معلومة

لماذا لا يمكننا استخدام البلازميدات لإضافة جينات لأنفسنا؟

لماذا لا يمكننا استخدام البلازميدات لإضافة جينات لأنفسنا؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أتساءل عند قراءة هذه الإجابات ، لماذا لا يستخدم "العلاج الجيني" البلازميدات القائمة بذاتها بدلاً من محاولة لصق طول في كروموسوم؟


أولاً ، لا تندمج البلازميدات عادةً في صبغيات الخلايا البشرية. في المختبر ، يمكن إدخال البلازميدات في العصارة الخلوية للخلايا ، وبعد ذلك سيتم "قراءة" DNA البلازميد من قبل الخلية المضيفة واستخدامها لصنع بروتينات جديدة ، على سبيل المثال. لكن عادة ما تظل البلازميدات منفصلة عن الحمض النووي للخلية ، وبهذا المعنى فهي غير فعالة في العلاج الجيني.

ثانيًا ، إن خلايانا جيدة جدًا في اكتشاف وتدمير البلازميدات ، بالإضافة إلى الحمض النووي الغريب الآخر. هذه آلية للدفاع عن النفس ، تم تطويرها للتخلص من الفيروسات والطفيليات السيئة الأخرى التي قد تحاول اختطاف الخلية. في المختبر ، حيث نعمل مع خلايا معزولة في طبق مستنبت ، بدون جهاز مناعي ، عادة ما يتم تحمل البلازميدات. ولكن في الإنسان ، فإن الخلايا المناعية المتخصصة في الكشف عن الدخلاء تتمتع بكفاءة عالية في اكتشاف مثل هذه التلاعبات ، وسوف تطلق ناقوس الخطر بسرعة وتحدث الفوضى ... لذلك إذا تم حقنها في الجسم ، يتم اكتشاف البلازميدات وتدميرها بسرعة.

يهدف البحث في العلاج الجيني إلى إيجاد طرق أكثر فاعلية لـ "تعديل" الحمض النووي للخلايا البشرية ، في نهاية المطاف بطريقة يمكن تطبيقها بأمان في الجسم. مثل هذا الأسلوب غير موجود حتى الآن. يعد أحدث نظام لتحرير الجينات CRISPR-Cas9 أداة استثنائية وفعالة للغاية في الوصول إلى الحمض النووي للخلايا البشرية ؛ لكن بروتينات CRISPR-Cas9 يجب أن يتم توصيلها إلى الخلية ، والتي تحتاج إلى فيروس عادة ، وهذا من شأنه أن يتسبب مرة أخرى في ردود فعل مناعية إذا تمت تجربته في جسم الإنسان.


أعتقد أنه يمكننا استخدام إدخال البلازميد للمساعدة في العلاج الجيني. يمكن لـ EBV الحفاظ على البلازميد في الخلايا التي يصيبها ويمكن للبلازميدات أن تتكاثر بشكل فعال. مع زيادة فهم الكمون والآثار المترتبة على إدخال الجينات باستخدام EBV ، قد يكون من الممكن أن يحدث العلاج الجيني عبر الجينات على البلازميد. المراجع: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2562867/ http://jvi.asm.org/content/65/1/483.full.pdf


الفصل 3 الهندسة الوراثية

تحتوي الجينات على معلومات مشفرة تؤدي إلى إنتاج البروتينات. البروتينات ، بدورها ، مسؤولة عن خلق السمات التي تميز الكائنات الحية الفردية. لذلك ، إذا تم العثور على طريقة لنقل الجينات من كائن حي إلى آخر ، فيمكن تصنيع الكائنات بسمات لم تعرضها من قبل. استنادًا إلى وصف بنية الحمض النووي التي قدمها Watson and Crick ، ​​بدأ الباحثون في البحث عن طريقة لقطع الجينات من الحمض النووي لأحد الكائنات الحية ولصقها في آخر. بحلول السبعينيات ، كان لديهم الجواب ، وولد علم الهندسة الوراثية. لقد كانت خطوة عملاقة إلى الأمام. الآن ، بعد ثلاثين عامًا فقط ، أصبح من الممكن تبادل الجينات بين نبات وآخر وبين حيوان وآخر. بل إنه من الممكن نقل الجينات بين النباتات والحيوانات. لا يوجد كائن حي & # x2014 من أشكال الحياة البدائية ، مثل البكتيريا ، إلى الحيوانات ذات الترتيب الأعلى ، مثل البشر & # x2014 معفاة من لقاء التبادل الجيني هذا. أدت الهندسة الوراثية إلى تقدم هائل في الطب والزراعة ، ولكنها أدت أيضًا إلى عاصفة من الجدل والنقاش حول القيود المفروضة على تدخل الجنس البشري في النظام الطبيعي للأشياء.


IRA FLATOW: هذا هو علم الجمعة. أنا & # 8217m إيرا فلاتو. واحدة من أقوى الأدوات التي يستخدمها علماء الأحياء اليوم ليست بعض أجهزة تسلسل الحمض النووي الجديدة. إنها ليست طابعة جينات أيضًا. في الواقع ، إنه ليس شيئًا اخترعه نحن البشر على الإطلاق.

إنه شيء استعارناه من البكتيريا ، وهو دفاع متطور عن النفس لديهم ، وآلة جزيئية تقطع الفيروسات الغازية لإيقاف العدوى. تسمى الأداة CRISPR-cas9 ، وهي تسمح للعلماء بتعديل الحمض النووي ، لتعديل الجينات أو حذفها وإضافة جينات جديدة أيضًا. يتم استخدامه بالفعل لتطوير عقاقير جديدة. وتعدد استخداماته لا يخلو من الجدل.

