معلومة

14.3: تفاصيل النسخ - علم الأحياء

14.3: تفاصيل النسخ - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ابحث عن ملخص مكتوب جيدًا للنسخ في بدائيات النوى وحقيقيات النوى على موقع المعاهد الوطنية للصحة (النسخ في بدائيات النوى وحقيقيات النوى). هنا (وعلى هذا الرابط) ، ستصادف بروتينات تربط الحمض النووي. تربط بعض البروتينات الدنا لتنظيم نسخ الجين أو حثه أو إسكاته. تتفاعل بروتينات أخرى مع الحمض النووي ببساطة للسماح بالنسخ. يتضمن ذلك واحدًا أو أكثر ، جنبًا إلى جنب مع RNA polymerase نفسه ، يجب أن يرتبط بمحفز الجينات لبدء النسخ. سننظر في النسخ البكتيري أولاً.

A. النسخ في بدائيات النوى

في E. coli ، يقوم بوليميراز RNA واحد بنسخ جميع أنواع RNA ، مرتبطًا بواحد من عدة بروتينات عامل سيجما ( ( سيجما ) -العوامل) لبدء النسخ. اتضح أن متواليات المحفز المختلفة والعوامل المقابلة لها تلعب أدوارًا في نسخ الجينات المختلفة (كما هو موضح أدناه).

في حالة عدم وجود عامل ( سيجما ) - ، فإن ملف بكتريا قولونية يمكن لبوليميراز الحمض النووي الريبي نسخ الحمض النووي الريبي ، ولكنه يفعل ذلك بمعدل مرتفع ، ومن تسلسلات عشوائية في الكروموسوم. في المقابل ، عندما يرتبط العامل ( سيجما ) - ببوليميراز الحمض النووي الريبي ، يبدو أن المركب يمسح الحمض النووي ، ويتعرف على تسلسل المحفز للجين ثم يرتبط به. في هذه الحالة ، يكون معدل النسخ الإجمالي أبطأ ، ولكن يتم نسخ الجينات فقط ، بدلاً من القطع العشوائية للجينوم البكتيري! ال مربع Pribnow ، تم تسميته باسم مكتشفه ، وكان أول تسلسل مروج تم تمييزه.

الاستطالة هي الإضافة المتتالية للنيوكليوتيدات المكملة لقوالب الحمض النووي الخاصة بها ، وتشكل روابط الفوسفوديستر. تفاعلات الاستطالة الأنزيمية مشابهة لاستطالة الحمض النووي المحفزة ببوليميراز أثناء النسخ المتماثل.

هناك طريقتان "يعرفهما" بوليميريز الحمض النووي الريبي البكتيري عندما يصل إلى نهاية وحدة النسخ. في حالة واحدة ، مع اقتراب بوليميراز الحمض النووي الريبي من نهاية النسخة الوليدة ، فإنه ينسخ 72 قاعدة ، منطقة غنية بالسيليوم. في هذه المرحلة ، أ عامل الإنهاء دعا رو البروتين يرتبط بحبال الحمض النووي الريبي الناشئ. رو هي عبارة عن هيليكاز تعتمد على ATP وتكسر روابط H بين الحمض النووي الريبي (RNA) وخيط DNA النموذجي ، وبالتالي تمنع المزيد من النسخ.

يعتمد على Rho يتم توضيح الإنهاء أدناه.

في آلية الإنهاء الأخرى ، يقوم البوليميراز بنسخ الحمض النووي الريبي الذي إشارة الإنهاء يفترض الثانوية حلقة دبوس الشعر الهيكل الذي يتسبب في تفكك بوليميريز RNA ، قالب DNA ونسخة RNA الجديدة. دور حلقة دبوس الشعر في إنهاء مستقل عن rho هو موضح أدناه.

B. النسخ في حقيقيات النوى

في حين تعتمد البكتيريا على بوليميريز RNA واحد لاحتياجات النسخ الخاصة بها ، تستخدم حقيقيات النوى ثلاثة أنواع مختلفة من بوليميراز RNA لتجميع الأنواع الثلاثة الرئيسية المختلفة من RNA ، كما هو موضح أدناه.

لاحظ أن تحفيز تخليق معظم الحمض النووي الريبي في خلية حقيقية النواة (rRNAs) يتم بواسطة RNA polymerase I. بمساعدة بروتينات البدء ، يبدأ كل RNA polymerase النسخ في تسلسل محفز. بمجرد البدء ، تحفز بوليميرات الحمض النووي الريبي التكوين المتتالي لروابط الفوسفوديستر لإطالة النص. تذكر أن mRNAs هي الأقل وفرة في حقيقيات النوى كما هي في الخلايا البكتيرية.

لسوء الحظ ، فإن تفاصيل إنهاء النسخ في حقيقيات النوى ليست مفهومة جيدًا كما هي في البكتيريا. لذلك ، سوف نركز على البدء ، ثم ننظر في معالجة مختلف أنواع الحمض النووي الريبي حقيقية النواة إلى جزيئات جاهزة للاستخدام.

1. نسخ mRNA حقيقية النواة

يتم عرض الخطوات المتعددة لنسخ mRNA حقيقية النواة في الصفحة التالية.

نسخ mRNAs حقيقية النواة بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي II يبدأ بالتجميع المتسلسل لحقيقة النواة مجمع البدء في محفز الجينات. يحتوي محفز حقيقيات النوى النموذجي لجين تشفير البروتين على صندوق TATA DNA عزر التسلسل بالإضافة إلى تسلسلات إضافية قصيرة المنبع. ملزم تاتا يرتبط البروتين (TBP) أولاً بصندوق TATA مع TFIID (عامل بدء النسخ IID).

هذا المجندين المتوسطين TFIIA و TFIIB. التالي، TFGIIE, TFIIF و TFIIH، العديد من عوامل البدء الأخرى و RNA polymerase II مرتبطة لتشكيل النسخ مجمع البدء. تضيف الفسفرة العديد من الفوسفات إلى aminoterminus من بوليميريز RNA ، وبعد ذلك ينفصل بعض من TF عن معقد البدء. يمكن الآن لمركب RNA polymerase-TF المتبقي أن يبدأ في صنع mRNA.

على عكس بوليميراز الحمض النووي الريبي بدائية النواة ، لا يحتوي RNA Polymerase II حقيقي النواة على نشاط هليكاز متأصل. لهذا ، يعتمد نسخ الجينات حقيقية النواة على بروتين TFIIH متعدد الوحدات الفرعية ، حيث يكون لوحدتان فرعيتان نشاط هيليكس. بما يتفق مع علاقة أوثق العتيقة بالنسبة إلى حقيقيات النوى (بدلاً من بدائيات النوى) ، فإن بدء نسخ mRNA البدائي يشبه مثيل حقيقيات النوى ، وإن كان يتطلب عددًا أقل من عوامل البدء أثناء تكوين مجمع البدء.

هناك فرق كبير بين النسخ بدائية النواة والنسخ حقيقية النواة هو أن بوليميريز RNA والبروتينات الأخرى المشاركة في محفز الجينات لا ترى الحمض النووي العاري. بدلاً من ذلك ، يجب أن يتعرفوا على تسلسلات DNA معينة من خلال بروتينات الكروماتين. من ناحية أخرى ، تشترك جميع البروتينات التي تتفاعل مع الدنا في الحاجة إلى التعرف على تسلسل الحمض النووي الذي يجب أن ترتبط به… ، داخل الحلزون المزدوج. بعبارة أخرى ، يجب أن يروا القواعد داخل اللولب ، وليس على سطحه الفقري الكهروسلبي المنتظم للفوسفات. تحقيقا لهذه الغاية ، يجب عليهم اختراق الحمض النووي ، عادة من خلال الأخدود الرئيسي من الحلزون المزدوج. سنرى أن البروتينات التنظيمية للحمض النووي تواجه نفس المشاكل في تحقيق تفاعلات محددة تعتمد على الشكل!

