معلومة

هل هناك حالات حيث تعمل النتائج في الجسم الحي بشكل أفضل مما تظهره النتائج في المختبر؟

هل هناك حالات حيث تعمل النتائج في الجسم الحي بشكل أفضل مما تظهره النتائج في المختبر؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في الأساس ، إذا كانت نتائج خط الخلايا المختبرية ضعيفة ولكنني قررت اختبارها في الجسم الحي في فأر على أي حال ، ما هي احتمالات الحصول على نتائج أفضل في نموذج الفأر الحي في الجسم الحي الذي لم أكن لأعرفه بخلاف ذلك من نتائج المختبر؟

هي موضع تقدير الروابط


الاختلافات بين في المختبر و في الجسم الحي النتائج (للأسف) شائعة جدًا!

بطريقة ما ، فشل كل شيء التجارب السريرية (والكثير التجارب قبل السريرية) أمثلة واسعة النطاق على التناقض بين الوعود في المختبر وفعلي في الجسم الحي النتائج - مما يسلط الضوء أيضًا على حقيقة أنه حتى من واحد في الجسم الحي النظام (مثل الفئران) للآخر (مثل البشر) ، يمكن أن تكون هناك اختلافات بيولوجية كبيرة وغير متوقعة. إنه عكس حالتك ، حيث تتوقع تحسنًا عند الانتقال إلى الحيوانات الحية ، ولكنه أيضًا أكثر شيوعًا.

من حيث الجوهر ، الخاص بك في المختبر الثقافة لن تكون قادرة على تلخيص العمليات الرئيسية مثل:

  • الإشارات التي توفرها المصفوفة الطبيعية خارج الخلية. من المحتمل أن تنمو خلاياك على البوليسترين ، لكن هذه الركيزة بعيدة كل البعد عن تعقيد الجزيئات الطبيعية التي تحيط بالخلايا في الجسم الحي: صلابة ، جزيئات إشارات ثابتة ...
  • المعلومات المقدمة من أنواع الخلايا الأخرى. تتكون الأعضاء من العديد من المجموعات السكانية الفرعية الديناميكية (الخلايا الجذعية ، والخلايا المناعية ، إلخ) ، بعضها غير معروف ، والتي تتفاعل وتتحكم في سلوك الخلية على نطاق الأنسجة.
  • تقلب المعلومات مثل الدورات والسلوكيات البيولوجية (إيقاع الساعة البيولوجية ، والنوم ، وتناول الطعام ...)
  • العديد من العمليات الأخرى مثل العمليات المناعية ، (دي) تنشيط الجزيئات الصغيرة بواسطة إنزيمات في أعضاء غير مرتبطة (الكبد) أو البلازما ...

كل هذه العوامل يمكن أن تغير نتيجتك بطرق غير متوقعة ، مما يجعلها إما أفضل أو أسوأ. لكن ، وهذا مهم ، في كثير من الأحيان ، تميل الأنظمة البيولوجية المعقدة إلى جعل الأمور أسوأنظرًا لأنها تقدم ضوضاء إضافية وتأثيرات التخزين المؤقت وما إلى ذلك في كثير من الأحيان ، فلن تكون الأشياء جيدة في حيوان حقيقي كما في طبق بتري. يمكن أن تتحسن بالتأكيد ، لكن من غير المحتمل للغاية!

هذا هو أحد الأسباب الرئيسية التي تجعل الناس يفعلون ذلك في المختبر العمل أولاً: إنه أسرع وأرخص وأكثر أخلاقية وفشل في المختبر عادة ما يكون مؤشرًا جيدًا لفشل المصب في الجسم الحي.

من فضلك ، لا تنتقي إجابة تخبرك بخلاف ذلك! من الأسهل والأكثر راحة أن تعتقد أن كل شيء سينجح إذا انتقلت إلى الحيوانات فقط ، نعم ، لكنك على الأرجح ستضيع الوقت والمال وحياة الحيوانات لتحقيق نتائج متطابقة. نصيحتي (غير المرغوب فيها) هي بناء أفضل في المختبر نموذج، سيقلل ذلك من الاختلافات المحتملة بين نتائج الخلايا والنماذج الحيوانية: هل يمكنك محاكاة بيئة ذات صلة بيولوجيًا عن طريق إضافة مصفوفة بروتين / سكر إلى خلاياك؟ هل يمكنك العثور على الخلايا الأولية التي ستعمل بشكل طبيعي أكثر من خطوط الخلايا الخالدة؟ هل يمكنك عمل مزارع خلوية مختلطة لتحسين ملاءمة نموذجك مع الواقع؟ إذا قمت بكل هذا ، فيجب أن تكون نتائجك أكثر موثوقية وستكون لديك فكرة أفضل عما يمكن توقعه في الجسم الحي.


نمذجة امتصاص PBPK: إنشاء ملف في المختبر–في فيفو رابط - منظور الصناعة

إنشاء في المختبرفي الجسم الحي يعتبر الارتباط (IVIVC) المعيار الذهبي لتأسيسه في الجسم الحي أهمية طريقة الذوبان واستخدام بيانات الذوبان في سياق أسئلة التكافؤ البيولوجي التنظيمي ، بما في ذلك تطوير مواصفات الذوبان. ومع ذلك ، فقد أشارت العديد من المنشورات الحديثة ، بما في ذلك الدراسات الاستقصائية الصناعية والاستعراضات من الوكالات التنظيمية ، إلى معدل نجاح منخفض لـ IVIVCs ، خاصة بالنسبة لتركيبات الإطلاق الفوري. في السنوات الأخيرة ، كان استخدام الحرائك الدوائية ذات الأساس الفسيولوجي (PBPK) ونمذجة الامتصاص ، كأداة لتسهيل تطوير المستحضرات ، يجتذب اهتمامًا متزايدًا. توفر هذه المخطوطة منظورًا صناعيًا للتحديات الحالية مع إنشاء IVIVCs وعرض نمذجة الامتصاص والامتصاص PBPK المحتملة لزيادة تأثيرها. تُستخدم دراسات الحالة عبر كل من تركيبات الإصدار الفوري والإصدار الممتد من خمس شركات صيدلانية لإثبات كيف يمكن أن يسهل IVIVC القائم على الفسيولوجي (PB-IVIVC) فهم منتج الدواء ولإبلاغ تقييم التكافؤ الحيوي والمواصفات ذات الصلة سريريًا. وأخيرًا ، تم اقتراح أفضل ممارسات PB-IVIVC واستراتيجية لتطوير النماذج وتطبيقها.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


تقرير بحث موجز مقال

آلان تراوتمان 1 & # x0002A ، هوغو جاسكان 2 و رؤوف غوزي 3 & # x0002A
  • 1 Universit & # x000E9 de Paris، Institut Cochin، INSERM U1016، CNRS UMR8104، Paris، France
  • 2 Institut de G & # x000E9n & # x000E9tique et D & # x000E9veloppement de Rennes (IGDR) ، رين ، فرنسا
  • 3 مركز Hospitalier de Lannemezan ، لانيميزان ، فرنسا

في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح ديسفلفرام كعلاج واعد للأشخاص الذين يعانون من الأعراض المستمرة لمرض لايم. يحتوي ديسفلفرام على عدة أهداف جزيئية متميزة. الأكثر شهرة هو نازعة الهيدروجين الكحول ، وهو إنزيم رئيسي لإزالة السموم من الكائن الحي بعد تناول الكحول. الأهداف وطرق عمل الديسفلفرام الأخرى ، التي قد تسبب آثارًا جانبية إشكالية ، هي أقل شيوعًا. ال الاتحاد الفرنسي ضد الأمراض التي تنقلها القراد (اختصار فرنسي ، FFMVT) ، الذي يربط ثلاث منظمات رئيسية لمرضى Lyme ، MDs و PhDs ، تم تنبيهه مؤخرًا إلى الأحداث السامة الشديدة والمستمرة في مريض يعاني من شكل متأخر من انتشار مرض لايم بعد تناول ديسفلفرام. استجابت FFMVT من خلال إطلاق دعوة وطنية لفحص ما إذا كان يمكن تحديد المرضى الآخرين في فرنسا بعد علاج مماثل ، وما هي الفوائد ، أو الآثار الجانبية التي يمكن الإبلاغ عنها. تم جمع بيانات 16 مريضًا يتناولون ديسفلفرام ويتم تقديمها هنا. أبلغ 13 مريضًا من أصل 16 عن أحداث سامة ، وأفاد سبعة من أصل 16 بفوائد على الأقل لجزء من أعراضهم. بناءً على الملاحظات التي تم جمعها ، يبدو أنه من السابق لأوانه الترويج للديسفلفرام كعلاج جديد واعد حتى يتم استكشاف الأسباب الكامنة وراء السميات المبلغ عنها ، ونشر نتائج تجربة سريرية مزدوجة التعمية جيدة التنفيذ. تم التأكيد على أهمية مراعاة النتائج التي أبلغ عنها المريض في مرض لايم في الدراسة الحالية.