مثل ، هل يجب عليك استخدام كريسبر لتعديل الجينات في جنين بشري؟ هل يجب أن تستخدمه لتعديل البعوض حتى يتمكن من نقل الملاريا & # 8217t؟ الكثير من الأسئلة الكبيرة.

ولكن قبل أن نتقدم على أنفسنا ، يقول ضيفي التالي إن تقنية تعديل الجينات هذه ، حسنًا ، إنها ليست سهلة الاستخدام أو مضمونة بقدر ما هي مضمونة كما كنا نعتقد. كارميلا هاينز أستاذ مساعد في كلية الأحياء وهندسة النظم الصحية في جامعة ولاية أريزونا في تيمبي. مرحبًا بك مرة أخرى في Science Friday.

كارميلا هاينز: مرحبًا ، إيرا. من الرائع أن أكون هنا. شكرا لك.

إيرا فلاتو: مرحبًا بك & # 8217. لقد قرأنا نوعًا من التحدي حول مدى سهولة استخدام كريسبر. قال رودولف جانيش من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا اقتباسًا ، & # 8220 أي أحمق يمكنه فعل ذلك & # 8221. وقد تم اختبار ذلك & # 8217s واكتشف أن أي أحمق لا يمكنه فعل ذلك بهذه السهولة.

كارميلا هاينز: نعم ، بالتأكيد. لذلك يقضي مختبرنا الكثير من الوقت في دراسة نظام فريد لأي كائن حي يتكون أساسًا من أكثر من خلية واحدة. وبالتالي ، هناك نوع من المصيد هناك هو أن أي أحمق يمكنه فعل ذلك على افتراض أنه لا توجد حواجز أو أشياء خاصة حول كيفية التفاف الحمض النووي داخل الخلية والتي من شأنها أن تمنع كريسبر & # 8211 أعتقد نوعًا من الآلات التي تشبه المقص للدخول والوصول الفعلي إلى الجين المستهدف.

IRA FLATOW: على سبيل المثال ، في الأجنة البشرية ، هذه الخلايا ملفوفة جيدًا؟

كارميلا هاينز: نعم ، نعم. وبالتالي فإن الشيء المتعلق بآلة كريسبر هو ، أعني أنها رائعة. إنها & # 8217s جيدة جدًا في ما تفعله. ولكن على مدى ملايين السنين التي تطورت فيها & # 8217s ، عملت داخل البكتيريا في مساحة لا نرى فيها نفس الشيء ، تمامًا نفس النوع من اللف والتعبئة والتغليف للحمض النووي التي نراها في خلية مثل خلية في الإنسان الجنين.

لذا فإن الحمض النووي في الخلايا الجنينية ، على وجه الخصوص ، لديه الكثير من التفاعلات العميقة داخل النواة التي تجمع وتفصل جينات معينة بعيدًا عن بقية البيئة. لذا فإن هذا في الواقع يشكل تحديًا جزيئيًا قليلاً لآلية CRISPR من حيث الوصول إلى الهدف الذي تسعى إليه & # 8217re.

كارميلا هاينز: كلما تحدثنا & # 8211 عن تقنية "كريسبر" ، يظهر الكثير في العرض لأنها تقنية متطورة ومحفوفة بالقرارات الأخلاقية. وكلما تحدثت مع الناس من حولك ، كما يقولون ، تعلمون أن الأمر يبدو سهلاً للغاية.

لكن ما لم تسمع عنه هو الكثير من المحاولات الفاشلة لاستخدامه. الكثير من التجربة والخطأ ، وما إلى ذلك. هل توافق على ذلك؟

كارميلا هاينز: أتفق مع ذلك بالتأكيد. لذلك عندما ينشر العلماء ما يحظى بأولوية أعلى هي قصص النجاح تلك. لذلك إذا كان هناك جينًا معينًا له أهمية كبيرة في البحث الطبي ، فهناك الكثير من العمل الذي بذله & # 8217s لاختيار المكان المناسب فقط من هذا الجين الذي من خلال التجربة والخطأ ، نجد أن كريسبر جيدة جدًا في القطع. لذا فإن ما ستراه & # 8217 في الكثير من المنشورات هو أمثلة على مكان عمله.

ولكن نظرًا للطريقة التي يتم بها تنظيم المنشورات ، وثقافتنا العامة حول الإبلاغ عن النجاحات وليس الكثير من الإخفاقات ، هناك الكثير من المعلومات في مجموعة المعرفة العلمية التي تخبرنا أنها لا تعمل دائمًا كما هي. حسنًا كما نتوقعه.

IRA FLATOW: إنها & # 8217s CRISPR نفسها ، والاتصال الكامل بالبكتيريا هو فقط ، إنه رائع للغاية ، أليس كذلك؟ لقد كانت البكتيريا تقاتل هذه المعركة بالفيروسات ، فكل بكتيريا لديها فيروس يريد أن يأكلها ، وقد توصلت إلى هذه الآلية لدرءه. ثم ها نحن نوعا ما نتبناه.

كارميلا هاينز: نعم بالتأكيد. هذا جانب رائع لاستخدام النظام. أعتقد أنه عندما بدأ العلماء في اكتشاف كيفية عمل النظام ، بدأوا على الفور في التفكير في التطبيقات. هناك أشياء متشابهة في مجتمع البحث ، مثل أشياء تسمى إنزيمات التقييد المشتقة أيضًا من بكتيريا جيدة جدًا في تقطيع الحمض النووي.