2. حقيقيات النواة tRNA و 5SRNA النسخ

نسخ 5S rRNA و tRNAs بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي الثالث أمر غير معتاد من حيث أن تسلسل المروج الذي يرتبط به (بمساعدة عوامل البدء) ليس في مقدمة التسلسل المكتوب ، ولكنه يقع ضمن التسلسل المكتوب. بعد الارتباط بهذا المروج الداخلي ، يعيد البوليميراز وضعه لنسخ الحمض النووي الريبي من موقع بدء النسخ بحيث يحتوي النص النهائي بالتالي على تسلسل المروج!

5S rRNA بواسطة RNA polymerase III موضح أدناه.

3. نسخ الرنا الريباسي الأخرى حقيقية النواة

يتم نسخ الحمض النووي الريبي أيضًا بواسطة RNA polymerase III بنفس طريقة 5S rRNA. يتم نسخ الرنا الريباسي الأخرى بواسطة RNA polymerase I ، والذي يرتبط بمحفز المنبع جنبًا إلى جنب مع عوامل بدء النسخ. نحن نعرف القليل عن تفاصيل هذه العملية مقارنة بفهمنا لنسخ الرنا المرسال. سوف نستكشف ما نعرفه بعد ذلك. كما لوحظ بالفعل ، إنهاء النسخ غير مفهوم جيدًا في حقيقيات النوى كما هو الحال في بدائيات النوى. تتم مناقشة خطوات الإنهاء المقترن وعديد الأدينيل الشائعة لمعظم mRNAs بدائية النواة بمزيد من التفاصيل أدناه ، مع ملخص مفيد على موقع NIH-NCBI هنا.


Florigen يأخذ اثنين إلى رقصة التانغو

حددت موجة نشاط حديثة البروتين FLOWERING LOCUS T (FT) على أنه إشارة متنقلة أو "florigen" التي تحفز الإزهار. أظهرت دراسة جديدة أن بروتين 14-3-3 يربط FT بعامل النسخ في قمة النبات لبدء الإزهار.

منذ أكثر من 75 عامًا ، تبين أن تطعيم ورقة واحدة من نبات محرض على الإزهار على نبات غير مزهر يمكن أن يؤدي إلى ازدهارها. كانت تسمى الجزيئات غير المعروفة التي عبرت تقاطعات الكسب غير المشروع لبدء الإزهار "florigens" ، ولكن لم يتم التعرف على أي منها حتى بعد عقود عديدة من البحث 1. ظهرت هوية FT كبروتين له القدرة على تسريع الإزهار في أواخر التسعينيات من الدراسات التي أجريت على النبات النموذجي نبات الأرابيدوبسيس thaliana 2،3. يتكون FT في الأوراق ، لكن آثاره تحدث عند الطرف المتنامي أو قمة إطلاق النار ، حيث يتم إحداث نسيج نباتي. FT نفسها عبارة عن بروتين كروي صغير بدون مجالات إشارة واضحة لتفسير نشاطها البيولوجي القوي 4. بعد بضع سنوات ، وجد أنه لتسريع الإزهار ، تتطلب FT عامل نسخ ، FD ، يتم التعبير عنه حصريًا في قمة النبات 5،6. هذا يشير إلى أن FT نفسها يمكن أن تكون إشارة ازدهار متنقلة ، وهو احتمال تم تأكيده لاحقًا في كليهما أرابيدوبسيس والأرز 7،8. ومع ذلك ، ظل الأساس الهيكلي للتفاعل بين FT و FD غير معروف. الآن ، في دراسة مهمة نشرت في طبيعة سجيةقام تاوكا وزملاؤه 9 بحل هذا اللغز من خلال بنية مركب من بروتينات الأرز تحتوي على FT و FD مرتبطًا ببروتين 14-3-3. يقترحون أن ترسو FT بالبروتين 14-3-3 ثم تنضم إلى FD في النواة ، حيث يمكن أن ترتبط بالحمض النووي وتبدأ نسخ جينات الهوية الزهرية ، مما يؤدي إلى تكوين الأعضاء الزهرية.


DNA و RNA

RNA و DNA جزيئات متشابهة جدًا. كلاهما من الأحماض النووية (أحد جزيئات الحياة الأربعة) ، وكلاهما مبني على أساس من النيوكليوتيدات وكلاهما يحتوي على أربع قواعد نيتروجينية تتزاوج.

يحتوي خيط من الحمض النووي على سلسلة من النيوكليوتيدات المتصلة. يحتوي كل نوكليوتيد على سكر وقاعدة نيتروجينية ومجموعة فوسفاتية. يوجد ما مجموعه أربع قواعد نيتروجينية مختلفة في الحمض النووي: الأدينين (A) ، الثايمين (T) ، الجوانين (G) ، والسيتوزين (C).

غالبًا ما يتم العثور على خيط من الحمض النووي مرتبطًا بحبل آخر من الحمض النووي في حلزون مزدوج. يتم ربط شريطين من الحمض النووي معًا بواسطة قواعدهما النيتروجينية. تشكل القواعد ما يسمى & # 8216 أزواج القاعدة & # 8217 حيث يترابط الأدينين والثيمين معًا ويترابط الجوانين والسيتوزين معًا.

يعد الأدينين والثايمين قواعد تكميلية ولا ترتبط بالجوانين والسيتوزين. يرتبط الجوانين والسيتوزين ببعضهما البعض فقط وليس الأدينين أو الثايمين.

هناك نوعان من الاختلافات الرئيسية بين بنية جزيئات DNA و RNA. تحتوي على سكريات مختلفة. يحتوي الحمض النووي على سكر ديوكسيريبوز بينما يحتوي الحمض النووي الريبي على سكر ريبوز.

في حين أن ثلاثة من القواعد النيتروجينية الأربعة هي نفسها ، فإن جزيئات الحمض النووي الريبي لديها قاعدة تسمى uracil (U) بدلاً من قاعدة الثايمين. أثناء النسخ ، يستبدل اليوراسيل موضع الثايمين ويشكل أزواجًا تكميلية مع الأدينين.


استطالة

أثناء النسخ ، يجتاز بوليميراز الحمض النووي الريبي بعد المحاولات الفاشلة الأولية الشريط النموذجي للحمض النووي في اتجاه 3 "إلى 5" ، مما ينتج عنه حبلا تكميليًا من الحمض النووي الريبي في اتجاه 5 "إلى 3". مع تقدم بوليميراز الحمض النووي الريبي ، فإن خيط الدنا الذي تم نسخه يعيد لفه ليشكل حلزونًا مزدوجًا.

أثناء الترجمة ، يرتبط aminoacyl t-RNA الوارد بالكودون (تسلسل 3 نيوكليوتيدات) في الموقع A وتتشكل رابطة الببتيد بين الحمض الأميني الجديد وسلسلة النمو. ثم يقوم الببتيد بتحريك موضع كودون واحد للاستعداد للحمض الأميني التالي. ومن ثم تستمر العملية في اتجاه من 5 إلى 3.


خطوات النسخ

الشكل 2. يحدث النسخ في ثلاث خطوات - البدء والاستطالة والإنهاء - جميعها موضحة هنا.

يتم النسخ في ثلاث خطوات: البدء والاستطالة والإنهاء. الخطوات موضحة في الشكل 2.

  1. المبادرة هي بداية النسخ. يحدث عندما يرتبط إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي بمنطقة من الجين تسمى المحفز. يشير هذا إلى تفكك الحمض النووي حتى يتمكن الإنزيم من "قراءة" القواعد في أحد خيوط الحمض النووي. أصبح الإنزيم الآن جاهزًا لصنع خيط من الرنا المرسال مع سلسلة تكميلية من القواعد.
  2. استطالة هي إضافة النيوكليوتيدات إلى خيط الرنا المرسال. يقرأ بوليميراز الحمض النووي الريبي خيط الحمض النووي غير الملفوف ويبني جزيء الرنا المرسال باستخدام أزواج القواعد التكميلية. هناك وقت قصير خلال هذه العملية عندما يكون الحمض النووي الريبي المتشكل حديثًا مرتبطًا بالحمض النووي غير الملتحم. خلال هذه العملية ، يرتبط الأدينين (A) في الحمض النووي باليوراسيل (U) في الحمض النووي الريبي.
  3. نهاية هي نهاية النسخ ، وتحدث عندما يعبر RNA polymerase تسلسل توقف (إنهاء) في الجين. اكتمل خيط الرنا المرسال ، وينفصل عن الحمض النووي.

