البروتينات ، فإن يرقات ب. أنتاركتيكا تعبر بشكل أساسي عن الجينات التي تشفر بروتينات الصدمة الحرارية عند مستويات عالية طوال الوقت (Rinehart et al. ، 2006). بينما البالغون من ب. أنتاركتيكا لها استجابة بروتينية نموذجية للصدمة الحرارية ، لا تزيد الحرارة ولا البرودة من التعبير عن ثلاثة بروتينات مختلفة للصدمة الحرارية (hsp ، hsp70 و hsp90) في اليرقات. من المحتمل أن يوفر هذا الوجود المستمر لبروتينات الصدمة الحرارية حماية على مدار العام ضد الإجهاد البيئي ، والذي يمكن أن يكون متكررًا ولا يمكن التنبؤ به في القارة القطبية الجنوبية البحرية. في حين أن التعبير العالي عن بروتينات الصدمة الحرارية يعوق النمو والتطور (Krebs and Feder ، 1997) ، فإن يرقات ب. أنتاركتيكا قادرون على التحايل على هذا وإنتاج بروتينات الصدمة الحرارية بمستويات عالية حتى أثناء تغذيتهم ونموهم.

الدفاعات التأسيسية في ب. أنتاركتيكا لا تقتصر على بروتينات الصدمة الحرارية. وبالمثل ، تعبر اليرقات عن جينات تشفر ديسموتاز الإنزيم الفائق للأكسدة بمستويات عالية حتى في غياب الإجهاد التأكسدي الصريح (Lopez-Martinez et al. ، 2008). مستويات Superoxide disutase mRNA ، وكذلك ترميز mRNAs الكاتلاز وثلاثة بروتينات الصدمة الحرارية ، تزداد بشكل متواضع بعد التعرض لأشعة الشمس. في الواقع ، يمنح التعبير عن هذه الجينات مقاومة عالية للغاية للضرر التأكسدي في ب. أنتاركتيكا، باعتبارها القدرة المضادة للأكسدة ب. أنتاركتيكا اليرقات أكبر بخمس مرات من يرقات حشرة معتدلة تتحمل التجمد ، E. Solidaginis (لوبيز مارتينيز وآخرون ، 2008). البالغون من ب. أنتاركتيكا لديهم مستويات أعلى من القدرة المضادة للأكسدة ، ربما بسبب تعرضهم شبه المستمر لأشعة الشمس أثناء سيرهم على السطح بحثًا عن زملائهم. تعد مقاومة الضرر التأكسدي أمرًا بالغ الأهمية لمفصليات الأرجل في القطب الجنوبي ، حيث يحتوي ضوء الشمس في القطب الجنوبي على مستويات عالية جدًا من الأشعة فوق البنفسجية (Liao and Frederick ، ​​2005) ، والتي تتفاقم نتيجة لتلف الأوزون (Weatherhead and Andersen ، 2006). علاوة على ذلك ، من المعروف أن النوبات المتكررة من التعرض للتجميد والذوبان ، وهو أمر شائع في أنتاركتيكا ، تسبب أضرارًا تأكسدية في الحشرات (Lalouette et al. ، 2011).