لكني أعتقد أن هناك & # 8211 يتحدث عن آليات الدفاع ، وخلايا الكائنات الحية الأعلى ، كما كانت ، لديها نظام لا يعتمد بالضرورة على قطع الحمض النووي الغازي. ما تحب الخلايا مثل الخلايا البشرية فعله هو نوعًا ما بعد أن يجد الحمض النووي طريقه إلى النواة ، ما حدث في كثير من الحالات أو على الأقل لدينا الكثير من الأدلة على ذلك هو أن البروتينات الخاصة التي تتعايش مع سيأخذ الحمض النووي داخل نواة الخلية الحمض النووي ويغلفه ويلفه في بنية محكمة للغاية. حتى تتمكن تلك القطع الغازية من الحمض النووي & # 8217t من تكرار واستئصال نفسها وتتحرك وتشكل نوعًا من الفوضى في شفرتنا الجينية. لذلك تمتلك الخلايا البشرية آلية دفاعية خاصة بها ، وأعتقد أنه في المراحل الأولى من تطوير كريسبر كأداة ، لم نبدأ بعد في مواجهة هذا التحدي حتى الآن.

إيرا فلاتو: ولكن هل تعتقد أنه تحد يمكن معالجته؟

كارميلا هاينز: بالتأكيد. بعد ذلك بقليل ، منذ حوالي عامين ، كنت أنا وطالب التخرج & # 8211 ، لذا ، طالب تخرج رائع ، Renee Dare ، عملنا مع بعض الأساتذة الآخرين لبدء تدريس مقرر دراسي عن البيولوجيا التركيبية. حتى هذا المجال & # 8217s بلدي. نفكر في طرق لتجميع الأجزاء والقطع المستعارة من علم الأحياء وصنع أدوات مفيدة للغاية.

لذلك شرعنا في تطوير دورة تدريبية في مختبر كولد سبرينغ هاربور. وقررنا التركيز على تدريس تقنية كريسبر لعلماء الأحياء الاصطناعية الطموحين. لذلك جلسنا وفكرنا في كيفية إعداد هذا الدرس. وأردنا أن نجعله ممتعًا للغاية.

لذلك بدأنا في البحث في CRISPR ، وأصبح لدينا فضول للغاية & # 8211 نظرًا لأن تخصصنا في تغليف الحمض النووي وكيفية هندسة ذلك & # 8211 بدأنا نسأل أنفسنا ، كما تعلمون ، لأن كريسبر تأتي من نظام بكتيري. تطورت & # 8217s في بيئة حيث لم تتعرض حقًا لجميع آلات التغليف المعقدة هذه. ماذا لو تحدينا تقنية كريسبر بنظام مُعبأ؟

لذلك صادف أن لدينا خط خلية بشرية مستنبت هندسيًا لطيفًا للغاية نستخدمه في المختبر لفحص الأسئلة حول هندسة تغليف الحمض النووي. وما فعلناه هو أننا قمنا بتجربة بسيطة جدًا حيث قمنا بتعبئة وتغليف تسلسل مستهدف بشكل مصطنع داخل الخلايا. ثم قدم تقنية كريسبر وقياس مدى جودتها في القطع.

ووجدنا أنه في بعض الحالات ، يمكنك إلغاء قطع CRISPR تمامًا أو منعه تمامًا ، إذا كان هذا الجين المستهدف معبأ. أحد الأشياء الرائعة في نظامنا الاصطناعي هو أنه مبني حول نفس الآلية التي تستخدمها الخلايا الجذعية لإيقاف نشاط بعض الجينات التي تشارك في تحويل الخلية الجذعية إلى خلية متخصصة مثل خلية عضلية أو خلية عصبية. لذا فإن نظامنا الاصطناعي ، على الرغم من كونه مصطنعًا ، إلا أنه يتداخل. إنه يستخدم الكثير من نفس أجزاء وقطع البروتين التي تستخدمها الخلايا الجذعية لجعل جيناتها غير قابلة للوصول. نعم ، نعتقد أن اكتشافنا ، الذي نشرناه للتو في ACS Synthetic Biology ، وثيق الصلة للغاية بنوع من البحث بشكل أعمق وأكثر عمقًا في التحديات التي تواجه الاستخدام العملي لـ CRISPR كأداة.

IRA FLATOW: دعني أرى ما إذا كان بإمكاني الحصول على مكالمة هاتفية سريعة قبل أن نذهب. دعونا نذهب إلى بنما سيتي بولاية فلوريدا. ماثيو ، مرحبا بكم في ساينس فرايدي.

ماثيو: يا إلهي ، شكرًا لك ، إيرا. إذن كم عدد البلهاء الذين يستخدمون هذا حول العالم؟ للحصول على رأيي حولها ، مثل وجود مئات المختبرات ، هل هناك الآلاف من المختبرات؟

IRA FLATOW: مرحبًا ، هل هذا عادل & # 8211 شكرًا ، شكرًا على المكالمة. هل هذا سؤال عادل لطرحه يا كارميلا؟

كارميلا هاينز: حسنًا ، أعتقد أن الطريقة الصحيحة للتفكير في ذلك هي التفكير في الخطوات المتضمنة في استخدام تقنية كريسبر بنفسك. لذا فإن & # 8211 أوافق على أن التكنولوجيا نفسها يمكن الوصول إليها بسهولة ، مثل غدًا إذا قررت تغيير خطة الدرس الخاصة بي هنا في جامعة ولاية أريزونا ، يمكنني التوصل إلى ، ويمكنني تطوير برنامج تعليمي من شأنه أن يسمح للطلاب بإلقاء نظرة عامة على يتوفر تسلسل الحمض النووي البشري عبر الإنترنت على موقع ويب مثل NCBI ، وانظر إلى التسلسل. علمهم بعض القواعد الأساسية حول كيفية استهداف CRISPR لموقع ما وإعطائهم إرشادات حول كيفية تصميم CRISPR.