يقدم هذا الفيديو مراجعة لهذه الخطوات. يمكنك التوقف عن مشاهدة الفيديو في الساعة 5:35. (بعد هذه النقطة ، فإنه يناقش الترجمة ، والتي سنناقشها في النتيجة التالية.)


نقاش

في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في تنظيم Xwee1 بواسطة 14-3-3 بروتينات ودور هذه العملية في التحكم في دورة الخلية فيXenopus مستخلصات البيض. يرتبط Xwee1 بـ 14-3-3 بروتينات بطريقة تعتمد على دورة الخلية. يحدث هذا التفاعل أثناء الطور البيني ، عندما يكون Xwee1 أكثر نشاطًا. يتم تقليل ارتباط 14-3-3 بشدة خلال المرحلة M ، وفي ذلك الوقت يكون نشاط Xwee1 خاضعًا للتنظيم (Mueller وآخرون.، 1995 أ). يتطلب ربط 14-3-3 بروتينات فسفرة Xwee1 على Ser-549. يمكن لـ Xchk1 أن فسفوريلات Ser-549 من Xwee1 جيدًا في المختبر ، ويصبح المؤتلف Xwee1 فسفورًا في هذا الموقع في Xenopus مستخلصات البيض. يعزز ارتباط 14-3-3 بـ Xwee1 بشكل كبير نشاط كيناز Xwee1 تجاه Cdc2 ويؤثر أيضًا على توزيع Xwee1 في جميع أنحاء النواة (الشكل 7). يبدو أن التفاعل بين Xwee1 و 14-3-3 مهم من الناحية البيولوجية في Xenopusمستخلصات البيض. على سبيل المثال ، طافرة Xwee1 المؤتلفة (S549A) ، والتي تكون ناقصة للربط 14-3-3 ، قللت بشكل كبير من فاعلية تأخير الدخول الانقسامي في مستخلصات بيض الدراجات.

ال Xenopus يمكن لكل من كينازات نقاط التفتيش Xchk1 و Xcds1 فسفرة السيرين الحرج (البقايا 287) في موقع الربط 14-3-3 من Xenopus Cdc25 (Kumagai وآخرون.، 1998a Guo and Dunphy، 2000). نظرًا لأن Xwee1 يمكنه أيضًا ربط 14-3-3 بروتينات ، فقد سألنا عما إذا كانت هذه الكينازات يمكن أن تؤدي إلى فسفوريلات Xwee1. ركزنا في البداية على Xchk1 ، الذي أنشأه مختبرنا سابقًا باعتباره مهمًا لتنظيم دورة الخلية استجابةً للحمض النووي غير المكرر أو المتضرر من الأشعة فوق البنفسجية (Kumagai وآخرون.، 1998a). Xcds1 ، الذي يتم تنشيطه من خلال وجود نهايات DNA مزدوجة الشريطة في مستخلصات البيض (Guo and Dunphy ، 2000) ، يمكنه أيضًا فسفوريلات Xwee1 في المختبر (نتائجنا غير المنشورة). ومع ذلك ، في هذا الوقت ، فإن التحليل الإضافي للعلاقة بين Xcds1 و Xwee1 معقد بسبب حقيقة أن الاستنفاد المناعي لـ Xcds1 لا يضر بتأخير دورة الخلية الناجم عن نهايات الحمض النووي مزدوجة الشريطة (Guo and Dunphy ، 2000).

في حالة Xchk1 ، تدعم بياناتنا علاقة وظيفية بين منظم نقاط التفتيش هذا و Xwee1. أولاً ، كل من His6-Xchk1 المؤتلف والمناعة المناعية Xchk1 من Xenopus مستخلصات البيض فسفوريلات Xwee1 في المختبر على Ser-549 ، وبالتالي تسمح بربط 14-3-3 بروتينات. يبدو أن هذا الفسفرة خاص بـ Ser-549 ، لأن بروتين متحولة GST-Xwee1-S549A كامل الطول هو ركيزة رديئة لـ Xchk1. ثانيًا ، تشير تجارب الاستنفاد المناعي أيضًا إلى أن Xchk1 و Xwee1 يقعان على مسار مشترك. يؤدي الاستنفاد المناعي لكل من Xchk1 أو Xwee1 وحده إلى الإضرار بنقطة تفتيش النسخ المتماثل في مستخلصات البيض ، على الرغم من أن الخلل في المستخلصات المستنفدة لـ Xchk1 أكثر خطورة إلى حد ما. كان من الممكن توقع هذه النتيجة ، لأن Xchk1 يمتلك هدفًا آخر واحدًا على الأقل في هذا النظام (على سبيل المثال ، Cdc25). بشكل ملحوظ ، فإن مستخلصات البيض التي تفتقر إلى Xchk1 بمفردها أو كلاهما Xchk1 و Xwee1 تعرض عيبًا متطابقًا تقريبًا في نقطة فحص النسخ المتماثل. تجادل هذه التجربة بأن Xchk1 و Xwee1 يعملان في نفس المسار. أخيرًا ، يقلل الاستنفاد المناعي لـ Xwee1 بشكل كبير من تأخير دورة الخلية الناتج عن إضافة فائض المؤتلف His6-Xchk1 إلى مستخلصات البيض ، مما يشير إلى أن Xchk1 يتطلب Xwee1 لإيقاف تقدم دورة الخلية في هذا السياق.

ربما تكون النتيجة المركزية لهذه الدراسة هي أن ارتباط Xwee1 ببروتينات 14-3-3 يعزز بشكل كبير من قدرته على فسفوريلات Cdc2. لاحظنا أن معظم ، إن لم يكن كل ، Xwee1 المؤتلف المحضر من خلايا Sf9 المصابة بفيروس baculovirus يرتبط ببروتينات الحشرات 14-3-3. التوصيفات الكيميائية الحيوية الأولية لـ Wee1 كامل الطول من أنواع مختلفة (على سبيل المثال ، خميرة الانشطار ، الإنسان ، وXenopus) باستخدام فيروس باكولوفيروس Wee1 (Featherstone and Russell، 1991 Parker وآخرون.، 1991 مكجوان وآخرون.، 1995 مولر وآخرون.، 1995a واتانابي وآخرون.، 1995). وبالتالي ، يبدو من المحتمل أن 14-3-3 بروتينات ربما تكون قد ساهمت في نشاط Wee1 الذي لوحظ في هذه التجارب. كان أول مؤشر على أن بروتينات 14-3-3 مهمة لوظيفة Wee1 هو أن متحولة S549A من Xwee1 ، والتي لا يمكنها ربط 14-3-3 بروتينات ، لديها نشاط كيناز أقل بكثير تجاه Cdc2 من النوع البري Xwee1. كطريقة أخرى لتقييم هذه المشكلة ، استخدمنا المنظفات Empigen لتجريد 14-3-3 من Xwee1 المعبر عن فيروس baculovirus. أدى هذا العلاج إلى انخفاض كبير في نشاط Xwee1 ، والذي يمكن استعادته عن طريق إضافة بروتينات المؤتلف 14-3-3. تم الحصول على نتائج مماثلة مع Xwee1 الذي تم تحصينه من Xenopusمستخلصات البيض. مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن فسفرة Ser-549 بواسطة Xchk1 ليست كافية في حد ذاتها لزيادة نشاط Xwee1. بدلاً من ذلك ، تسمح هذه الفسفرة بربط 14-3-3 ، مما يؤدي بدوره إلى تحفيز نشاط كيناز. قد تفسر هذه النتائج سبب قيام O'Connell وآخرون. (1997) لم يلاحظ تنشيط الخميرة الانشطارية المعبر عنها بفيروس baculovirus Wee1 بواسطة Chk1. على الرغم من أنه يمكن فسفرة Wee1 بواسطة Chk1 في المختبر في هذه الدراسة ، فمن المحتمل أن جزءًا كبيرًا من Wee1 كان مرتبطًا بالفعل بـ 14-3-3. علاوة على ذلك ، أوكونيلوآخرون. (1997) لم يضيف المؤتلف 14-3-3 إلى Wee1 بعد العلاج بـ Chk1.