مقدمة

تمتلك الجسيمات النانوية لأكسيد السيريوم (CeNPs) نشاطًا قويًا مضادًا للأكسدة يُعزى إلى بنية شبكية بلورية مع شواغر أكسجين لاكتساب أو إطلاق الإلكترونات أثناء التذبذب من حالة Ce +3 إلى حالة Ce +4 (Reed et & # xa0al. ، 2014) . في خالية من الخلايا و في المختبر نماذج الخلايا / الأنسجة ، يحاكي هذا النشاط التحفيزي وظيفة إنزيمات الكاتلاز الداخلية (Pirmohamed et & # xa0al. ، 2010) وديسموتاز الفائق (SOD) (Korsvik et & # xa0al. ، 2007) من أجل تحييد مجموعة متنوعة من أنواع الأكسجين التفاعلي ( ROS) ، بما في ذلك أكسيد النيتريك (Dowding et & # xa0al. ، 2012) ، والأكسيد الفائق (Pirmohamed et & # xa0al. ، 2010) ، والبيروكسينيتريت (Dowding et & # xa0al. ، 2013). مثل المواد النانوية الأخرى ، يمكن إنتاج CeNPs من خلال مجموعة من طرق التوليف ، مما ينتج عنه أحجام جسيمات مختلفة ، وشحنات سطحية ، وإمكانات زيتا. بالإضافة إلى ذلك ، من المحتمل أن يؤدي تفعيل الجزيئات باستخدام المثبتات ومواد الطلاء إلى تغيير مجموعة متنوعة من العوامل بما في ذلك النشاط التحفيزي (Lee et & # xa0al.، 2013 Dunnick et & # xa0al.، 2015) ، اتجاهات التجميع (Ould-Moussa et & # xa0al.، 2014) ، تشكيل الهالة لصالح الجسيمات ذات السالب في المختبر إمكانات زيتا (Patil et & # xa0al. ، 2007) ، واحتمالية الامتصاص الخلوي (Patil et & # xa0al. ، 2007) ، ونمط التوزيع الحيوي ، والذي يختلف أيضًا باختلاف مسار الإدارة وحجم الجسيمات (Yokel et & # xa0al.، 2009 Hardas et & # xa0al.، 2010 Hirst et & # xa0al.، 2013 Yokel et & # xa0al.، 2013).

على الرغم من التحقيق في الآثار السمية للتعرض العرضي والمهني لـ CeNP ، فقد تم تطبيق CeNPs بشكل متزايد على نماذج الأمراض ، لا سيما تلك التي تنطوي على الإجهاد التأكسدي (Heckman et & # xa0al.، 2013 Bailey et & # xa0al.، 2016 DeCoteau et & # xa0al.، 2016 Kwon et & # xa0al.، 2016 Naz et & # xa0al.، 2017). ثبت مؤخرًا أن إدارة CeNPs فعالة في نماذج إصابات الدماغ الرضحية (Bailey et & # xa0al. ، 2016) ، التصلب الجانبي الضموري (ALS) (DeCoteau et & # xa0al. ، 2016) ، تلف الرئة الناجم عن الإشعاع (Xu) et & # xa0al.، 2016) والكبد المزمن (Or & # xf3 et & # xa0al.، 2016) أو إصابة الكلى (Manne et & # xa0al.، 2015a) والتهاب الصفاق (Manne et & # xa0al.، 2015b) والسمنة (Rocca et & # xa0al ، 2015). على الرغم من أنه من المغري استقراء قابلية تطبيق هذه النتائج على الكل CeNPs ، حتى ضمن هذه الدراسات القليلة فقط ، تتراوح الجسيمات المستخدمة من 3 & # x201380 نانومتر في الحجم ، وأظهرت كميات متغيرة من التجميع ، وتم تسليمها بجرعات تتراوح من 0.0007 مجم / كجم (Xu et & # xa0al. ، 2016) إلى 20 مجم / كجم (DeCoteau et & # xa0al. ، 2016) للفئران و 0.05 مجم / كجم (Bailey et & # xa0al. ، 2016) إلى 0.5 مجم / كجم (Rocca et & # xa0al. ، 2015) للفئران. وهكذا ، في حين أن الصيغ المختلفة لـ CeNPs أظهرت نشاطًا مضادًا للأكسدة ، فإن التحقيق الموازي للنشاط التحفيزي والفعالية البيولوجية لـ CeNPs سيعزز فهمنا لكيفية تأثير الخصائص الفريدة لـ CeNPs على وظيفتها.

ندرس CeNPs (CNRx) المخصص بخصائص مميزة عن تركيبات nanoceria الأخرى. هذه CeNPs صغيرة نسبيًا عند 1.5 & # x20133.0 نانومتر ويتم تثبيتها بالسيترات و EDTA. على الرغم من أن المواد النانوية عادةً ما تمتص عددًا كبيرًا من البروتينات في الإكليل الخاص بها (Monopoli et & # xa0al. ، 2012) ، إلا أن عددًا صغيرًا نسبيًا من البروتينات يلتزم بـ CNRx CeNPs (Heckman et & # xa0al. ، 2014): ملف تعريف للجزيئات من شأنه أن تعزيز امتصاص المستقبل بوساطة (ApoE) و transcytosis (الألبومين). تعرض هذه CeNPs نشاط الكاتلاز و SOD في المختبر، مما يمكّن من خفض مستويات الأكسجين التفاعلية في شرائح الدماغ الحُصَينِيّة المكشوفة خارج الجسم الحي للظروف الدماغية (Estevez et & # xa0al. ، 2019). علاوة على ذلك ، تعارض CeNPs التحولات التي يسببها البيروكسيد أو نقص التروية في إمكانات تقليل الأكسدة في أنسجة المخ (DeCoteau et & # xa0al. ، 2016). هذا النشاط المضاد للأكسدة يترجم إلى في الجسم الحي الفعالية في نماذج الفئران المؤكسدة للتصلب المتعدد [التهاب الدماغ والنخاع المناعي التجريبي الذاتي (EAE)] (Heckman et & # xa0al. ، 2013) و ALS (DeCoteau et & # xa0al. ، 2016). أظهرت الفئران التي تم تحفيزها باستخدام EAE المعالجة عن طريق الوريد باستخدام CNRx CeNPs انخفاضًا في شدة المرض الإكلينيكي واحتفظت بالوظيفة الحركية المشابهة للفئران التي عولجت بعقار موصوف حاليًا ، Fingolimod. المستويات المنخفضة داخل الخلايا لـ ROS المكتشفة في أدمغة الحيوانات المعالجة تدعم آلية الحماية المضادة للأكسدة (Heckman et & # xa0al.، 2013).

على الرغم من فعالية CeNPs المخصص لـ CNRx في نموذج EAE ، فشل علاج الفئران EAE بتركيبة أخرى من CeNP في توفير الحماية من الأعراض والحفاظ على الوظيفة الحركية ، ما لم يتم تسليمه بالتزامن مع عقار lenalidomide (Eitan et & # xa0al.، 2015). تميزت هذه الصيغة من CeNPs بنصف قطر هيدروديناميكي يبلغ 34 + / & # x2212 6.8 نانومتر (في محلول مائي) (Eitan et & # xa0al. ، 2015) ، وهو الحجم الذي ربما أعاق التدفق إلى الدماغ (كان محتوى الدماغ من ceria. غير مقدم) وبالتالي قد يكون مسؤولاً جزئيًا على الأقل عن عدم وجود نتائج بيولوجية مفيدة في هذا السياق. ومع ذلك ، فإن الافتقار إلى تحليل ترسب الأنسجة وتوصيف مستويات ROS أو التلف في أدمغة الفئران المعالجة يجعل من الصعب تحديد السبب الدقيق وراء فشل هذه الصيغة الأخرى من CeNPs في منع تطور EAE في هذه الدراسة.