لذلك هذا نظام قابل للتخصيص حيث يمكنك تغيير تسلسلات النوكليوتيدات المرتبطة بآلية كريسبر لتتناسب مع الهدف الذي تريد السعي وراءه وتحريره. لذلك يمكنني بالتأكيد تعليم هؤلاء الطلاب كيفية عملها على الورق. يمكننا حتى المرور ، حسنًا ، حسنًا ، كيف يمكنك طلب الحمض النووي من شركة ، شركة تصنيع الحمض النووي لبناء أداة كريسبر المخصصة الخاصة بك؟

ولكن بعد ذلك الحاجز الضخم & # 8211 يمكنك رسم كل شيء على الورق. يمكنك تشغيل الخوارزميات للبحث عن الهدف الصحيح فقط ، ولكن عندما يتعلق الأمر بأخذ خلايا أو كائن حي فعليًا ثم التعبير عنه والحصول على ما تريد ، فهناك الكثير من الخطوات المعقدة المتضمنة. لذلك ، في حين أن CRISPR قد تكون في متناول الجميع ، ومن السهل تعلم كيفية استخدامها ، فإن تنفيذها يمثل تحديًا كبيرًا في الواقع.

IRA FLATOW: لذلك لن نرى مجموعة CRISPR المنزلية لغرفة المعيشة الخاصة بك حتى الآن. لكنك لا تعرف أبدًا متى. أجل ، بالضبط.

إيرا فلاتو: دكتور هاينز ، شكرًا لك على تخصيص بعض الوقت لتكون معنا اليوم. كارميلا هاينز أستاذ مساعد في كلية الهندسة البيولوجية والنظم الصحية في جامعة ولاية أريزونا في تيمبي ، أريزونا.


تحول الإشريكية القولونية مع البلازميد pGLO

نبذة مختصرة:
تركز هذه التجربة على الهندسة الوراثية وتحول البكتيريا. يتم تغيير خصائص البكتيريا من مصدر خارجي للسماح لها بالتعبير عن سمة جديدة ، في هذه الحالة مقاومة المضادات الحيوية. في التجربة ، يتم إدخال الحمض النووي الأجنبي في الإشريكية القولونية من أجل تغيير نمطها الظاهري. الهدف من التجربة هو تحويل الإشريكية القولونية باستخدام pGLO plasmid ، الذي يحمل جينًا لمقاومة الأمبيسلين ، وتحديد كفاءة التحول.

يتم تحويل البكتيريا عن طريق مزيج من كلوريد الكالسيوم والصدمة الحرارية. عندما يتم تحضين البكتيريا على الجليد ، يتباطأ غشاء الخلية السائلة ثم تزيد الصدمة الحرارية من نفاذية الغشاء. النتائج التي تم الحصول عليها في التجربة أظهرت أن الإشريكية القولونية التي تحولت مع pGLO كانت قادرة على مقاومة الأمبيسيلين والنمو في وجودها. تشير هذه النتائج إلى أن الكائنات الحية الدقيقة يمكن تعديلها وراثيًا لمقاومة بعض الملوثات بشكل انتقائي ، مما يعني أنه يمكن استخدامها لفائدة الإنسان لتخليص البيئة ، أو حتى جسم الإنسان ، من السموم غير المرغوب فيها.

يحدث التحول عندما يتم الحصول على الخصائص الجينية المتغيرة للبكتيريا من مصدر مختلف. تُستخدم البلازميدات في تحويل البكتيريا لأنها قطع صغيرة من الحمض النووي قادرة على التكاثر بشكل مستقل وبالتالي نقل سماتها (المفيدة غالبًا) إلى البكتيريا. الهدف من التحول الجيني في هذه التجربة هو حصول بكتيريا Escherichia coli على مقاومة المضادات الحيوية للأمبيسيلين ، والتي يمكن ملاحظتها جسديًا عندما تعبر البكتيريا عن الجين المراسل Green Fluorescent Protein (GFP) لأن البكتيريا المحولة ستتوهج باللون الأخضر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية عندما تكون في وجود أرابينوز. تم العثور على جين GFP بشكل طبيعي في قناديل البحر ذات الإضاءة الحيوية ، مما يسمح لها بالتوهج في الظلام. يحتوي البلازميد المستخدم في تحويل البكتيريا على مقاومة المضادات الحيوية جنبًا إلى جنب مع الجين الذي يرمز للبروتين الفلوري.