لقد لاحظنا أيضًا أن ارتباط 14-3-3 بروتينات يؤثر على توطين Xwee1. يتضح من العديد من الدراسات التي أجريت على خلايا الخميرة والفقاريات أن بروتينات 14-3-3 لها تأثير كبير على توطين المحفز الانقسامي Cdc25 عن طريق حصره في السيتوبلازم (Dalal). وآخرون.1999 كوماغاي ودنفي 1999 لوبيز جيرونا وآخرون.، 1999 يانغ وآخرون.، 1999 Zeng and Piwnica-Worms، 1999). وبالمثل ، 14-3-3ς ، وهو بروتين يحفز p53 ، يساهم في توطين السيتوبلازم لـ Cdc2-cyclin B في الخلايا البشرية (Chan وآخرون.، 1999). في هاتين الحالتين ، يتم استخدام الغشاء النووي كحدود للتجزئة. نظرًا لأن Wee1 هو بروتين نووي في أنواع مختلفة ، فإن هذا النوع من التنظيم لم يكن متوقعًا (McGowan and Russell ، 1995 Aligue وآخرون.، 1997 موراكامي وفاندي وود ، 1998). في الواقع ، لاحظنا أن GFP-Xwee1 من النوع البري المعبر عنه في خلايا XTC مترجمة بالتساوي في جميع أنحاء النواة ، بشرط أن يتوفر إمداد كافٍ من بروتينات 14-3-3. في المقابل ، تفقد Xwee1 المتحولة S549A هذا التوزيع المنتظم وترتبط بهياكل مثقوبة في النواة. لا يزال يتعين تحديد هوية هذه الهياكل ودورها في تنظيم Xwee1 ، ولكن الارتباط مع هذه الهياكل قد يحد من إمكانية وصول Xwee1 إلى مجمعات Cdc2-cyclin في النواة. على الرغم من أن انخفاض نشاط كيناز وحده يمكن أن يفسر النشاط البيولوجي المنخفض للطفرة S549A التي لاحظناها في مستخلصات البيض ، إلا أن التوطين الشاذ قد يكون أيضًا عاملاً مساهماً.

على الرغم من أن بياناتنا تدعم العلاقة بين بروتينات Xwee1 و Xchk1 و 14-3-3 في Xenopus مقتطفات البيض ، يبقى عدد من الأسئلة. لا يؤدي الاستنفاد المناعي لـ Xchk1 من مستخلصات البيض إلى إلغاء ارتباط 14-3-3 بروتينات بـ Xwee1 ، مما يشير إلى وجود كيناز واحد على الأقل يقوم بفوسفوريلات Ser-549 من Xwee1 (نتائجنا غير المنشورة). يوجد وضع مماثل في حالة Xenopus Cdc25 ، والذي يمكن فسفرته بواسطة Xchk1 و Xcds1 و kinase واحد على الأقل (Kumagai وآخرون.، 1998aGuo and Dunphy، 2000). حتى الآن ، لم نتمكن من اكتشاف زيادة في نشاط كيناز أو ارتباط 14-3-3 بروتينات في حالة Xwee1 التي تم ترسيب مناعيها من المستخلصات المعالجة بالأفيديكولين ، وهو ما يتوافق مع النتائج المنشورة سابقًا (Kumagai و Dunphy ، 1995 مولر وآخرون.، 1995 أ). ومع ذلك ، يرتبط جزء صغير فقط من Xwee1 (∼5٪) ببروتينات 14-3-3 في مستخلصات البيض ، وفقًا لدراسات الترسيب المناعي لدينا ، مما يشير إلى أن مجموعة سكانية فرعية من Xwee1 قد تكون متورطة في هذا التفاعل. يتم دمج ما يقرب من 10 ٪ أو أقل من Xwee1 في النوى في مستخلصات بيض الدراجات ، اعتمادًا على الظروف التجريبية. من المفترض أن يكون هذا الجزء من Xwee1 هو الأكثر وصولاً لمنظمي نقاط التفتيش. علاوة على ذلك ، كما هو موضح هنا ، يتم تحديد موقع Xwee1 تفاضليًا داخل النواة اعتمادًا على ما إذا كان مرتبطًا بـ 14-3-3. تشير هذه الاعتبارات إلى أنه قد تكون هناك قيود تقنية في كيفية اختبار Xwee1 في المقتطفات التي يتم تنشيطها عبر نقاط التفتيش.

حاليًا ، تشير العديد من الدراسات إلى دور Xwee1 و / أو أقاربه في الحمض النووي غير المكرر ونقاط فحص الحمض النووي التالفة في الكائنات الحية المختلفة. في الخميرة الانشطارية ، أشارت العديد من الملاحظات إلى Wee1 و / أو Mik1 في نقاط التفتيش التي ينظمها الحمض النووي (O'Connell وآخرون.، 1997 بودي وآخرون.، 1998 بابر فورناري وآخرون.، 2000 كريستنسن وآخرون.، 2000 رالي وأوكونيل ، 2000). أفضل استجابة جزيئية مميزة في هذه الدراسات هي تثبيت Mik1 أثناء اعتقال نقطة تفتيش (Baber-Furnari وآخرون.، 2000 كريستنسنوآخرون.، 2000). وبالمثل ، تم الإبلاغ عن أن Xwee1 أكثر استقرارًا في المعالجة بالأفيديكولين Xenopus مستخلصات البيض (مايكل ونيوبورت ، 1998). ال ذبابة الفاكهة متماثل Wee1 (Dwee1) كان ضروريًا للانقسام النووي أثناء التطور الجنيني المبكر (Price وآخرون.، 2000). ومن المثير للاهتمام أن النمط الظاهري لـ Dwee1 الأجنة الطافرة تشبه إلى حد بعيد الأنماط الظاهرية للأجنة ذات الطفرات فيمي 41 أو نقاط التقييم الإجمالية الجينات ، التي تشفر متجانسات الخميرة الانشطارية Rad3 و Chk1 ، على التوالي. في الخميرة الناشئة ، لا يكون Swe1 مطلوبًا لتوقف دورة الخلية استجابةً للحمض النووي غير المكرر أو التالف ، ولكن تثبيت هذا الكيناز أمر بالغ الأهمية لنقطة فحص تشكل المغزل (Lew ، 2000). كما هو موضح هنا ، تساهم 14-3-3 بروتينات في التنظيم الإيجابي لـ Xwee1. لم نتمكن من ملاحظة أي اختلاف في ثبات النوع البري و S549A متحولة Xwee1 في مستخلصات البيض. ومع ذلك ، فمن الممكن أن يعمل استقرار Xwee1 على تعزيز نشاط كيناز المتزايد لـ Xwee1 الذي يحدث بعد ارتباط بروتينات 14-3-3.

في الختام ، تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن التنظيم الإيجابي لبروتينات Xwee1 بنسبة 14-3-3 هو آلية إضافية ، ولم يتم تقديرها سابقًا ، للتحكم في دورة الخلية. بشكل جماعي ، تلعب بروتينات 14-3-3 أدوارًا متعددة في تثبيط الدخول الانقسامي عن طريق الحفاظ على Cdc25 غير النشط في السيتوبلازم وتفعيل Wee1 في النواة. نظرًا لأن Chk1 يعمل على كل من Cdc25 و Wee1 لتجنيد 14-3-3 بروتينات ، فإن هذا الكيناز سيكون قادرًا على تقليل تنظيم Cdc25 وتنظيم Wee1 بطريقة منسقة.


النسخ

سيراجع محررونا ما قدمته ويحددون ما إذا كان ينبغي مراجعة المقالة أم لا.

النسخ، تخليق الحمض النووي الريبي من الحمض النووي. تتدفق المعلومات الجينية من الحمض النووي إلى البروتين ، المادة التي تعطي الكائن الحي شكله. يحدث تدفق المعلومات هذا من خلال عمليات النسخ المتسلسلة (DNA to RNA) والترجمة (RNA إلى بروتين). يحدث النسخ عندما تكون هناك حاجة لمنتج جيني معين في وقت محدد أو في نسيج معين.