لذلك ، للتوفيق بين التأثيرات التفاضلية المرصودة لتركيبات CeNP المتميزة ، أجرينا تجربة EAE لاختبار الفعالية العلاجية للعديد من تركيبات CeNP بالتوازي. في المختبر أشار توصيف CeNPs مخصص من Cerion NRx (CNRx CeNPs) (Heckman et & # xa0al. ، 2013) و Nanophase CeNPs (NP CeNPs) و Treibacher Industrie CeNPs (TI CeNPs) إلى خصائص فيزيائية مميزة ولكن نشاط مضاد للأكسدة مماثل بشكل معقول للأنواع الثلاثة من CeNPs في الأنظمة الخالية من الخلايا ، ونسيج الدماغ الإقفاري ، والضامة المنشطة. ومع ذلك ، عرضت فقط CNRx CeNPs في الجسم الحي الفعالية ، من خلال حماية فئران EAE من تطور الأعراض والعجز الحركي. توضح هذه الملاحظات أن التأثيرات البيولوجية التي لوحظت مع نوع واحد من CeNP لا يمكن بالضرورة تعميمها عليها الكل أشكال CeNPs و ، علاوة على ذلك ، أن في المختبر قد لا تترجم التأثيرات البيولوجية إلى تأثيرات مقابلة في الجسم الحي.


العواقب الأوسع للدراسات سيئة التصميم

العديد من المشكلات التي يعاني منها التصميم التجريبي في أبحاث الحيوانات ليست فريدة من نوعها. وجد العمل التمهيدي لمجموعة سينا ​​، على سبيل المثال ، أن الدراسات قبل السريرية في المختبر غالبًا ما تعاني بالفعل أكثر من الدراسات على الحيوانات من التصميم التجريبي الضعيف. تقول سينا: "كان لدي طالبة جامعية تعمل معي والتي نفذت مشروعًا تجريبيًا يبحث في تصميم الدراسة في المختبر ، ولم يتم اختيار أي من الدراسات التي نظرت فيها في عينتها بشكل عشوائي ، ولم يكن أي منها مصابًا بالعمى" ، مشيرة إلى ذلك قد يكون انخفاض مستوى الفحص والتكلفة المنخفضة المرتبطة بالبحوث المخبرية من العوامل المساهمة.

ومع ذلك ، فإن التكاليف المرتبطة بالدراسات سيئة التصميم يتم تضخيمها لأبحاث الحيوانات بسبب الأسئلة الأخلاقية الصعبة التي تثيرها ، وقد بدأت في إحداث عواقب حقيقية على المجتمع العلمي مع زيادة الوعي العام بها. في سويسرا ، على سبيل المثال ، إلى جانب إجراءات ترخيص الحيوانات الأكثر صرامة ، يتزايد الضغط السياسي لتقليل التجارب على الحيوانات أو القضاء عليها. في أبريل / نيسان الماضي ، أعلنت الحكومة الفيدرالية أنها ستجري استفتاءً وطنياً بشأن حظر التجارب على الحيوانات تمامًا بعد أن حصلت حملة لمثل هذا التصويت ، أطلقتها مجموعة من المواطنين السويسريين ، على أكثر من 100000 موقع. أثارت هذه الخطوة انتقادات من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية والجامعات السويسرية ، وهي مجموعة من مؤسسات التعليم العالي ، التي تقول إن إقرار مثل هذا القانون سيعيق البحث. من المتوقع أن يتم التصويت في حوالي عام 2022.

يقول فوربل إن النقاش يجب أن يكون بمثابة دعوة للاستيقاظ للباحثين الذين يعملون مع الحيوانات. ويشرح قائلاً: "يحتاج [العلماء] إلى إقناع الناس بأن ما يفعلونه [هم] مفيد ، وصحيح ، وأنهم يأخذون الاهتمامات الأخلاقية على محمل الجد". "ولكن لا يمكنك القيام بذلك بشكل مقنع إلا إذا تأكدت من أن العلم صارم وأنك فعلت كل ما في وسعك للتأكد من أن الضرر الواقع على الحيوانات ضئيل قدر الإمكان."


نماذج من تكوّن اللوكيميا تتضمن FLT3

قام عدد من النماذج بالتحقيق في الدور المحتمل لإشارات FLT3 في تكوين الدم. ينتج عن ترنسفكأيشن لخطوط الخلايا المعتمدة على العامل غير الخبيث مع الأشكال المنشّطة بشكل أساسي من FLT3 نمو عامل مستقل وسرطان الدم عند حقن هذه الخلايا في الفئران المصنّعة. 18 ومع ذلك ، فإن تعداء الفيروسات القهقرية لخلايا نخاع عظم الفئران الأولية مع طفرات FLT3 لا تسبب اللوكيميا ، ولكنها تؤدي إلى مرض تكاثر نقوي قاتل قليل النسيلة (MPD) بمتوسط ​​وقت نمو 40-60 يومًا. 19 يمكن أن يكون الافتقار إلى تعدد النسيلة دليلًا على أن مواقع إدخال الفيروس القهقرية قد تنشط جينات أخرى يمكن أن تساهم في النمط الظاهري لاضطراب تعدد الشخصية (MPD). عندما يتم الجمع بين طفرات FLT3 والتغيرات الجينية الأخرى ، يحدث التحول الكامل لسرطان الدم. على سبيل المثال ، عند استخدام طفرات FLT3 / ITD لإصابة الفئران المعدلة وراثيًا MRP8 PML-RARα التي تمثل APL ، يحدث التحول الكامل إلى سرطان الدم الحاد مع وقت تأخير أقل مقارنة بالمرض الذي يحدث في الفئران دون إصابة FLT3 / ITD (من متوسط ​​250 يومًا بدون إلى 105 أيام مع FLT3 / ITD). 20 بالإضافة إلى ذلك ، تميل هذه الفئران إلى زيادة عدد الكريات البيضاء المفرط الذي يميز M3 AML في المرضى الذين يعانون من طفرات FLT3 / ITD. مرة أخرى ، المرض هو قليل النسيلة ، مما يعني أن مواقع إدخال الفيروسات القهقرية يمكن أن تساهم أيضًا. تشمل التغييرات الجينية الأخرى التي تؤدي إلى الإصابة بسرطان الدم عندما تقترن بطفرات FLT3 من خلال العدوى الفيروسية لنخاع عظم الفئران: NUP98-Hox و AML1-ETO و MLL-ENL و MLL-SEPT6.

كما تم الإبلاغ عن نماذج الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن طفرات FLT3. عندما يتم التعبير عن FLT3 / ITD وراثيًا تحت سيطرة محفز vav ، فإنه ينتج عنه اضطراب تعدد الشخصية (MPD) مع زمن انتقال المرض من 6 إلى 12 شهرًا في معظم خطوط التأسيس بالإضافة إلى مرض B أو T-lymphoid في سطرين مؤسسين آخرين. 21 قد يعني الفاصل الزمني الكبير لتطوير MPD أن التعديلات الأخرى ضرورية للتعاون مع إشارات FLT3 / ITD لإعطاء MPD أو الأورام اللمفاوية الخبيثة.

هناك أيضًا بعض الأدلة من نموذج الفئران على أن التنشيط التأسيسي للنوع البري FLT3 يمكن أن يساهم في تكوين الدم. يأتي هذا من تجربة تم فيها زرع الفئران المعرضة للإشعاع بشكل مميت مع الخلايا الجذعية / السلفية لنخاع عظم الفئران المنقولة ببنية تعبر عن FL إما سرطان الدم الليمفاوي أو اللوكيميا النخاعي بعد فترة تأخر طويلة. 22


الملخص

لطالما كان علماء الأحياء مفتونين بإمكانية أن تغير الخلايا هويتها ، وهي ظاهرة تُعرف باسم اللدونة الخلوية. إن اكتشاف أن الخلايا المتمايزة نهائياً يمكن إقناعها تجريبياً لتصبح متعددة القدرات قد أدى إلى تنشيط المجال ، وأظهرت الدراسات الحديثة أن التغييرات في هوية الخلية لا تقتصر على المختبر. على وجه التحديد ، تحتفظ بعض الخلايا البالغة بالقدرة على عدم التمايز أو التمايز في ظل الظروف الفسيولوجية ، كجزء من استجابة العضو الطبيعية للإصابة. سلطت الدراسات الحديثة الضوء على مدى مساهمة اللدونة الخلوية في استتباب الأنسجة ، وهي النتائج التي لها آثار على العلاج القائم على الخلايا.