الهدف من هذه التجربة هو الهندسة الوراثية للإشريكية القولونية المقاومة للأمبيسيلين عن طريق تحويلها ببلازميد يحتوي على جين مقاوم للمضادات الحيوية وجين يرمز لـ GFP ولحساب كفاءة التحول. سيؤدي هذا إلى تغيير النمط الظاهري عن طريق إدخال DNA غريب. هذه التجربة مهمة لأنها توضح تقنية لها تطبيقات عملية في مجالات مثل الاهتمامات البيئية. يمكن للبكتيريا التي تم تعديلها وراثيًا الحصول على سمات تسمح باستخدامها لتحطيم المركبات السامة (أي الانسكاب النفطي) لتقليل كمية المواد الضارة الموجودة في التربة والمياه (Spilios ، 2013). بعض الملوثات البيئية هي في الواقع سامة للكائنات الحية الدقيقة ، مثل البكتيريا ، وتعطل الخلايا مما يلغي قدرتها على تفكيك الملوثات (Pieper ، 2000). لهذا السبب ، فإن البكتيريا المقاومة لسموم معينة هي الأفضل ، وسيكون من المرغوب فيه تكرار الحمض النووي الخاص بها - وهو جين المقاومة على وجه التحديد - واستخدامه لخلق مثل هذه المقاومة في الكائنات الحية الأخرى. يبني هذا البحث مباشرة من المعرفة المستخدمة في هذه التجربة حول تحويل الإشريكية القولونية.

فرضيات هذه التجربة هي أن البكتيريا ستتحول بواسطة البلازميد لتطوير مقاومة للمضادات الحيوية وستنمو على الرغم من وجود الأمبيسلين. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يضاف سكر أرابينوز إلى سلالة البكتيريا التي تحولها البلازميد ، فإنه سيعبر عن GFP ويتوهج باللون الأخضر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

تم إجراء طرق وإجراءات تحويل البكتيريا في هذه التجربة وفقًا لـ Spilios (2013). تم تحويل سلالات بكتيريا الإشريكية القولونية وراثيًا باستخدام البلازميد لتحمل مقاومة الأمبيسلين. تم ضخ 250 ميكرولتر من محلول تحويل CaCl2 في أنابيب اختبار مغلقة ، والتي تم وضعها بعد ذلك على الجليد. لوحظ وجود صفيحة بادئ بها مستعمرات E. coli وتم نقل مستعمرتين إلى أنابيب CaCl2 ، مستعمرة واحدة في كل منهما ، وتشتت بالتساوي في جميع أنحاء المحلول عن طريق الخلط. ثم تم وضع الأنابيب مرة أخرى على الجليد. ثم تمت إضافة عشرة نانوجرام من محلول pGLO DNA إلى أحد الأنابيب وحضنت الأنابيب على
ثلج لمدة عشر دقائق. أثناء فترة الحضانة ، تم الحصول على أربعة أطباق من أجار LB المغذي ، أحدها يحتوي على LB فقط ، واثنان أيضًا من الأمبيسلين ، وواحد أيضًا من الأمبيسلين والأرابينوز. تم تحضين أنابيب الاختبار بعد عشر دقائق لمدة 50 ثانية في حمام مائي 42 درجة مئوية ثم عاد إلى الجليد لمدة دقيقتين أخريين. تمت إزالة الأنابيب بعد ذلك من الجليد وأضيف 250 ميكرولتر من مرق المغذيات LB إلى كل أنبوب ، والذي تم تحضينه بعد ذلك لمدة عشر دقائق إضافية عند درجة حرارة الغرفة. تمت إضافة 100 ميكرولتر من المحلول الموجود في الأنبوب المحتوي على pGLO إلى لوح واحد باستخدام أجار LB فقط والأمبيسلين وإلى اللوحة التي تحتوي على الأمبيسلين والأرابينوز. تمت إضافة 100 ميكرولتر من المحلول في الأنبوب بدون pGLO إلى اللوحة الأخرى المحتوية على LB والأمبيسلين وكذلك إلى اللوحة التي تحتوي على LB فقط. تم نشر المحلول حول سطح كل أجار باستخدام حلقة معقمة جديدة لكل لوح. تم تحضين الأطباق بعد ذلك عند 37 درجة مئوية وتم ملاحظة النتائج وتسجيلها بعد 27 ساعة.

النتائج:
طبق
ملاحظات
نمو
"+ pGLO LB / أمبير"
لا تزال المستعمرات الصفراء صفراء تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية
نعم
"+ pGLO LB / amp / ara"
تتوهج المستعمرات الصفراء باللون الأخضر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية
نعم
الجدول 1. توضح اللوحات المتحولة بعد الحضانة أنه كان هناك نمو للبكتيريا المحولة وخصائصها التي يمكن ملاحظتها.

طبق
ملاحظات
نمو
"-pGLO LB / أمبير"
لا شيئ
لا
"-pGLO LB"
لا تزال المستعمرات الصفراء صفراء تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية
نعم
الجدول 2. لوحات التحكم بعد الحضانة توضح ما إذا كان هناك نمو للإشريكية القولونية بدون وجود pGLO البلازميد بعد التعرض للأمبيسيلين.

أظهرت البكتيريا المحولة نموًا على الرغم من وجود الأمبيسلين (الجدول 1) ، بينما لم تظهر لوحة التحكم مع الأمبيسلين أي نمو ، وأظهرت لوحة التحكم التي تحتوي على أجار LB فقط تكوين عشب من البكتيريا (الجدول 2). اختلفت البكتيريا المحولة على الصفيحة مع LB و ampicillin و arabinose عن اللوح المحول بدون أرابينوز في أنها تتوهج باللون الأخضر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. حافظت البكتيريا التي لا تحتوي على نبات الأرابينوز على مظهر ثابت تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. كانت كفاءة التحويل للبكتيريا المحولة 5.2 × 104 محولات لكل ميكروجرام من الحمض النووي.