في الآونة الأخيرة ، تم ربط الأكوابورينات كمنظمين رئيسيين لحركة المياه أثناء الظروف المجهدة مثل الجفاف (Liu et al. ، 2011) والتجميد (Philip et al. ، 2008 Philip and Lee ، 2010). الأكوابورينات عبارة عن بروتينات مكونة للمسام تحمل الماء ، وأحيانًا مواد مذابة أخرى ، عبر غشاء الخلية (Borgnia et al. ، 1999). نظرًا لأن مفصليات القطب الجنوبي تواجه تحديات من خلال أشكال عديدة من الإجهاد التناضحي ، بما في ذلك التجميد والجفاف والغطس في مياه البحر ، فمن المحتمل أن تلعب الأكوابورينات دورًا مهمًا في التوسط في تحمل الإجهاد. جوتو وآخرون. (Goto et al.، 2011) تم استنساخ وتمييز أول أكوابورين من أحد مفصليات القطب الجنوبي ، وهو جين يشبه aquaporin-1 من ب. أنتاركتيكا. عندما يتم التعبير عنها بتنسيق Xenopus البويضات ، هذا البروتين قادر على نقل الماء ، ولكن ليس اليوريا أو الجلسرين ، عبر غشاء الخلية. يتم التعبير عن جين أكوابورين المحدد في عدة أنسجة مختلفة ، مما يشير إلى أنه قد يلعب دورًا عامًا في حركة الماء عبر الخلايا. ومع ذلك ، لم يتغير تعبير mRNA استجابةً للجفاف ، لذلك ليس من الواضح ما هو الدور الذي يلعبه هذا الجين ، إن وجد ، في التوسط في تحمل الإجهاد. دراسة ثانية عن ب. أنتاركتيكا وجدت الأكوابورينات نشاطًا مناعيًا لأربعة أجسام مضادة مختلفة من أنواع مختلفة ، وكان بعضها محرضًا على الإجهاد (Yi et al. ، 2011). ومع ذلك ، لم يتم تحديد هوية تسلسل هذه الجينات aquaporin. في نفس الدراسة ، أدى منع الأكوابورينات دوائياً باستخدام كلوريد الزئبق إلى تقليل خارج الجسم الحي تحمل التجميد للدهون في الجسم والأمعاء المتوسطة وأنسجة نبيبات Malpighian ، مما يشير إلى أن الأكوابورينات ضرورية لإعادة توزيع المياه أثناء التجميد. بالإضافة إلى ذلك ، قلل كلوريد الزئبق من فقدان الماء في أنسجة الأمعاء المتوسطة ، مما يشير إلى أن الأكوابورينات تلعب أيضًا دورًا مهمًا في التوسط في إجهاد الجفاف.

قائمة الجينات المنتظمة في الإجهاد التي تم تحديدها في مفصليات القطب الجنوبي

يبدو أن الجينات المشاركة في تعبئة احتياطيات الطاقة وتوليف المواد الواقية للتضخم هي أيضًا مكونات أساسية لاستجابة الإجهاد في ب. أنتاركتيكا. باستخدام qPCR ، تيتس وآخرون. (Teets et al. ، 2013) لمحات عن التعبير عن 11 جينًا متورطًا في انهيار الجليكوجين ، وتكوين السكر ، واستقلاب البوليول والتريهالوز ، وتخليق البرولين. تؤدي درجة الحرارة المرتفعة والمنخفضة إلى تنظيم سريع للجينات المشاركة في تعبئة الجلوكوز ، بما في ذلك النصوص التي ترميز الجليكوجين فسفوريلاز و phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) ، وهو إنزيم يحد من معدل تكوين السكر. تتوافق هذه النتائج مع الملاحظات السابقة لتعبئة الجلوكوز الناجم عن البرد في يرقات ب. أنتاركتيكا (تيتس وآخرون ، 2011). في المقابل ، تؤدي درجات الحرارة المرتفعة والمنخفضة الحادة إلى تقليل التنظيم العام للجينات المشاركة في تخليق التريهالوز والبرولين. استجابةً للجفاف ، تعتمد أنماط التعبير الجيني بشكل كبير على نوع الجفاف الذي يعاني منه. الجفاف السريع عند 75٪ رطوبة نسبية له توقيع نسخي مشابه كتلك التي لوحظت في الاستجابة للحرارة والبرودة ، أي انتفاخ الجينات التي تشفر إنزيمات تعبئة الجلوكوز (أي PEPCK وفوسفوريلاز الجليكوجين) مع التنظيم المتزامن للجينات المشاركة في تخليق التريهالوز والبرولين. في المقابل ، في حين أن الجفاف البطيء عند 98٪ RH والجفاف الوقائي يحفزان أيضًا على التعبير عن بيبك، تعمل هذه العلاجات على تنظيم الجينات المشاركة في تخليق التريهالوز والبرولين ، بما يتوافق مع تراكم التريهالوز (Benoit et al. ، 2007b Elnitsky et al. ، 2008b) والبرولين (Teets et al. ، 2012b) أثناء الجفاف لفترات طويلة.