مقدمة

يعتبر غسل اليدين بالماء و / أو الصابون طريقة مهمة وغير مكلفة لمنع انتقال العدوى لأنها فعالة في إزالة الملوثات ، بما في ذلك البكتيريا المسببة للأمراض أو الفيروسات ، من اليدين. 1-3 في الوقت الحاضر ، تنتج الصناعة مجموعة متنوعة من الصابون التجاري الموصوف بأنه "مضاد للبكتيريا" أو "مضاد للميكروبات". يشير الصابون المضاد للبكتيريا إلى الصابون الذي يحتوي على مكونات ذات نشاط نشط مضاد للميكروبات ، من ناحية أخرى ، لا يحتوي الصابون العادي على مثل هذه المكونات. 3 ملايين المستهلكين في الولايات المتحدة يستخدمون صابون اليدين المضاد للبكتيريا ومنتجات غسول الجسم ، 4 ينفقون ما يقرب من 1 مليار دولار سنويًا: من المتوقع أن توفر هذه المنتجات حماية من مسببات الأمراض أكثر من الصابون العادي. 5

في ديسمبر 2013 ، اقترح مركز تقييم الأدوية والبحوث (CDER) التابع لإدارة الغذاء والدواء الأمريكية تعديلًا على الدراسة النهائية المؤقتة لعام 1994 (TFM) فيما يتعلق بالمنتجات المطهرة التي لا تستلزم وصفة طبية. 6 ينص هذا على أن مصنعي صابون اليدين المضاد للبكتيريا والمخصص للاستخدام مع الماء يجب أن يثبتوا أنهم أكثر أمانًا وفعالية من الصابون العادي والماء عندما يتعلق الأمر بمنع المرض و / أو انتشار العدوى. إذا لم تتمكن الشركة المصنعة من تقديم دليل علمي لدعم الادعاءات ، فسيتعين إعادة صياغة هذه المنتجات أو إعادة تسميتها لتظل في السوق.

تريكلوسان (سي12ح17Cl3ا2 2،4،4′-trichloro-2′-hydroxydiphenyl ether) هو أكثر المكونات النشطة المطهرة شيوعًا المستخدمة في الصابون. Triclosan هو عامل مضاد للميكروبات فينوكسيفينول تم تطويره لأول مرة في أوائل الستينيات ، وقد استخدم على نطاق واسع كعامل مضاد للبكتيريا أو مضاد للفطريات منذ السبعينيات. 3 يُضاف إلى العديد من منتجات العناية الشخصية ومستحضرات التجميل ، بما في ذلك الصابون ومعجون الأسنان والمستحضرات والشامبو ، وكذلك إلى المنتجات الأخرى ، مثل الملابس وأدوات المطبخ والأثاث ولعب الأطفال ، بهدف تقليل أو منع التلوث البكتيري والنمو. 7 ، 8 غالبية صابون اليدين السائل الذي يتم تسويقه على أنه "مضاد للبكتيريا" يحتوي على مادة التريكلوسان كعنصر نشط. 9 وجدت دراسة أجريت في عام 2001 أن 76٪ من صابون اليدين السائل و 29٪ من قطع الصابون تحتوي على تريكلوسان. 10

يحتوي التريكلوسان على نشاط مضاد للجراثيم ضد البكتيريا والفطريات والفيروسات بالفعل ، وهناك القليل من الشك في أن المركب له نشاط مضاد للميكروبات. 11 ، 12 ومع ذلك ، لا يزال استخدام التريكلوسان مثيرًا للجدل لأنه تم الإبلاغ عن العديد من الآثار الضارة ، بما في ذلك الحساسية ، ومقاومة المضادات الحيوية ، واضطراب الغدد الصماء ، والسمية الحادة / المزمنة ، والتراكم البيولوجي ، حتى أن إحدى الدراسات حددت الشوائب المسرطنة. 9 ، 11 ، 13-19 أيضًا ، كانت فعالية الصابون المضاد للبكتيريا غير حاسمة ، وتظل هناك أسئلة حول ما إذا كان الصابون المضاد للبكتيريا أكثر فعالية من الصابون العادي. كانت هناك مراجعتان للأدبيات حول فعالية الصابون المضاد للبكتيريا. 9 ، 20 أيلو وآخرون. استنتج 9 أن الصابون المضاد للبكتيريا المحتوي على التريكلوسان لم يكن أكثر فعالية من الصابون العادي. من ناحية أخرى ، خلص مونتفيل وشافنر 20 إلى أن الصابون المضاد للبكتيريا أدى إلى انخفاض كبير في عدد البكتيريا مقارنة بالصابون العادي ، على الرغم من أن الاختلافات كانت صغيرة (حوالي 0.5 فرق تقليل لوغاريتمي). قدمت هذه المخاوف بشأن السلامة والفعالية الخلفية للحكم المقترح من قبل إدارة الغذاء والدواء. 6

فحصت معظم الدراسات النشاط المضاد للبكتيريا للتريكلوسان من خلال تحديد MIC الخاص به. 12 ، 21-26 ومع ذلك ، تؤكد إدارة الغذاء والدواء الأمريكية أن اختبار MIC غير مناسب عند تقييم فعالية المكونات المطهرة ، نظرًا لأن اختبار MIC يتطلب وقتًا طويلاً للتعرض (يوم واحد على الأقل) بشكل واضح ، فإن هذا لا يكرر وقت التعرض النموذجي لـ مستهلك للمنتجات التي تحتوي على مضادات الميكروبات. 6 أوصت إدارة الغذاء والدواء مؤخرًا باستخدام "مقايسة قتل الوقت المعدلة" لتقديم دليل على فعالية المكونات المطهرة النشطة وأن تركيز المركب ووقت التلامس يجب أن يعكس مواقف الحياة الواقعية. 6 كما أوصوا بذلك في المختبر يجب إجراء الدراسات باستخدام السلالات المرجعية والعزلات السريرية التمثيلية [20 سلالة (تسعة أجناس) 10 إيجابية الجرام و 10 سلبية الجرام]. 6 الأجناس التسعة هي كما يلي: كامبيلوباكتر, المكورات المعوية, الإشريكية, الليستيريا, السالمونيلا, المكورات العنقودية, العقدية, شيغيلا و الزائفة (الجدول 1).

السلالات البكتيرية العشرين التي اقترحتها إدارة الغذاء والدواء الأمريكية تم اختبارها في هذه الدراسة

سلالة بكتيرية . رقم ATCC.
غرام إيجابي
المكورات المعوية البرازية19433
المكورات المعوية البرازية29212
المكورات العنقودية الذهبية6538
المكورات العنقودية الذهبية29213
MRSA 33591
MRSA 33592
الأبراج العقدية14289
الأبراج العقدية19615
الليسترية المستوحدة7644
الليسترية المستوحدة19115
الجرام سالب
العطيفة الصائمية33291
العطيفة الصائمية49943
الإشريكية القولونية11775
الإشريكية القولونية25922
الزائفة الزنجارية15442
الزائفة الزنجارية27853
السالمونيلا إنتريتيديس 13076
السالمونيلا التيفيموريوم 14028
شيغيلا سوني9290
شيغيلا سوني25931
سلالة بكتيرية . رقم ATCC.
غرام إيجابي
المكورات المعوية البرازية19433
المكورات المعوية البرازية29212
المكورات العنقودية الذهبية6538
المكورات العنقودية الذهبية29213
MRSA 33591
MRSA 33592
الأبراج العقدية14289
الأبراج العقدية19615
الليسترية المستوحدة7644
الليسترية المستوحدة19115
الجرام سالب
العطيفة الصائمية33291
العطيفة الصائمية49943
الإشريكية القولونية11775
الإشريكية القولونية25922
الزائفة الزنجارية15442
الزائفة الزنجارية27853
السالمونيلا إنتريتيديس 13076
السالمونيلا التيفيموريوم 14028
شيغيلا سوني9290
شيغيلا سوني25931

السلالات البكتيرية العشرين التي اقترحتها إدارة الغذاء والدواء الأمريكية تم اختبارها في هذه الدراسة