نقاش:
في هذه التجربة كان الهدف هو تحويل E. coli مع pGLO plasmid وحساب كفاءة التحويل. كانت الفرضيات هي أن الصفيحة التي تحتوي على أجار LB فقط والإشريكية القولونية غير المحولة ستنمي حشيشًا ، فإن لوحة التحكم للبكتيريا غير المحولة مع LB والأمبيسيلين لن تشهد أي نمو للوحة المحولة باستخدام LB فقط والأمبيسيلين ستنمو مستعمرات من البكتيريا ولكنها لن تنمو. يتوهج باللون الأخضر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية وستنمو الصفيحة المحولة التي تحتوي على LB والأمبيسيلين والأرابينوز مستعمرات تتوهج باللون الأخضر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. النتائج التي تم العثور عليها تدعم كل من هذه الفرضيات مع نمو البكتيريا كما هو متوقع. نمت البكتيريا غير المحولة على صفيحة LB بسرعة حيث لم يتم تثبيط أي منها بواسطة الأمبيسلين ، لكنها لم تنمو عند تعرضها للأمبيسيلين على لوحة التحكم الأخرى لأنها لا تحتوي على الجين الخاص بمقاومة المضادات الحيوية. تحمل كل من الصفائح المحولة الجين لمقاومة الأمبيسيلين من البلازميد pGLO ، لذلك كانا قادرين على تنمية مستعمرات كانت من نسل الإشريكية القولونية المحولة وراثيًا. الصفيحة التي تحتوي أيضًا على الأرابينوز نمت مستعمرات البكتيريا التي تحتوي على الجين الذي لا يقاوم الأمبيسيلين فحسب ، بل يعبر أيضًا عن GFP ويتسبب في توهج البكتيريا باللون الأخضر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. أوبرا أرابينوز في الإشريكية القولونية هو أ
مجموعة من الجينات التي لن تصبح نشطة إلا عند وجود سكر أرابينوز (Spilios ، 2013). يتم نسخ الجينات وترجمتها لتحطيم الأرابينوز للحصول على الطاقة. يمكن تشغيل أو إيقاف التعبير عن الإنزيمات التي تكسر الأرابينوز. في بلازميد pGLO ، استبدل جين GFP الجينات التي ترمز لتفكك أرابينوز. في هذه التجربة ، عمل الأرابينوز المضاف على أنه "مفتاح التشغيل" لجعل العامل ينتج GFP. كانت كفاءة التحويل المحسوبة للنتائج 5.2 × 104 خلية محولة لكل ميكروجرام من الحمض النووي المستخدم. هذا خجول قليلاً من كفاءة التحويل القياسية في الأبحاث القياسية المنشورة. تشير تجربة هاناهان (1983) إلى أنه تحسن في مستويات الكفاءة التي لوحظت في الظروف القياسية بمقدار 100 إلى 1000 ضعف مع كفاءة مُبلغ عنها تبلغ 5 × 108 محولات لكل ميكروجرام من البلازميد. لا يكون لنمو النوع أو وسط المغذيات تأثير كبير على كفاءة التحول ، لكن التركيز على المكونات التي تزيد من معدل النمو في الوسائط تميل إلى المساعدة في التحول (هاناهان ، 1983). لذلك ، قد يكون من المفيد دمج وسط نمو بتركيزات أعلى من Mg2 + في التصميم التجريبي لتحقيق كفاءة تحويل أعلى قليلاً. قد تركز التجارب المستقبلية على العمل على زيادة كفاءة التحول للإشريكية القولونية (تشونج ، 1989). يمكن أن يساعد ذلك في تقليل التكاليف وزيادة الموثوقية لاستبدال الأساليب الحالية. كما ذكرنا سابقًا ، فإن تطوير معرفة عملية وفهم للهندسة الوراثية يساعد في معالجة المخاوف البيئية والصحية. يمكن استخدام الكائنات الدقيقة لاستهداف ملوثات أو سموم معينة في البيئة أو في جسم الإنسان.

الآداب المذكورة:
تشونغ سي تي. 1989. التحضير بخطوة واحدة للإشريكية القولونية المختصة: تحويل الخلايا البكتيرية وتخزينها في نفس المحلول. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية ، 86: 2172-2175.

هاناهان د. 1983. دراسات حول تحول الإشريكية القولونية مع البلازميدات. مجلة البيولوجيا الجزيئية ، 166: 557-580.

Pieper DH. 2000. هندسة البكتيريا للمعالجة الحيوية. الرأي الحالي في
التكنولوجيا الحيوية ، 11.3: 262-270.

Spilios K (محرر). 2013. مبادئ علم الأحياء ، II. هايدن مكنيل للنشر ، بليموث ، ميتشيغن. الوحدة رقم 6 ، ص 119-127.


لماذا لا يمكننا استخدام البلازميدات لإضافة جينات لأنفسنا؟ - مادة الاحياء

الشعور بالكآبة؟ هذه البكتيريا هي أيضًا & ndash وهذا يجعلنا المستنسخين الجزيئي نشعر باللون الأزرق لأنه يعني أن جيننا لم يدخل إلى القطعة الدائرية من الحمض النووي التي تسمى البلازميد والتي نضعها هناك ، لذلك يمكن للبكتيريا أن تصنع نسخًا من الجين لنا. لكن الخبر السار هو أن نظام الفرز الأزرق والأبيض يجعل من السهل معرفة & ndash حتى نتمكن من تجنب اللون الأزرق وبدلاً من ذلك نختار مستعمرة بيضاء ، حيث سارت عملية الاستنساخ الجزيئي بشكل جيد!