كما استفادت مناهج "omics" غير المستهدفة من فهمنا لتحمل الإجهاد في ب. أنتاركتيكا. باستخدام التهجين الطرحي القمعي ، Lopez-Martinez et al. (Lopez-Martinez et al. ، 2009) حصل على عدد من الحيوانات المستنسخة المستجيبة للجفاف ، وأكدت البقع الشمالية أن 23 منها تم التعبير عنها بالفعل بشكل تفاضلي إما أثناء الجفاف أو الجفاف. تشمل الجينات المنتظمة تلك التي تشفر ثلاثة بروتينات صدمة حرارية (hsp26 و hsp70 و hsp90) والجينات التي تشفر اثنين من إنزيمات مضادات الأكسدة (ديسموتاز الفائق والكاتلاز) ، مما يشير إلى أن تمسخ البروتين والأضرار التأكسدية هي أعراض إجهاد الجفاف. تشمل الجينات الأخرى التي يتم تنظيمها أثناء الجفاف ترميز الجينات لبروتينات الهيكل الخلوي وإعادة هيكلة الغشاء ، بما يتوافق مع الملاحظات السابقة بأن الجفاف يسبب إعادة تنظيم الهيكل الخلوي (Chen et al. ، 2005) وإعادة تشكيل دهون الغشاء (Bayley et al. ، 2001). بالإضافة إلى ذلك ، يتم تنظيم العديد من الجينات استجابةً للجفاف ، بما في ذلك جينات سلسلة نقل الإلكترون ، مما يشير إلى توقف التمثيل الغذائي أثناء الجفاف.

حتى الآن ، تم إجراء دراسة تعبيرية واحدة على مستوى الجينوم في مفصليات الأرجل في القطب الجنوبي. باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي المستندة إلى Illumina ، تيتس وآخرون. (Teets et al.، 2012b) لمحة عن التعبير عن

13500 نسخة استجابة لكل من الجفاف عند درجة حرارة ثابتة والجفاف الواقي من التجمد. ينتج عن كلا العلاجين تغييرات كاسحة في التعبير الجيني ، حيث أدى الجفاف والجفاف الوقائي للبرودة إلى حدوث تغييرات جذرية في التعبير الجيني.

18٪ ، على التوالي ، من جميع الجينات التي يتم التعبير عنها تفاضليًا. أكدت هذه النتائج الدور الحاسم لبروتينات الصدمة الحرارية أثناء الإجهاد البيئي في ب. أنتاركتيكا، حيث تم تنظيم 15 نسخة مختلفة من بروتين الصدمة الحرارية بواسطة أحد علاجي الجفاف أو كليهما. في الوقت نفسه ، تسبب الجفاف في تنظيم الجينات المشاركة في إعادة تدوير / تدهور البروتينات والجزيئات الخلوية الكبيرة ، بما في ذلك الإثراء الكبير لجينات البروتوزوم والالتهام الذاتي. مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن التنظيم المنسق لبروتينات الصدمة الحرارية ووظيفة البروتوزوم والالتهام الذاتي بوساطة يوبيكويتين لإعادة تدوير وإزالة المكونات الخلوية التالفة أثناء الجفاف ، وبالتالي الحفاظ على الطاقة وتعزيز بقاء الخلية (الشكل 3). نحن نفترض أن الالتهام الذاتي مهم بشكل خاص للبقاء على قيد الحياة في فصل الشتاء في القطب الجنوبي ، حيث يمنع هذا المسار موت الخلايا المبرمج وغيره من أشكال موت الخلايا خلال فترات طويلة من الإجهاد الخلوي (Teets and Denlinger ، 2013). يتسبب الجفاف والجفاف الوقائي بالتبريد أيضًا في تقليل التنظيم العام للجينات الأيضية المركزية ، بما في ذلك الجينات المشاركة في تحلل السكر ودورة حمض الكربوكسيل واستقلاب الدهون ، مما يشير إلى أن الجفاف يسبب تحولًا جزيئيًا إلى نقص التمثيل الغذائي الذي يحافظ على الطاقة ويمنع التراكم السام للنهاية الأيضية المنتجات (تيتس وآخرون ، 2012 ب). في الواقع ، ترتبط التغييرات في المستقلب جيدًا بتغيرات التعبير الجيني ، مما يشير إلى أن التغييرات المنسقة في التعبير الجيني والتمثيل الغذائي تتحكم في الاستجابات للظروف البيئية القاسية.


شاهد الفيديو: 27- الكشف عن إنزيم دياستيز Diastase (أغسطس 2022).