سلالة بكتيرية . رقم ATCC.
غرام إيجابي
المكورات المعوية البرازية19433
المكورات المعوية البرازية29212
المكورات العنقودية الذهبية6538
المكورات العنقودية الذهبية29213
MRSA 33591
MRSA 33592
الأبراج العقدية14289
الأبراج العقدية19615
الليسترية المستوحدة7644
الليسترية المستوحدة19115
الجرام سالب
العطيفة الصائمية33291
العطيفة الصائمية49943
الإشريكية القولونية11775
الإشريكية القولونية25922
الزائفة الزنجارية15442
الزائفة الزنجارية27853
السالمونيلا إنتريتيديس 13076
السالمونيلا التيفيموريوم 14028
شيغيلا سوني9290
شيغيلا سوني25931
سلالة بكتيرية . رقم ATCC.
غرام إيجابي
المكورات المعوية البرازية19433
المكورات المعوية البرازية29212
المكورات العنقودية الذهبية6538
المكورات العنقودية الذهبية29213
MRSA 33591
MRSA 33592
الأبراج العقدية14289
الأبراج العقدية19615
الليسترية المستوحدة7644
الليسترية المستوحدة19115
الجرام سالب
العطيفة الصائمية33291
العطيفة الصائمية49943
الإشريكية القولونية11775
الإشريكية القولونية25922
الزائفة الزنجارية15442
الزائفة الزنجارية27853
السالمونيلا إنتريتيديس 13076
السالمونيلا التيفيموريوم 14028
شيغيلا سوني9290
شيغيلا سوني25931

على حد علمنا ، لم تفحص أي دراسة منشورة الفعالية المضادة للبكتيريا للتريكلوسان في الصابون ضد جميع السلالات العشرين المدرجة. لذلك ، كانت أهداف هذه الدراسة هي: (1) فحص تأثيرات مبيد الجراثيم للتريكلوسان في الصابون ضد جميع السلالات العشرين في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية) وفي الماء الدافئ (40 درجة مئوية) بعد فترة تعرض قصيرة (20). س) (في المختبر دراسة) و (2) لمقارنة قدرة الصابون العادي والصابون المضاد للبكتيريا على الإزالة / التعطيل السراتية الذابلة تم تلقيحها بشكل مصطنع في أيدي الإنسان (في الجسم الحي دراسة).


الدورة في المختبر

التواجد الواسع للحلقات الحلقية في الجسم الحي وقد تسببت دراسة خصائصها الهيكلية والوظيفية في الطلب على الأساليب التي تسمح بالإعداد الفعال للحمض النووي الريبي الدائري في المختبر. هناك مجموعة مختارة من البروتوكولات الكيميائية والإنزيمية المتاحة ، ولكن الغالبية منها أكثر ملاءمة للـ RNAs الصغيرة والمتوسطة الحجم. في معظم الحالات ، يمكن تصنيعها كيميائيًا لضمان نهايات 5′ و 3′ متجانسة. في المختبر غالبًا ما يرتبط النسخ بعدم التجانس النهائي ، مما يقلل بشكل كبير من عائد الربط للتعميم. يمكن التغلب على ذلك باستخدام بروتوكولات خاصة (60). ومع ذلك ، فإن تعميم RNAs الأكبر لا يزال يمثل تحديًا. هنا ، على وجه الخصوص ، أظهرت مجموعة الإنترونات المعدلة مع الإنترونات والإكسونات (إستراتيجية PIE) وعدًا كبيرًا. بشكل عام ، استراتيجيات ربط الجبيرة الكيميائية أو الأنزيمية أكثر قابلية للتكيف بسهولة مع أي تسلسل مهم ، في حين أن PIE والطرق المحفزة ذات الصلة بالحمض النووي الريبي تعاني من قيود التسلسل. يُعد الطي المناسب للحمض النووي الريبي جنبًا إلى جنب مع متطلبات التسلسل في الموقع النشط لمحفزات الحمض النووي الريبي قيودًا خطيرة مرتبطة بهذه الإجراءات. ومع ذلك ، هناك أيضًا أمثلة رائعة لتحضير جزيئات RNA دائرية كبيرة.

الربط الكيميائي / التوليف

كانت شباروفا هي الرائدة في الربط الكيميائي لخيوط الحمض النووي وآخرون. استخدام بروميد السيانوجين (BrCN) مع مشتقات مورفولينو مثل 2- (N-morpholino) - حمض سلفونيك الميثان (MES) لربط شريطين DNA يحملان مجموعة 5′-hydroxyl و 3′-phosphate (61) (قارن الشكل 4 ).

تعميم الحمض النووي الريبي عن طريق الربط الكيميائي ببروميد السيانوجين في وجود مشتق مورفولينو كمنشط. R = CH3 CH2CH2وبالتالي3ح.

تعميم الحمض النووي الريبي عن طريق الربط الكيميائي ببروميد السيانوجين في وجود مشتق مورفولينو كمنشط. R = CH3 CH2CH2وبالتالي3ح.

في وقت لاحق ، تم استخدام عوامل التكثيف الأخرى مثل ethyl-3- (3′-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) لدعم تكوين رابطة phosphodiester ومع ذلك ، يبدو أن BrCN هو الكاشف الأكثر استخدامًا (62 ، 63). استراتيجيات الربط الكيميائي مفيدة أيضًا لتجارب التعميم (64 ، 65) (الشكل 4) ، بشرط أن يتم تقريب طرفي حبلا الحمض النووي الخطي (قارن الشكل 5). يتم تحقيق ذلك عادةً عن طريق جبيرة قليلة النوكليوتيد تتفاعل مع الطرفين وبالتالي تسمح بالتدوير. وبطبيعة الحال ، فإن الربط بين الجزيئات هو رد فعل منافسة شديدة ، ومع ذلك يمكن قمعه من خلال العمل بتركيزات صغيرة من الحمض النووي ليتم تدويره. التفاعل الجانبي الأكثر خطورة المرتبط بالربط الكيميائي لخيوط الحمض النووي الريبي مقارنةً بالحمض النووي هو تكوين روابط 2 ، 5′-phosphodiester بدلاً من 3 ، 5′-phosphodiester الطبيعي. من أجل التحايل على هذه المشكلة ، غالبًا ما يتم استخدام أليغنوكليوتيدات مع جزء سكر 2′-deoxy في نهاية 3′ من قليل النوكليوتيد المراد تعميمه (65 ، 66) (بيانات تكميلية ، البروتوكولات S1 و S2).

استراتيجيات محاذاة النهايات التفاعلية للربط الإنزيمي. يتم تحقيق التوجيه المسبق لـ 5′-p و 3′-OH من الركيزة RNA (أ) عن طريق التهجين إلى جبيرة. يمكن استخدام هذه الاستراتيجية للربط بـ T4 DNA ligase (جبيرة DNA مطلوبة) ، T4 RNA ligase 1 (جبيرة RNA مطلوبة) و T4 RNA ligase 2 (جبيرة DNA أو RNA) (68) (ب) بواسطة دبوس الشعر و oligonucleotides المساعد الخطي (87) (ج) بواسطة جبيرة فجوة تترك عند التهجين طرفين أو ثلاثة نيوكليوتيدات لكلا الطرفين منفردًا عند تقاطع الربط (88) (د) من خلال الهياكل الجوهرية المواتية (مثل طيات الدمبل (17)). الاستراتيجيات (ب) و (د) و (ج) مواتية للربط بـ T4 RNA ligase 1. يمكن استخدام جميع الاستراتيجيات أيضًا لربط الحمض النووي الريبي الكيميائي. لاحظ أنه في هذه الحالة يكون 3′-فوسفات ومجموعة 5′-OH مواتية.

استراتيجيات محاذاة النهايات التفاعلية للربط الإنزيمي. يتم تحقيق التوجيه المسبق لـ 5′-p و 3′-OH من الركيزة RNA (أ) عن طريق التهجين إلى جبيرة. يمكن استخدام هذه الاستراتيجية للربط بـ T4 DNA ligase (جبيرة DNA مطلوبة) ، T4 RNA ligase 1 (جبيرة RNA مطلوبة) و T4 RNA ligase 2 (جبيرة DNA أو RNA) (68) (ب) بواسطة دبوس الشعر و oligonucleotides المساعد الخطي (87) (ج) بواسطة جبيرة فجوة تترك عند التهجين طرفين أو ثلاثة نيوكليوتيدات لكلا الطرفين منفردًا عند تقاطع الربط (88) (د) من خلال الهياكل الجوهرية المواتية (مثل طيات الدمبل (17)). الاستراتيجيات (ب) و (د) و (ج) مواتية للربط بـ T4 RNA ligase 1. يمكن استخدام جميع الاستراتيجيات أيضًا لربط الحمض النووي الريبي الكيميائي. لاحظ أنه في هذه الحالة ، تكون مجموعة 3′-phosphate ومجموعة 5′-OH مواتية.