أثناء النسخ ، عادةً ما يتم نسخ خيط واحد فقط من الحمض النووي. وهذا ما يسمى بضفيرة القالب ، وجزيئات الحمض النووي الريبي المنتجة عبارة عن رنا رسول أحادي الجديلة (mRNAs). يُطلق على خيط الحمض النووي الذي يتوافق مع الرنا المرسال اسم الترميز أو خيط الإحساس. في حقيقيات النوى (الكائنات الحية التي تمتلك نواة) يُطلق على المنتج الأولي للنسخ اسم pre-mRNA. يتم تحرير Pre-mRNA على نطاق واسع من خلال التضفير قبل إنتاج mRNA الناضج وجاهزًا للترجمة بواسطة الريبوسوم ، العضية الخلوية التي تعمل كموقع لتخليق البروتين. يحدث نسخ أي جين واحد في الموقع الكروموسومي لذلك الجين ، وهو جزء قصير نسبيًا من الكروموسوم. يعتمد النسخ النشط للجين على الحاجة إلى نشاط هذا الجين المعين في خلية أو نسيج معين أو في وقت معين.

يتم نسخ أجزاء صغيرة من الحمض النووي إلى RNA بواسطة إنزيم RNA polymerase ، والذي يحقق هذا النسخ في عملية محكومة بدقة. تتمثل الخطوة الأولى في التعرف على تسلسل محدد على الحمض النووي يسمى المحفز الذي يشير إلى بداية الجين. ينفصل شريطا الحمض النووي عند هذه النقطة ، ويبدأ بوليميريز الحمض النووي الريبي في النسخ من نقطة معينة على خيط واحد من الحمض النووي باستخدام نوع خاص من النوكليوزيد المحتوي على السكر يسمى ريبونوكليوسيد 5-ثلاثي الفوسفات لبدء سلسلة النمو. يتم استخدام ثلاثي فوسفات الريبونوكليوسيد الإضافي كركيزة ، ومن خلال انقسام رابطة الفوسفات عالية الطاقة ، يتم دمج أحادي الفوسفات الريبونوكليوزيد في سلسلة الحمض النووي الريبي المتنامية. يتم توجيه كل ريبونوكليوتيد متتالي من خلال قواعد الاقتران الأساسية التكميلية للحمض النووي. على سبيل المثال ، فإن C (السيتوزين) في الحمض النووي يوجه دمج G (الجوانين) في الحمض النووي الريبي. وبالمثل ، يتم نسخ G في DNA إلى C في RNA ، و T (ثايمين) إلى A (أدينين) ، و A إلى U (يحتوي uracil RNA على U بدلاً من T من DNA). يستمر التوليف حتى يتم الوصول إلى إشارة إنهاء ، وعند هذه النقطة يسقط بوليميريز الحمض النووي الريبي من الحمض النووي ، ويتم إطلاق جزيء الحمض النووي الريبي.

قبل العديد من الجينات في بدائيات النوى (الكائنات الحية التي تفتقر إلى النواة) ، هناك إشارات تسمى "المشغلين" (ارى operons) حيث ترتبط بروتينات متخصصة تسمى المكثفات بالحمض النووي فقط في بداية نقطة بداية النسخ وتمنع الوصول إلى الحمض النووي بواسطة بوليميراز RNA. وبالتالي تمنع بروتينات المثبط هذه نسخ الجين عن طريق منع عمل بوليميراز الحمض النووي الريبي فعليًا. بشكل نموذجي ، يتم إطلاق المكثفات من فعل الحجب عندما تتلقى إشارات من جزيئات أخرى في الخلية تشير إلى أن الجين يحتاج إلى التعبير. قبل ظهور بعض الجينات بدائية النواة ، توجد إشارات ترتبط بها بروتينات المنشط لتحفيز النسخ.

النسخ في حقيقيات النوى أكثر تعقيدًا منه في بدائيات النوى. أولاً ، إن إنزيم RNA polymerase للكائنات الأعلى هو إنزيم أكثر تعقيدًا من إنزيم بسيط نسبيًا مكون من خمس وحدات فرعية من بدائيات النوى. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من العوامل الإضافية التي تساعد على التحكم في كفاءة المروجين الفرديين. تسمى هذه البروتينات الملحقة بعوامل النسخ وتستجيب عادةً للإشارات من داخل الخلية التي تشير إلى ما إذا كان النسخ مطلوبًا أم لا. في العديد من الجينات البشرية ، قد تكون هناك حاجة إلى العديد من عوامل النسخ قبل أن تتم عملية النسخ بكفاءة. يمكن أن يتسبب عامل النسخ في قمع أو تنشيط التعبير الجيني في حقيقيات النوى.

محررو Encyclopaedia Britannica تمت مراجعة هذه المقالة وتحديثها مؤخرًا بواسطة كارا روجرز ، كبيرة المحررين.


كينازات الطور البيني

كينازات الميتوجين والمنشطة بالإجهاد 1 و 2 (MSK1 / 2)

يتم ترسيب علامة الطور البيني phospho-H3S10 على الجينات المنسوخة بنشاط بواسطة كينازات متعددة (الجدول 1) ، يتم تنشيطها استجابةً لمحفزات مختلفة خارج الخلية. وبالتالي ، فإن علامة H3S10 عبارة عن تعديل ديناميكي يقترن الإشارات خارج الخلية بالاستجابات النسخية والتغيرات المحددة في فسيولوجيا الخلية. تتضمن الآلية المتعارف عليها لترسب H3S10 المحرض مسار بروتين كيناز (MAPK) ينشط بالميتوجين ، يتم تنشيطه بواسطة عوامل النمو ، والميتوجينات ، واستجابة المصل ، والسيتوكينات ، والضغوط الخلوية. التشغيل المصب لـ ERK1 / 2 و p38 MAPKs و MSK1 و 2 ، أخصائي تقويم العظام من Drosophila Jil-1 kinase ، كيناز H3S10 الكنسي في ذبابة الفاكهة ، يحفز الفسفرة H3S10 السريع في مناطق المروج والمعزز للجينات المبكرة الفورية (IEGs) [ 7 ، 12]. يتم تحديد IEGs من خلال الحث النسخي السريع والعابر ، الذي لا يتطلب تخليق بروتين جديد. تقوم العديد من IEGs بترميز عوامل النسخ ، مثل c-MYC و c-FOS و c-JUN و FOS1L و EGR1، المسؤولة عن إعادة البرمجة النصية للخلايا المعرضة للمنبهات البيئية المسببة للإجهاد. نظرًا لأن العديد من IEGs عبارة عن جينات مسرطنة ، ويتم تشغيل الفسفرة H3S10 عادةً بواسطة عوامل يُعرف أنها مسببة للسرطان ، مثل التعرض لـ 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) [64 ، 97] ، الفورمالديهايد [98] ، السجائر دخان [99] ، إشعاع مؤين [53] ، قد يمثل H3S10ph رابطًا ميكانيكيًا بين المواد المسرطنة والتحول الخلوي. يتم دعم هذه الفرضية من خلال الدراسات التي تشير إلى أن نشاط MSK1 الناجم عن TPA أو عامل نمو البشرة (EGF) و H3S10ph مطلوب لتحويل خلايا بشرة الفأر [16 ، 100]. تمشيا مع هذه الملاحظات ، فإن الفئران التي تم علاجها بالضربة القاضية MSK1 / 2 بالمادة المسرطنة 7،12-dimethylbenz [أ] أنثراسين تصاب بأورام جلدية أقل بكثير من زملائها من النوع البري [101]. لوحظ أيضًا زيادة في نشاط MSK1 ومستويات الحالة المستقرة لـ H3S10 الفسفوري في الخلايا الليفية للفأر المحولة h-Ras ، Ciras-3. أظهرت هذه الخلايا المحولة Ras زيادة مستويات الحالة المستقرة لمنتجات IEG c-JUN و c-FOS و COX-2. علاوة على ذلك ، فإن ضربة قاضية MSK1 في خلايا Ciras-3 تحد من النمو المستقل عن الإرساء ، وهي السمة المميزة للتحول الخلوي [102]. تزداد مستويات H3S10ph أيضًا في خلايا سرطان الثدي ، وعلى غرار السرطانات الظهارية الأخرى ، تزداد بعد علاج TPA عبر نشاط مسار RAS / MAPK. المنطقة المروجة لجين علامة سرطان الثدي والعامل النذير السفلي ، عامل التريفويل 1 (TFF1) مشغول بواسطة MSK1 ومزخرف بـ H3S10ph [103]. تؤدي عملية فسفرة H3S10 بوساطة MSK إلى توظيف مهايئ 14-3-3 و BRG1 لمناطق المحسن والمعزز الأولي لـ TFF1 [104]. بعد ذلك ، تؤدي إعادة تشكيل الكروماتين في العناصر التنظيمية لـ TFF1 إلى فسفرة RNA polymerase II CTD ، مما يؤدي إلى تعبير TFF1. مجتمعة ، فإن MSK1 مطلوب لتحول الخلايا الناجم عن المواد المسرطنة / الورم من خلال فسفرة هيستون H3 في Ser10 وتفعيل النسخ من الجينات المسرطنة [16 ، 99 ، 100].