نظرة عامة في القافية ، ثم إنها & rsquos تفاصيل الوقت! إذا كان ناقل البلازميد يخترق الإدخال ، فإن البروتين الذي يصنع اللون الأزرق تفتقر البكتيريا! يحتوي البلازميد على التسلسل الذي تحتاجه البكتيريا ، لكنك لن تعرف هذا إذا نجح الاستنساخ. عندما تقوم بإدخال الجين ، فإن هذا التسلسل تكسر البروتين الوظيفي الذي لا تصنعه البكتيريا أبدًا. إذا كانت المستعمرة & rsquos white قد سارت الأمور على ما يرام ، ولكن إذا كانت المستعمرة & rsquos زرقاء ، فأنت بحاجة إلى إعادة

كل نقطة على هذه اللوحة عبارة عن كتلة من البكتيريا المتطابقة وراثيًا ، والتي نسميها مستعمرة. إنهم متطابقون وراثيًا لأن البكتيريا تتكاثر عن طريق مضاعفة أحواها الداخلية (بما في ذلك حمضها النووي) ثم الانقسام إلى نصفين ، مع إعطاء مجموعة كاملة من كل شيء لكل خلية ابنة.

بالإضافة إلى الحمض النووي الخاص بها ، تحتوي هذه البكتيريا على & ldquoextra & rdquo قطعة دائرية من الحمض النووي تسمى البلازميد. أعلم أن هذه البكتيريا تحتوي على البلازميد الذي أريده لأن البلازميد يحتوي على جينات مقاومة للمضادات الحيوية تسمح له بالبقاء على قيد الحياة على الرغم من أنني قمت بتدوير الطعام البكتيري (الوسائط) بالمضادات الحيوية المقابلة. هذا شكل من أشكال التحديد و ndash فقط البكتيريا التي بداخلها البلازميد يمكن أن تنمو على هذه الصفائح.

ولكن ، بصرف النظر عن السماح بالاختيار ضد البكتيريا العشوائية التي تحاول النمو على أطباقنا ، فإن البلازميد موجود بالفعل للعمل كمركبة ، أو ناقل ، للسماح لنا بإدخال & ldquoany & rdquo الجين الذي نريده في البكتيريا & ndash ، على سبيل المثال ، يمكنهم عمل نسخ كثيرة منه لنا. نظرًا لأننا & rsquore نعيد تجميع أجزاء من الحمض النووي عندما نقوم بعمل مجموعة المتجهات / الإدخال ، شكلاً من أشكال RECOMBINANT DNA. وبما أن البكتيريا تصنع الكثير من النسخ منها ، وعندما تنقسم كل خلية ابنة هي استنساخ جيني للخلية الأم ، فإننا نطلق على هذه العملية العامة الاستنساخ الجزيئي.

الجوهر الأساسي للاستنساخ الجزيئي هو: لصق الجين الذي تريد دراسته في قطعة دائرية من الحمض النووي تسمى ناقل البلازميد & amp ؛ لصق هذا البلازميد في البكتيريا لإنتاج المزيد من هذا الجين & amp / أو البروتين الذي يرمز إليه (ممكن لأن الجيني الكود عالمي لذا يمكن لأي كائن حي قراءته). إنها أداة قوية أحدثت ثورة في البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية أمبير. لكنها لا تعمل دائمًا بشكل صحيح ، لذلك نحتاج إلى التحقق من ذلك

  1. لقد استوعبت البكتيريا بالفعل البلازميد AND
  2. تم إدخال الجين الخاص بنا بالفعل في البلازميد

يمكننا استخدام علامات التحديد مثل جينات مقاومة المضادات الحيوية للتحقق من وجود البلازميد (1) على سبيل المثال إذا كان البلازميد يحتوي على جين مقاوم للأمبيسيلين (Amp) ولكن البكتيريا المضيفة لا تستطيع أن تنمو ، فإن البكتيريا التي تحتوي على البلازميد هي وحدها التي يمكن أن تنمو بوجود Amp ، لذا فإن أي مستعمرات من البكتيريا تنمو لديها البلازميد. ولكن هل يحتوي هذا البلازميد على الجين الخاص بك فيه (2)؟ ما زلت لا تعرف ، ولكن هناك عدة طرق لمعرفة ذلك.

هناك خياران نظرنا فيهما و rsquove وهما: DIAGNOSTIC DIGEST (المعروف أيضًا باسم الملخص التحليلي) http://bit.ly/30Npa8o وأمبير COLONY PCR http://bit.ly/39cADmK. هذه إما CUT (في الملخص) أو نسخ قطع (في PCR) البلازميد بشكل مختلف إذا كان الجين الخاص بك موجودًا أو غائبًا وهذا يمنحك قطعًا مختلفة من الحمض النووي. من أجل رؤية هذه القطع ، عليك فصلها حسب الحجم باستخدام الاغاروز الكهربائي للهلام. ومن أجل الهضم ، يجب عليك تنقية الحمض النووي البلازميدي قبل أن تتمكن من اختباره. لذلك ، بينما تعمل هذه الأساليب (في الغالب) ، يمكن أن تستغرق بعض الوقت.

فحص الأزرق والأبيض (غربال أبيض وأسود) هو وسيلة للتحقق من وجود ملحق دون الحاجة إلى لمس المستعمرات! عليك أن تنظر فحسب!

يستخدم بروتين يسمى BETA-GALACTOSIDASE (B-gal) ، وهو إنزيم يحفز (يسرع) التحلل المائي (تفكيك قائم على الماء) من اللاكتوز (ثنائي السكاريد (وحدتا سكر مرتبطتان)) في السكريات الأحادية (فرد) وحدات السكر) الجلوكوز و الجلاكتوز. يسمى GENE for B-gal lacZ.