في عام 1999 ، ميكورا وآخرون. أبلغ عن نهج لتخليق المرحلة الصلبة من RNAs دائرية بطول 2-21 نيوكليوتيدات (67). يجمع الإجراء بين كيمياء الفوسفوراميديت القياسية لتجميع السلاسل وكيمياء الفوسفوتريستر لإغلاق الحلقة. عنصر أساسي في الإجراء هو ربط نيوكليوسيد البداية عبر 3′-phosphodiester إلى دعامة البوليمر. بعد الانتهاء من تجميع السلسلة ، تولد عملية إزالة الترسبات النهائية مجموعة هيدروكسيل 5′-terminal للهجوم المحب للنيوكليوفيليستر على الفوسفودايستر الفوسفاتي 3′ الفريد ، مما يؤدي إلى التعميم بينما لا يزال قليل النيوكليوتيد مرتبطًا بالبوليمر. يتيح الانقسام اللاحق لمجموعات cyanoethyl الفصل الانتقائي للـ RNAs الدائرية. هذا ممكن ، لأن الجسيمات الحلقية فقط هي التي ترتبط عبر الفوسفوتريسترات عبر ا- مجموعة الكلوروفينيل إلى الراتينج وبالتالي يمكن إزالتها بشكل انتقائي عن طريق المعالجة بـ tetramethylguanidinium pyridine-2-aldoximate. لا تتم إزالة أليغوريبونوكليوتيدات المتبقية غير الدائرية أو المرتبطة بشكل خاطئ بسبب روابط الفوسفوديستير الأكثر ثباتًا. سمحت هذه الطريقة بإنتاج RNAs دائرية بمتوسط ​​عائد 15٪ (67).

الربط الإنزيمي

تم تطوير عدد من البروتوكولات للربط الأنزيمي للنيوكليوتيدات الاصطناعية (68). عادةً ما يتم استخدام ثلاثة ليجازات بولينيوكليوتيد مختلفة ، قادرة على ربط النكات في تركيبات RNA أحادية و / أو مزدوجة الشريطة: T4 DNA ligase (T4 Dnl) ، T4 RNA ligase 1 (T4 Rnl 1) و T4 RNA ligase 2 (T4 Rnl 2) ، جميعها مشفرة في جينوم العاثية T4 (69 ، 70). إنها تحفز تكوين رابطة فوسفوديستر بين مجموعات نهاية 5-فوسفات (مانح) و 3-هيدروكسيل (متقبل) في DNA أو RNA في تفاعل يعتمد على ATP.

بغض النظر عن التحضير الكيميائي أو الأنزيمي للسلائف الخطية ، يجب أن يتم فسفرة الطرف 5′ لتوفير الوظيفة المطلوبة للربط. يمكن إجراء الفسفرة كيميائيًا أو إنزيميًا (71) متبوعًا مباشرة بتفاعل التعميم (72) (البيانات التكميلية ، البروتوكولات S3 و S4). في حالة ركائز الحمض النووي الريبي المحضرة إنزيميًا ، فإن ثلاثي الفوسفات 5′ طرفي الناتج عن في المختبر يجب إزالة تفاعل النسخ قبل الفسفرة بواسطة عديد النوكليوتيد كيناز. للتحايل على الخطوتين الأنزيميتين لإزالة وإعادة الفسفرة ، تم إعداد GMP في المختبر يعد النسخ بواسطة T7 RNA Polymerase طريقة أنيقة للحصول على ركائز RNA خطية أحادية الفسفرة (73 ، 74) ، والتي يمكن استخدامها مباشرة لتعميم الحمض النووي الريبي (16 ، 75). في غالبية المنشورات ، تم وصف بروتوكولات T4 DNA ligase وكذلك تعميم RNA بوساطة ligase للـ RNAs القصير (& lt500 nt). تتطلب الركائز الكبيرة في مقاييس كيلو بايت استراتيجيات مختلفة ، بسبب التحديات الهيكلية. لذلك ، كما ذكر أعلاه ، لتعميم الحمض النووي الريبي الكبير ، قد تكون البروتوكولات التي تستخدم استراتيجية PIE (الموضحة أدناه) هي البديل الأفضل.

T4 DNA ligase

عند استخدام T4 DNA ligase ، يجب أن يكون موقع الربط موجودًا داخل منطقة مزدوجة الجديلة من الحمض النووي. المناطق التي تقطعت بهم السبل لا يتم ربطها. يمكن استخدام جبيرة قليلة النوكليوتيد لإنشاء المنطقة المزدوجة التي تقطعت بها السبل المطلوبة حول موقع الربط ، بالإضافة إلى ضمان تجاور 5-فوسفات و 3-هيدروكسيل تيرميني في DNA مزدوج أو RNA (76) (الشكل 5 أ). من الواضح أنه يجب تعديل درجة الحرارة وقياس العناصر المتكافئة وطول الجبيرة لكل ركيزة. إذا كان الحمض النووي الريبي منظمًا بدرجة عالية ، فقد يكون من المفيد استخدام الجبائر الأطول حتى الاقتران الأساسي بالطول الكامل (77). However, this enhances the risk of unfavorable structures in the splint itself. The temperature optimum for the enzyme is 16°C accordingly ligations are carried out preferentially at lower temperatures. T4 DNA ligase-mediated RNA ligation was pioneered by Moore and Sharp ( 78, 79), and ever since has been used in a number of protocols. The method was shown suitable also for RNA circularization. A representative example is the circularization of a 453-nt long RNA that, in its circular form, was successfully translated في المختبر ( 16) (Supplementary data, Protocol S5).

T4 RNA ligase 1

T4 RNA ligase 1 assists in the formation of 3′, 5′-phosphodiester bonds in single-stranded RNA molecules. Already in the early 1970s it has been shown that the enzyme can be used to produce a single-stranded circular product from a linear precursor with 3′-hydroxyl and 5′-phosphate termini ( 80). As mentioned above, intermolecular ligation is competing with ring formation. However, under suitable conditions, circularization can be made the predominant event. RNA chains with a minimal length of six to eight nucleotides could be circularized ( 81, 82) (Supplementary data, Protocol S6). T4 RNA ligase 1 has different preferences for donor and acceptor nucleotides at the ligation site: A > G ≥ C > U for the 3′-terminal nucleotide acceptor, and pC > pU > pA > pG for the 5′-terminal nucleotide donor ( 83, 84).

T4 RNA ligase 1 was used for circularization in a number of applications with short and long RNAs as substrates (for exemplary protocols see Supplementary data (Protocols S7 ( 81) and S8 ( 85)). An impressive example is the circularization of a linear RNA strand to yield an authentic infectious circular RNA of the citrus exocortis viroid strain A (CEV-A) ( 86). Furthermore, circular hammerhead ribozymes were synthesized from linear oligoribonucleotides using T4 RNA ligase 1 ( 87). The authors observed that circularization efficiency is strongly dependent on the nature of the RNA substrate some of the linear RNAs could not be efficiently circularized under standard conditions. For those RNA substrates, helper deoxyoligonucleotides, preventing the RNA substrate from folding into unsuitable structures, were used (Figure 5b). In the presence of the helper strands, circular ribozymes as small as 15 nucleotides in length could be efficiently synthesized at concentrations as high as 50 μM in the ligation reaction. Linear and hairpin type helper oligonucleotides were used. In the presence of the linear helper oligonucleotide circRNA was generated with 40% yield, the hairpin helper allowed for ring formation with nearly 100% yield ( 87) (Protocol S9, Supplementary data). The circular products retained their biological activity some displayed even increased catalytic activity and decreased need for divalent cations. In general, helper oligonucleotides have proven useful for proper orientation of the reactive ends. In addition to helper oligonucleotides that assist in ligation by interaction with the substrate in a distance from the ligation site (Figure 5b), also splints may be used that bring the reactive ends close together, but leave the terminal two to three nucleotides of both donor and acceptor single stranded. This is a common procedure for ssRNA ligation with T4 RNA ligase 1 ( 88, 89), and should be a suitable strategy also for circularization (Figure 5c). Another scenario uses internal base pairing of the linear precursor to promote ligation (Figure 5d). Beaudry and Perreault developed a procedure for the synthesis of circular RNAs of any sequence based on internal secondary structures to position the 5′- and 3′-termini as single-stranded region, but held in close proximity for subsequent ligation ( 90). In another approach, dumb-bell-shaped RNAs were synthesized by closing the loops of linear but secondary folded precursors with T4 RNA ligase 1 ( 17, 22, 91–93) (for representative protocols see Supplementary data, Protocol S10).