ريبوسومال S6 كيناز 2 (RSK2)

يلعب RSK2 ، وهو كيناز آخر منظم لمسار MAPK في اتجاه مجرى ERK1 / 2 ، وظيفة مماثلة لـ MSKs لأنه قادر على فسفوريلات H3S10 ، وإن كان ذلك مع نشاط أقل بأربعة أضعاف لهذه الركيزة [105]. تحفيز خلايا ساركوما الفأر C3H10T1 / 2 مع EGF الذي يسبب تعبير IEG وترسيب تنشيط H3S10ph و H3K14ac هيستون يرتبط بتنشيط RSK2 [7]. أيضًا في خط خلايا البشرة الجلدية للفأر JB6 Cl41 ، تمت زيادة فسفرة RSK2 في غضون 5 دقائق بعد تحفيز TPA أو EGF [106]. تم تحسين تكاثر الخلايا وتكوين المستعمرة بشكل كبير في الخلايا ذات التعبير RSK2 المستقر مقارنةً بالأرومات الليفية الجنينية RSK2 الماوس. تظهر هذه النتائج أن RSK2 يلعب دورًا مهمًا في التحول الخلوي الناجم عن محفزات الورم مثل EGF و TPA [106]. الأهم من ذلك ، تم تأكيد فسفرة هيستون H3 سيرين 10 بوساطة RSK2 باستخدام خلايا مرضى متلازمة Coffin-Lowry (CLS) التي تعاني من نقص RSK2. أخفقت الخلايا الليفية المشتقة من مريض CLS الذي يمتلك طفرة RSK2 في إظهار الفسفرة المحفزة بـ EGF لـ H3 ، على الرغم من أن H3 تمت فسفرته أثناء الانقسام الفتيلي. إعادة إدخال النوع البري RSK2 إلى خلايا المريض CLS الناقص RSK2 يعيد فسفرة هيستون H3 التي يسببها EGF في سيرين 10 [107]. ومن المثير للاهتمام ، أن فسفرة p53 بوساطة RSK2 في السيتوبلازم يحفز تراكم p53 النووي ويزيد من التفاعل بين RSK2 والهيستون H3 ، مما يعزز فسفرة S10 استجابةً للأشعة فوق البنفسجية أو علاج EGF ، بينما يقلل نقص p53 من H3S10ph بوساطة RSK2 [108]. بالإضافة إلى ذلك ، تبين أن كيناز MAP آخر ، c-Jun NH (2) كيناز نهائي (JNK) متورط في فسفرة H3S10 [109]. لوحظ وجود فسفرة H3S10 بوساطة JNK بعد التحفيز بمواد مسرطنة مثل دخان السجائر [99] والفورمالديهايد [98] والزرنيخ [110].

كيناز 8 المعتمد على Cyclin (CDK8)

يبدو أن IEGs تعتمد بشكل خاص على تنظيم H3S10 ، مثل H3S10 كيناز آخر ، تم تحديد CDK8 أيضًا كمنظم إيجابي لـ IEGs. CDK8 هو جزء من مجمع الوسيط مع دور في تنظيم النسخ الخاص بالجينات ، وبالتالي يعمل كجسر بين آلية النسخ القاعدية وعوامل النسخ التي تستهدف جينات معينة. أثناء تحفيز المصل ، يلزم وجود CDK8 من أجل النسخ المناسب لـ IEGs ، بما في ذلك عوامل النسخ الورمية [111]. تحفز الفسفرة H3S10 المعتمدة على CDK8 أستلة H3K14 بواسطة GCN5L acetyltransferase ، مع الارتباط بمجمع الوسيط / مجمع CDK8 الفرعي. يعزز H3 Phosphoacetylated التنشيط النسخي للعديد من الجينات ، بما في ذلك IEG ، EGR1. يؤدي CDK8 إلى انخفاض المستويات العالمية من H3 phosphoacetylated [112]. إلى جانب دوره في تنشيط النسخ ، يؤثر CDK8 على استطالة نسخ IEGs. يؤدي استنفاد CDK8 إلى تقليل الفسفرة في Ser2 و Ser5 من RNA pol II CTD مما يؤدي إلى تقليل سرعة استطالة النسخ في هذه المواقع. علاوة على ذلك ، يؤثر استنفاد CDK8 على تكوين مركب استطالة وظيفي (مركب الاستطالة الفائق ، SEC) المتكون من CDK7 و CDK9 و P-TEFb و BRD4 [111].

يتم تنظيم نشاط كيناز لـ CDK8 تجاه H3S10 بواسطة فئة معينة من lncRNAs ، تسمى تنشيط ncRNA (ncRNAa). طويلة ncRNAas تعمل في رابطة الدول المستقلة bringing enhancer and promoter region via Mediator complex to promote assembly of transcription factors and RNA pol II on the target mRNA promoter sites. Mediator with CDK8 phosphorylates H3S10 to activate transcription. Knocking down a given ncRNAa resulted in a specific decrease in H3S10 phosphorylation at its target gene [113]. This long-distance enhancer-promoter loops mediated by CDK8 might also contribute to transcriptional memory, where stimuli-induced genes show rapid transcriptional responses upon re-introduction of the stimulus. In consistence with that, CDK8 preferentially associated with the promoters of genes that show transcriptional memory after interferon-γ treatment [114]. Similar long-distance promoter-enhancer interactions exist also in super-enhancers (SEs), thus it is not surprising that CDK8 has a role in the regulation of SE-dependent genes. SEs are large clusters of enhancers loaded with particularly high levels of Mediator complex and transcription factors, regulating expression of genes crucial for cell identity and disease, including multiple oncogenes [115,116,117]. Best studied example for CDK8-SE connection was described in acute myeloid leukemia. Surprisingly, in those cells CDK8 restrains activation of SE-genes needed for normal hematopoiesis and cell differentiation, and inhibition of Mediator kinases CDK8 and 19 by cortistatin A (CA) has a therapeutic effect [118]. These results put an emphasis on the context-dependent action of CDK8, that can act both as an activator and repressor of gene expression.

Modulation of histone marks/chromatin is not the only mechanism by which CDK8 can regulate transcription. It can do so directly via phosphorylation of many transcription factors, including, among others, E2F1, NOTCH, p53, SMADs and STATs. In addition, CDK8 can modulate transcription in a very precise, signal-specific fashion. For example, after strong p21 activation, CDK8-mediator complex is selectively recruited to p53-target genes, augmenting p53 transcriptional program [111]. Similarly, in colon cancer cells, CDK8 protects β-catenin/T-cell factor (TCF)-dependent transcription from inhibition by E2F1 [119,120,121]. In addition, CDK8 is also involved in the transcriptional regulation of hypoxia-inducible genes. Hypoxia-inducible genes are pre-prepared for rapid transcription, carrying active, but paused, RNA pol II. With reduced oxygen level, hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF1A) recruits CDK8-bearing Mediator complex and SEC, what leads to increased phosphorylation of RNA pol II CTD and transcriptional elongation. Although HIF1A alone is able to bind to chromatin and induce histone acetylation, CDK8 is indispensable for the recruitment of transcriptional machinery and elongation progression [122]. Likewise, CDK8 enables transcriptional elongation by phosphorylation of RNA pol II at Ser2 in response to estrogen stimulation in breast cancer cells [123].

Pim-1 proto-oncogene, serine/threonine kinase (PIM1)

PIM1 is another interphase H3S10 kinase with a documented role in cancer initiation and progression. Interestingly, PIM1 overexpression alone is not sufficient to induce tumorigenesis with high penetrance. In marked contrast, simultaneous overexpression of PIM1 and MYC dramatically accelerates MYC-induced lymphomagenesis, leading to formation of aggressive lymphomas in utero or around birth [124,125,126,127,128]. After stimulation with growth factor, PIM1 forms a complex with the dimer of MYC with its interacting protein MAX (MYC-associated factor X). The entire complex is recruited to the genomic locus of MYC targets, including IEGs: FOSL1 and ID2. There, PIM1 catalyzes phosphorylation of H3S10 in the nucleosomes at MYC-binding site what enables transcriptional activation of those genes. MYC and PIM1 colocalize at the sites of active transcription, and together regulate 20% of the MYC-target genes. Consistent with this, PIM1 inhibition reduced cellular transformation potential of MYC [63].

IκB kinase α (IKKα, CHUK) and inflammatory pathway-induced kinases

In addition to the role in IEGs expression, H3S10 phosphorylation is required for the proper transcriptional response to proinflammatory signals activating NFκB, such as lipopolysaccharides (LPS), CD40 and tumor necrosis factor (TNF) [129,130,131]. Although these stimuli operate through distinct receptors (toll-like receptors—TLRs, TNF-family receptors, e.g., TNFR) and utilize different signaling intermediates upstream of NFκB, they elicit rapid H3S10 phosphorylation of at least a subset of promoters of genes regulated by these signals. IKKα, activated downstream of TNFR, functions in the nucleus and interacts with CREBBP acetyltransferase [129, 131]. The IKKα-CREBBP complex is recruited to NFκB- responsive promoters by RelA and mediates H3S10 phosphorylation and subsequent H3K14 acetylation. Other stimuli, such as LPS and TLR4, trigger p38 activation, what subsequently leads to similar chromatin modifications [130]. Inhibition of p38 decreases H3S10 abundance at promoters of certain LPS-inducible promoters and dramatically attenuates transcriptional responses to this pro-inflammatory signal, indicating that H3S10ph is required for full transcriptional activation of these genes. However, as histone’s H3 serine 10 is not followed by a proline, it cannot be directly phosphorylated by MAPKs [105, 107, 130]. Consistent with this, p38 has not been shown to directly associate with chromatin and phosphorylate H3S10, indicating that a p38-regulated kinase must be responsible for these epigenetic modifications. In fact, other studies indicate that LPS-induced cytokine production requires p38-regulated MSK1 or RSK2—well-established H3S10 kinases [132]. Interestingly, MSK1/2 knockout mice do not present an overt phenotype when unchallenged [13, 133], but are sensitized to LPS-induced endotoxic shock, indicating that MSKs exhibit anti-inflammatory functions [134]. Indeed, after LPS stimulation MSK1/2 knockout resulted in elevated levels of TNF, IL-6, and IL-12 production, but decreased production of the anti-inflammatory cytokine IL-10 [134, 135]. These data indicate that in vivo, MSK1 activity (and, possibly H3S10) downstream of TLR4, is a sort of a “safety fuse”, limiting LPS-induced inflammation. Similar mechanism of IL-10 secretion upon TLR4 activation has been shown for macrophages and B-cells, albeit different kinases are mediating these anti-inflammatory responses: macrophages utilize MSK1, whereas B-cells depend on RSK2 [136].

Given the importance of H3S10ph in mediating/maintaining tumor cell phenotype, oncogene transcription, inflammatory signaling pathways, cancer-related inflammation and immune escape, modulation of the deposition of this mark has a broad therapeutic potential. In addition, since kinases capable of H3S10 phosphorylation are able to regulate a wide range of substrates beyond H3S10, their inhibition has broad, pleiotropic effects. This pleiotropy makes them very attractive therapeutic targets, promising multidirectional and multi-layer activity. In fact, many of the enzymes catalyzing phosphorylation of H3S10 have long been considered targets for cancer therapy [88, 137,138,139,140,141]. However, the pleiotropy can also become a double edge sword, where inactivation of these multifunctional kinases results in unacceptable toxicities and, perhaps, heritable changes in chromatin architecture. In particular, the complex interplay of H3S10 phosphorylation with more stable modifications can actually have negative, long-lasting effects, and may thus present a danger in the clinical setting. Protein kinase inhibitors with proven effect on H3S10ph mark deposition and its cellular abundance, approved by FDA for clinical trials are listed in Table 2.


الاستنتاجات

Cells within a tissue exist in a complex environment that is constantly changing. Cells need to be able to sense and respond accordingly to the multitude of signals they encounter, which includes mechanical cues such as pushing, pulling and shear stress. Regulation of gene transcription by actin dynamics is absolutely crucial to coordinate complex processes such as migration, mitosis, and intracellular trafficking. Transcription factors that form complexes with actin binding proteins, or bind directly to actin itself are going to be particularly responsive to actin dynamics. The MRTFs and Hippo pathway effectors YAP and TAZ are well-characterised examples of mechano-responsive transcription factors. As we learn more about the players and processes of actin dynamics we anticipate that new mechanotransducers will be identified. These discoveries will have important implications for understanding development and disease, and how these factors might be targeted therapeutically.


14.3: Details of Transcription - Biology

C2006/F2402 '04 OUTLINE OF LECTURE #9

(c) 2004 Dr. Deborah Mowshowitz, Columbia University, New York, NY . Last update 02/16/2004 06:10 PM

Handouts (not on web): 8A & 8B from last time (nucleosome structure) & 9 (Regulatory Elements & Picture of a typical Eukaryotic Gene)

I. Histones & Details of Chromatin Structure

A. Structure of Chromatin -- how are proteins and DNA arranged? The evidence.

1. Appearance in EM -- low salt ("beads on a string" appearance) vs physiological salt (30 nm fiber). انظر بيكر الشكل. 16-17 or Purves fig. 9.7 (9.8).

2. Results of treatment with DNase (microccocal nuclease cuts exposed DNA at random does not cut at specific base sequences.)

أ. Treat chromatin with a little mic. nuclease then remove protein and isolate the DNA, then run DNA on a gel. Get 200 Base Pair (BP) "ladder" = sequences of multiples of 200 BP on gel. Implies repeating structure ("bead") with about 200 BP per repeat DNA exposed (so easily cut) about once per 200 BP. (See Becker fig. 16-18 & 16-19.)

ب. More treatment with nuclease --> resistant core of 140-145 BP. Implies part of 200 BP repeat is relatively protected in/on core of "bead" rest goes between beads and is more exposed.

أ. 5 types: H2A, H2B (slightly lys rich), H3, H4 (arg rich) & H1 (lys rich). All relatively small, basic proteins.

ب. All histones are highly conserved evolutionarily (this implies histones carry out a critical function that depends on a particular structure -- can't change structure much without ruining function).

ب. How much per 200 BP of DNA? 2 molecules each of H2A, H2B, H3, H4 plus one molecule of H1.

ج. Low salt removes H1.

B. Model for Chromatin (Beads on string level) -- nucleosomes (See small picture in '91 article (8A) and Becker fig. 16-20 or Purves fig. 9.7). Where is the protein relative to the DNA?