T4 RNA ligase 2

Inter- and intramolecular ligation activity of T4 RNA ligase 2 was described by Ho and Shuman in 2002 ( 94). However, compared with its close relative T4 RNA ligase 1, this RNA ligase is much more efficient in joining nicks in dsRNA substrates, rather than connecting the ends of ssRNA ( 95, 96). This characteristic feature was used to circularize a specific RNA substrate في المختبر with the donor and acceptor ends hold in proximity by internal secondary structures ( 75) (see Supplementary data, Protocol S11). A detailed mechanistic and kinetic analysis of T4 RNA ligase 2 is described in ( 94). There is a homologous protein to T4 RNA ligase 2 occurring in vibriophage KVP40. It also catalyzes RNA circularization of single-stranded small (such as 18 mers) RNAs in an ATP-dependent manner (see ( 97) for detailed comparison and kinetic data of T4 and KVP40 RNA ligase 2-dependent circularization). Furthermore, a truncated version of T4 RNA ligase 2 with 249 amino acid residues is commercially available. It ligates the enzymatically or chemically pre-adenylated 5′-end of DNA (AppDNA) or RNA (AppRNA) to the 3′-end of RNA in the absence of ATP ( 94, 98), and thus potentially can also be used for circularization.

Other RNA ligases with potential for in vitro RNA circularization

Apart from the three most widely used ligases described above, there are a number of other ligases capable of supporting RNA circularization. For example, tRNA ligases from wheat germ and a similar ‘ligase’ from Saccharomyces cerevisae may be applied for RNA ligation في المختبر ( 99–101). Compared with RNA ligases 1 and 2, these ligases accept substrates with 5′-terminal phosphate donors and 2′-terminal phosphate acceptors ( 99, 102). The formed internucleotide bond is a 2′-phosphomonoester, 3′, 5′-phosphodiester structure, as appearing in tRNA splicing intermediates في الجسم الحي ( 99, 100). A recombinant yeast RNA ligase was shown to convert linear introns to their circular counterparts, although notably slower than wild-type أرابيدوبسيس tRNA ligase ( 55).

Another RNA ligase was found in Pyrococcus abyssi, termed Pap1020. It performs the ATP-dependent circularization of oligoribonucleotides في المختبر. Ring formation occurs by intramolecular reaction between the 3′- and 5′-termini of the RNA, whereby in contrast to T4 RNA ligase 1 or 2 no oligomerization was observed as side reaction ( 103). A wide range of temperatures from 20 to 95°C was screened and found suitable for efficient ligation. Varying the ATP concentration from 5 μM to 1 mM revealed that circularization activity decreases with increasing ATP concentration (see Supplementary data, Protocol S12).

Yet another ligase, named RtcB, was described by Tanaka and Shuman ( 104). It belongs to an الإشريكية القولونية RNA repair operon with still unknown mechanistic features. Unlike classic ligases, RtcB seals broken RNAs with 3′-phosphate and 5′-OH termini. The reaction is dependent on GTP, which in the first step is bound to the protein via a histidinyl residue. The 3′-phosphate end takes over the guanylate and forms a polynucleotide-(3′)-pp-(5′)G intermediate. Subsequently, the 3′, 5′-phosphodiester bond is formed by nucleophilic attack of the 5′-terminal hydroxyl group onto the activated 3′-phosphate of the intermediate ( 105). The authors tested several GTP concentrations for RNA ligation and circularization, finding increasing yields of circRNA with increasing GTP concentration, up to complete ligation at 6.25 μM GTP (see Protocol S13, Supplementary data).

Artificial rolling circle replication and HPR supported circularization

As described above, viroids and other small infectious RNAs replicate via the double rolling circle mechanism ( 1, 50–51). An application using the rolling circle reaction and the self-splicing activity of the HPR for the generation of circular RNA was described by Kool and Diegelman ( 106). Circular single-stranded DNA templates were used for في المختبر transcription by either T7 or بكتريا قولونية RNA polymerase resulting in a multimeric repeating RNA sequence harboring the HPR element. Thus, upon transcription, RNA cleaved itself in monomer-length segments. The authors observed the subsequent formation of circular monomers and suggested that circularization occurs because of the intrinsic HPR activity ( 107). Data from our laboratory ( 75) and others ( 108, 109) further support the idea of HPR-derived RNA circularization. We have demonstrated that specifically designed linear RNAs harboring the HPR structure undergo self-processing and circularization ( 75). Dallas وآخرون. demonstrated that freezing stimulates the self-ligation (circularization) of linear forms of the HPR containing 2′,3′-cyclic phosphate and 5′-OH termini ( 108). In a similar study, self-processing of the 5′- and 3′-ends of a transcribed HPR derived precursor RNA followed by ligation of the processed ends to produce a circular RNA was shown ( 109).

PIE method (RNA cyclase ribozyme)

In contrast to the methods of chemical and enzymatic ligation, which can be merely applied في المختبر, a spontaneous group I intron self-splicing system, designated as the PIE method, allows circular RNA production في المختبر و في الجسم الحي (Figure 6). In 1992, Puttaraju and Been first reported that circularly permuted group I intron precursor RNAs derived from رباعية الغشاء أو Anabena, containing end-to-end fused exons that interrupt half intron sequences (comp. Figure 6a), self-splice to generate a circular RNA exon في المختبر ( 110). Ford and Ares Jr extended this work by demonstrating that foreign sequences can be placed in the exon of a permuted group I intron self-splicing system (here termed ‘cyclase ribozyme’) derived from the phage T4 td gene and made circular في المختبر ( 111). This is possible, because the exon sequence does not participate in the self-splicing reaction. Expression of such constructs in بكتريا قولونية and yeast resulted in the accumulation of circular RNAs ( 111). Mechanistically, the PIE method includes two transesterifications at defined splice sites as occurring in the normal group I intron self-splicing reaction. However, after splicing in the normal intron exons are ligated, whereas in the PIE are circularized (Figure 6b). The first transesterification leads to release of the 3′-terminal sequence (5′-half intron) of the PIE construct. The newly generated free 3′-OH group of the 3′-half exon attacks the 3′-splice site in the second transesterification. This results in circRNA and release of the 3′-half intron (Figure 6c).

Comparison of group I intron self-splicing with the permuted intron exon method. (أ) Illustration of the circular permutation of the intron. (ب) Upon splicing in the normal intron, exons are ligated and the intron is circularized. (ج) In the permuted intron, exons are circularized and split introns appear.

Comparison of group I intron self-splicing with the permuted intron exon method. (أ) Illustration of the circular permutation of the intron. (ب) Upon splicing in the normal intron, exons are ligated and the intron is circularized. (ج) In the permuted intron, exons are circularized and split introns appear.

Based on the PIE method, a wide variety of circular RNAs were generated. For example, circular RNA aptamers were produced في المختبر و في الجسم الحي ( 21, 112–114) as well as circular hammerhead ribozymes ( 115) and HDV ribozymes ( 116, 117). Basically, it is possible to create any desired circular RNA by inserting the sequence into a particular site of a plasmid, creating a new RNA cyclase ribozyme gene. Circular RNAs in the range of 71–1130 nt were generated ( 118).

With the studies cited above, production of RNA circles by the PIE method in بكتريا قولونية as well as in yeast was experimentally verified. However, so far the strategy has not been shown to work in mammalian cells.

Modified group II introns

It is also possible to modify group II introns for inverse splicing في المختبر generating RNA circles ( 119, 120). Mikheeva وآخرون. engineered a derivative of a yeast self-splicing group II intron that catalyzes the formation of a circular human exon في المختبر ( 119). RNA circles were formed by inverse splicing, which requires arranging the exons consecutively, positioning the branch point upstream and intronic sequences up- and downstream of the exons. This design allows exon circularization upon two transesterifications, excluding any intronic sequences in the circle. An advantage of this strategy in comparison to group I intron mediated exon circularization is the somewhat higher efficiency and the complete sequence variability (for group I intron mediated exon circularization the 3′-terminal residue of the 5′-exon must be U). However, based on the group II intron self-splicing mechanism, circRNAs produced via this pathway carry a 2′,5′-phosphodiester at the ligation/circularization site.


The Cost of IVF: 4 Things I Learned While Battling Infertility

When I found out that I was a carrier for the single-gene genetic disorder Tay-Sachs, a degenerative neurological condition that is fatal for children born with it, there was absolutely nothing to worry about…unless my husband was also a carrier.

The odds of that in my case, I had been told, were “one in a million,” so I wasn’t terribly concerned.

So my heart skipped a beat when I saw I had a missed call on my cell phone from my reproductive endocrinologist two weeks after my husband had finally gotten tested.