1. Octamer of 2 each of H2A, H2B, H3, H4 (+ some DNA) = one bead.

2. DNA wound 2X around (on outside of) each octamer -- protects core.

3. Linker DNA between cores = 50-60 BP most exposed & most sensitive to nuclease used above.

4. H1 is on outside of DNA/octamer

5. Nucleosome = repeating unit = 200 BP DNA + octamer (H1 optional).

C. Nucleosomes & Higher Levels of Structure (requires H1) -- how does chromatin fold up?. See big picture in '97 article (8B) -- and books for detailed pictures. (Becker fig. 16-21 or Purves fig. 9.7 (9.8 or 14.3)) Stages of folding are as follows (details in table):

1. Nucleosomes . DNA + histones --> Chain of nucleosomes about 1/7 original length of DNA (see table below).

2. 30 nm fiber . Chain of nucleosomes folds back on itself (supercoils) --> 30 nm fiber (sometimes called solenoid). Exact structure unclear. Fiber is about 3 beads across 6 beads/turn = 1/42 length of DNA. Need tails (of histones) and H1 to form 30nm fiber. (See 97 article.)

3. Loops . 30 nm fiber --> loops about 300nm in diameter (1/750 orig. length). Different sections may be tighter or looser. Individual loops are stretched out (probably to beads-on-a-string stage) when actually transcribed.

4. Higher Orders of Folding . Looped structure folds further --> --> heterochromatin (not transcribable)

أ. Form structures/fibers about 700 nm across (per chromatid)

ب. At metaphase = tightest = 1/15,000-1/20,000 orig. length (Chromosome is 4-5 microns long but contains 75 mm of double helical DNA)

D. Summary of States of Folding -- compare to handout 8B.

* Packing ratio = length of DNA or DNA/protein complex relative to original length of DNA.

E. Modifications of histones -- helps tighten up or loosen chromatin

1. Phosphorylation of H1 occurs in M changes in kinase and phosphatase activity affect state of histones and folding of chromatin in parallel with changes in lamins.

2. Acetylation of lys side chains of histones may serve regulatory purpose. Acetylation of histones --> more active, looser chromatin (see '91 article). Acetylation of H3 & H4 is higher in active chromatin.

3. Other modifications , such as methylation, occur and may serve regulatory purposes as well. (Both DNA and histones can be methylated.)

To review nucleosome structure, try problems 4-1, 4-3 A, 4-4 A & 4-8 A.

II. Does Genetic Activity Correlates with States of Chromatin? How to test?

A. Polytene chromosomes (See Becker Ch. 21 esp. fig. 21-15 & 21-16) Special Interesting Case. Not covered in lecture is here FYI.

1. Advantages:

أ. Special case where many chromatids -- about 1000 -- are lined up together with genes and loops of chromatin aligned therefore can see differences in state of folding in light microscope.

ب. Can compare changes in folding of chromatin and level of transcription (by incorporation of labeled U) in a single tissue as it responds to hormones that alter gene expression.

2. Disadvantage : Can't compare regions of active/inactive chromatin from many dif. مناديل.

3. Results: Active (transcribed) regions are clearly looser -- individual loops stretched out more. (See Becker )

B. Results of treatment with DNase I (of ordinary chromosomes/chromatin)

1. The problem -- Not all euchromatin is transcribed in any one cell -- is it all folded to the same degree or not?

أ. All (eu)chromatin looks about the same in the light microscope. Therefore indirect methods (such as DNase treatment) are necessary to test state of folding.

ب. Use of DNases. States of folding of (eu)chromatin are often distinguished by effects of treatment with various types of DNase. State of (eu)chromatin will determine relative sensitivity of DNA (while still in chromatin) to degradation by various DNases. DNA that is in tighter areas of chromatin will be more protected from degradation. (Some examples of this will be discussed below and are in problem sets.)

2 . طريقة -- see Becker fig. 21-17. Look at chromatin region containing a particular gene, say globin genes, from dif. مناديل. (Note: this region is euchromatic in interphase in all these tissues, even though it is not expressed in all of them. No gross difference is visible that's why indirect methods are necessary.)

أ. Overall idea: can't isolate areas of chromatin that are more or less active and then test for which DNA (which genes) are present. Have to do it in reverse. So treat chromatin with DNase, first, then fish out known genes and see if they were degraded or not.

ب. Details of DNase treatment: يعامل الكروماتينية with DNase I (different enzyme from one used previously to get a "ladder"). ثم isolate DNA and see what state it's in. (See c.)

(1). Can vary conditions -- amount of enzyme, time, etc. to distinguish various degrees of sensitivity to the enzyme.

(2). Can test chromatin from many different tissues, say erythrocytes (in chickens -- still have nuclei) vs. brain

(3). Can test state of many different genesusing diff. probes (in step c below).

(4). DNase I cuts the DNA differently than micrococcal nuclease. DNA that is simply wound around nucleosomes is not totally protected from DNase I -- further folding up is required. So resistance to DNase I is a measure of how tightly the nucleosomes are folded in on themselves. DNase I does not cut preferentially at any particular sequence or at any particular place relative to the position of the nucleosome. Does not give "ladder."

ج. Expected result: If chromatin is relatively loose, DNA will be unprotected and readily degraded by DNase I. If chromatin is relatively tight, DNA in that region will NOT be easily degraded.

د. How to measure state of DNA (after treatment of chromatin):

(1). Prepare DNA. Extract DNA (remove histones) treat naked DNA with restriction enzyme (to give pieces of reasonable size IF DNA was protected from DNase I). If DNA was in loose region of chromatin, it will already have been degraded by DNase I.

(2). Find regions corresponding to known genes. Run restriction fragments on gel do blot, identify regions of interest (say, globin genes) with probe. Only regions from areas with relatively tight chromatin will give clear, undegraded bands on the gel.

3. Results of treatment of euchromatin with DNase I and other nucleases.

أ. Almost all eukaryotic DNA is in nucleosomes. (See (c) for exceptions.) How do we know?

(1). Almost all DNA is much more resistant to digestion by DNase I than naked DNA

(2). Almost all DNA forms ladder when treated with micrococcal DNase.

ب. Actually transcribed (coding) DNA is more sensitive to DNase I than ordinary euchromatic DNA. لكن transcribed DNA is much more resistant than naked DNA -- it is still in nucleosomes.

ج. Hypersensitive sites exist -- these are the only sections not in nucleosomes.

(1). Some hypersensitive sites found= very sensitive regions (100X more sensitive to degradation by DNase I than heterochromatin 10X more sensitive than active euchromatin.)

(2). Hypersensitive sites correspond to sites without nucleosomes

(3). DNA in hypersensitive sites is not naked -- it has other proteins, but no histones. انظر بيكر الشكل. 21-18.

(4). Hypersensitive sites correspond to regulatory, not coding, regions(in areas of active transcription).

(5). Why are hypersensitive sites so sensitive to DNase? Transcription factors (regulatory proteins) have replaced histones and the other proteins don't protect the DNA as well as histones do.

C. Possible States of Interphase Chromatin -- what is inferred from all the results, and the implications. (See table below. )

أ. Super Tight = heterochromatin = essentially not uncoiled from mitosis. Genetically inactive.

ب. Euchromatin -- 3 major states?

(1). Loose. Looser than heterochromatin, but not being transcribed (genetically inactive) at the moment. 30 nm fiber?

(2). Looser -- but still has nucleosomes. Beads-on-a-string? Stretched out loops? Example: coding region that are active -- they are actually being transcribed. (May include genes that were transcribed recently, or were next to transcribed regions, etc.)

(3). Loosest or hypersensitive region (missing some histones has regulatory proteins instead). Example: active promotor or enhancer.

ج. A caution: There are probably intermediate states, and the ones above are simply the only ones that have been clearly distinguished using the methods currently available. For example, all inactive euchromatin is probably not the same. See ** below.


شاهد الفيديو: الأحياء - الصف الثانى عشر - الدرس رقم 25 بناء البروتين - النسخ (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Macduff

    بالمناسبة ، هذه الفكرة الجيدة للغاية تحدث الآن

  2. Lindleigh

    ألست الخبير؟

  3. Adalard

    القصدير!

  4. Azikiwe

    شكرًا جزيلاً! لقد كنت أبحث عنها بنوعية جيدة لفترة طويلة.

  5. Deems

    ما هي الكلمات ... العبارة الهائلة ، رائعة



اكتب رسالة