“You can imagine my surprise,” she began, “when Matt’s test results came across my desk this morning … and he’s a Tay-Sachs carrier.”

That’s when I found out I would be one of more than 85,000 women in the U.S. annually who undergo in-vitro fertilization, or IVF, as a way to create a family. Utilizing IVF and pre-implantation genetic diagnosis or PGD, the team of doctors and embryologists at our infertility practice would be able to create embryos, and then biopsy those embryos to ensure that only those not affected by Tay-Sachs were among those selected to create a pregnancy.

As I began researching IVF, I also dove into the financial details of the treatment.

Unraveling the seemingly foreign language of clinical terminology and insurance verbiage can be a heavy added stress on a patient struggling with infertility I offer the below as an introduction to anyone also beginning this process. Here are four things I learned in our journey thus far.

1. How Much IVF Actually Costs

My husband and I were back at our reproductive endocrinologist’s office a week after that first phone call, to learn more about the process … and its costs.

On average, nationally, a “fresh” IVF cycle costs $12,000, before medications, which typically run another $3,000 to $5,000. In a “fresh” IVF cycle, eggs are harvested transvaginally after a closely monitored period of ovulation-inducing medications and then “mixed” with fresh sperm. One or two of the best-looking of the resulting embryos are then transferred to the uterus via a thin catheter.

The PGD step of the process meant we were looking at another $3,000 to $6,000. Altogether, conservatively speaking, about $20,000 … for each attempt to have a healthy child utilizing a procedure that is successful (most optimistically) about 40% of the time, depending upon factors such as maternal age and the specific medical circumstances of the parents.

One of the most complex aspects of an infertility diagnosis is that for a patient to have her best chances for conception with IVF, she needs to act as quickly (to ensure that her eggs are as young and thus as viable as possible) as she can upon diagnosis. This biological urgency doesn’t exactly complement the equally pragmatic need to invest in the time to budget and save for treatment.

For some individuals undergoing IVF, if a fresh cycle doesn’t result in a pregnancy, and the remaining embryos from this fresh cycle can subsequently be used during a “frozen” cycle. “Frozen” cycles, often abbreviated as FET or Frozen Embryo Transfer, are much more economical, as they use “frozen” (technically, vitrified) embryos stored for future use. FET averages anywhere from $3,000 to $5,000 per cycle and annual storage fees for frozen embryos are typically an additional few hundred for each year.

Many practices offer “refund” and “discounted multi-cycle” programs. Practices with these kinds of programs offer various plans that provide patients with multiple IVF cycles for a single, discounted fee that costs about 30% to 40% less than the same exact treatment plan if you were to pay for it on a cycle-by-cycle basis.

Should you choose to go with a multi-cycle discount or refund package, you play an odds game. The packages only apply to one child at a time that is, if you pre-pay for three cycles and get pregnant the first time, you can’t use the subsequent cycles for your future attempts to conceive. Keep in mind, though, that to qualify for these programs, patients must undergo a pre-qualification evaluation, evaluating their odds of conceiving within the first cycle of treatment.

2. The Various Payment Options

In thinking about how to finance your treatments, remember that taking money out of your retirement fund comes with penalties and translates into money that will not be available—and not accruing interest—when it comes time for you to retire.

Using your credit cards as a quick loan will force you into a situation with high-penalty fees and interest, not to mention a swift hit to your credit score. During our research we learned of the Springstone loan program, which is geared toward infertility treatment financing and is reasonable in underwriting, interest rates, and repayment times.

If passed, The Family Act of 2013 would create a new tax credit for the out-of-pocket costs associated with IVF and fertility preservation. The proposed Family Act tax credit will only apply to those whose adjusted gross income falls below a certain combined, determined amount.

Infertility care is medical, and you may also deduct medical expenses that exceed 10% of your adjusted gross income on your taxes each year. Many parts of your infertility treatment will qualify for this kind of deduction, as preventive care, treatment, surgeries and prescription medications are all deductible.

Alternately, you can also put some of your income into a Flexible Spending Account, or FSA, which allows individuals to set aside pre-tax dollars for out-of-pocket health care costs. You may set aside up to $2,500 per individual in an FSA. While you can’t deduct expenses paid for from an FSA on your federal income tax return, you also do not have to meet the 10% adjusted gross income requirements needed for medical expense deductions.

3. How Insurance Coverage Works

One of the biggest misunderstandings when it comes to insurance coverage and infertility is what your insurance will actually cover, whether or not the actual physician you are seeing is “in-network.”

Fifteen states (Arkansas, California, Connecticut, Hawaii, Illinois, Louisiana, Maryland, Massachusetts, Montana, New Jersey, New York, Ohio, Rhode Island, Texas and West Virginia) have laws requiring varying levels of insurance coverage for infertility treatments.

Resolve, the National Infertility Association, offers an excellent state-by-state breakdown of these various benefits by state on its website. Even if you do live in a state with a mandate, not all mandates from state to state ensure the same level of coverage of care, so do familiarize yourself with your individual state’s policies.

Some insurance plans, such as my own, provide coverage only for the diagnostic phase of infertility treatment. A good rule of thumb in understanding what your insurance will and will not cover should you have such a plan is to ask if the procedure is something that will determine whether or not infertility does in fact exist and, if so, the cause of this infertility. Keep in mind that when the diagnostic phase ends, any subsequent treatment will not be covered, thus requiring you to pay out-of-pocket regardless of whether you are in- or out-of-network.

Other plans will cover the diagnostic phase and some infertility treatment services, but not all treatment services. If your plan offers some infertility treatment coverage, check with your individual plan to see their coverage policies for all possible avenues of care, from oral ovulation drugs to injectable ovulation induction medications to intrauterine insemination (IUI).

Remember to investigate all the plan options available to you compare the policy through which you currently have coverage with ones that might be offered by your partner’s employer, and compare its costs and benefits to see if it might offer more comprehensive infertility coverage.

Likewise, the new state and federal Health Insurance Marketplace now open as a result of the Affordable Care Act also allow you to see all possible plans available for purchase in your state. A new plan may come at a higher premium than what you’re currently paying, but could potentially save you tens of thousands of dollars.

4. How to Work With Your Practice’s Financial Services Department

Don’t forget to ask your physician’s office whether the prices for care quoted to you include all blood work, ultrasounds, monitoring and medications, or whether those will all be additional “à la carte” fees.

For example, when a plan covers injectable fertility medications, most plans have a “preferred” brand which they will in fact pay for, and they will deny payment on any of the others. So, if medically appropriate, your physician can choose the one that will be paid for by your insurance company as opposed to the one that will not.

Likewise, most insurance companies have a “preferred” lab to which they send routine lab work. If your practice sends the lab work to the lab that your insurance company recognizes, they will pay for it (if the lab tests are covered by your plan). If those same tests are sent to a lab that is not in-network for your plan, the plan will not pay. Make sure both you and your providers know the ins and outs of your plan.

The Affordable Care Act’s (or ACA) defining attribute is the mandating that certain insurance plans include what is now qualified as “essential health benefits.” Unfortunately, infertility treatment is not classified as an “essential health benefit.”

A huge win for those in the infertility community, however, is that, because of ACA, your insurance company can no longer discriminate against pre-existing conditions, of which an infertility diagnosis is one. That means your insurance company can no longer charge you a higher premium than someone who will not need infertility treatment, nor can you be denied coverage should you be seeking private insurance because of the diagnosis.

Where We Are Now

Because my husband’s and my need for IVF is due to a genetic disorder, there are some interesting questions to be asked—and still to be determined—on the implication of the Affordable Care Act as it defines preventive care.

As our need for IVF is to prevent a child from being born with, and subsequently dying from, Tay-Sachs disease, we have argued to our insurance company that under the Affordable Care Act, our IVF would qualify as preventive care, and thus be required to be covered as outlined by the law.

Pursuing IVF was the right next step for my husband and me. We’ve already taken the very first steps in our IVF journey, submitting DNA samples for the creation of the custom probe which will be used to test the biopsies from our future embryos. We will hopefully begin our first cycle next month. Though we know there is a long road ahead of us, we take such great comfort in knowing that, though the exact circumstances may vary, there are so many other individuals out there also pursuing a similar path.

This time of great uncertainty, a little anxiety, and many things beyond my control seem like the best preparation I could possibly receive as I prepare to become a parent … and plan for my family’s financial future.


شاهد الفيديو: 10 أشياء غريبة ومخجلة كانت مسموحة بشكل قانوني في الماضي (أغسطس 2022).