يعمل B-gal كمقياس homotetramer (4 نسخ متطابقة ملتصقة ببعضها البعض). أولاً ، تقوم بتكوين ثنائيات (أزواج) وأمبير ثم تلك الأزواج لتشكيل رباعي الأبعاد. أنت بحاجة إلى جميع الأجزاء الأربعة لأن أجزاء من النسخ المختلفة & ldquocross over & rdquo للمساهمة في & ldquoactive sites & rdquo حيث يحدث الأداء

يحدث هذا الاقتران الزوجي (dimer to tetramer) باستخدام الجزء الأول من البروتين (N-terminus). إذا قمت بإزالة هذا الجزء ، فلا يزال من الممكن تشكيل الثنائيات ، ولكن يمكن أن تتشكل tetramers ، لذلك يمكن تصنيع البروتين الوظيفي و rsquot. ولكن يمكنك استعادة هذه البداية ، عن طريق إضافة الجزء المطلوب ، ألفا (أ) الببتيد ، والظهر و ldquoin TRANS & rdquo (كجزيء منفصل). يُعرف هذا باسم التكملة.

في B-W SCREENING ، تستخدم خلايا مضيفة بكتيرية تحتوي على B-gal (LacZ & Deltam15) المختصرة التي تفتقد بعض البروتين و rsquos أول 41 حمض أميني و ldquoletters و rdquo (11 و mdash41). (& دلتا هي الحرف اليوناني & ldquodelta & rdquo ، وفي مصطلحات البروتين / الجينات ، غالبًا ما تستخدم & rsquos للإشارة إلى الأجزاء المفقودة). يفتقد هذان LacZ & Deltam15 إلى الجزء N-terminus ولا يحتويان إلا على & ldquoleftover & rdquo & omega-fragment التي يمكن أن تشكل tetramers.

لجعلها تشكل رباعي الأبعاد ، فإنها تحتاج إلى تلك الأحرف الأولى & ldquo & alpha-peptide & rdquo & ndash & amp ؛ البلازميد الذي يقدمه في trans (طريقة plasmid & rsquos لدفع الإيجار؟). لذلك أنت بحاجة لكليهما من أجل تكوين B-gal. ولكن كيف تعرف ما إذا كان B-gal مصنوع بالفعل؟

منتجات B-gal & rsquos المعتادة (الجلوكوز وأمبير الجالاكتوز) Aren & rsquot ملونة ، لذلك يمكننا رؤيتها. لكن B-gal يهتم في الغالب بجزء الجالاكتوز ولا يكون من الصعب إرضاءه كثيرًا بشأن ما هو & rsquos على الجانب الآخر من رابطة الجليكوسيد. لذلك يمكننا استبدال الجلوكوز بشيء يمنحنا منتجًا يمكننا رؤيته.

يحتوي X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) على جالاكتوز متصل بـ 5-برومو-4-كلورو -3 هيدروكسي إندول. & beta-gal يقسمه إلى جالاكتوز وأمبير 5-برومو-4-كلورو -3-هيدروكسي إندول الذي يقسم (أزواج لأعلى) ويتأكسد إلى 5،5 & ثنائي برومو -4،4 & ثنائي كلورو-نيلي وهو غير قابل للذوبان وأزرق أمبير! لذلك تحولت المستعمرة إلى اللون الأزرق.

هذا لا يبدو مفيدًا للغاية على الرغم من أننا نريد فقط أن ننمي مستعمرات بالبلازميد في المقام الأول ، وهذا هو السبب في أن البلازميد لدينا أيضًا لديه علامة اختيار في شكل جين مقاوم للمضادات الحيوية. لذا فإن مجرد تحول المستعمرات المحتوية على البلازميد إلى اللون الأزرق سيكون زائداً عن الحاجة & ndash it & rsquod أخبرنا بما نعرفه بالفعل & ndash the plasmid & rsquos هناك.

القوة الحقيقية للفرز الأبيض والأزرق تجعلها ليست زرقاء. للقيام بذلك ، تستخدم البلازميدات المصممة ليكون لها موقع استنساخ متعدد (MCS) (المكان الذي تضعه في الجين الخاص بك) داخل جين الببتيد ألفا. بهذه الطريقة ، يؤدي إدخال الجين الخاص بك إلى مقاطعة جين & alpha-peptides & rsquos ، لذلك يمكن للبكتيريا أن تجعل & rsquot وظيفية & amp ؛ alpha-peptide - & gt لم تعد قادرة على إكمال & جزء أوميغا - & gt can & rsquot تجعل B-gal وظيفي - & gt يمكن & rsquot صنع منتج أزرق من X-gal - & gt مستعمرة بيضاء

  • تحتوي المستعمرات البيضاء على ملحق (في المكان المناسب)
  • BLUE COLONIES لا يتم إدخالها في & rsquot أو تضعها في المكان الخطأ

& # 9888 & # 65039 البياض يشير إلى أنه تم إدخال شيء ما. لكنك لا تعرف أن هذا الشيء هو الشيء الذي تريده - يجب عليك و rsquod ترتيب تسلسله للتأكد

بالطبع ، لا يعمل هذا الفحص بالأبيض والأسود إلا إذا تم تصنيع & beta-gal! & bacteria don&rsquot want to waste time & resources making &beta-gal if they can&rsquot use it &ndash so we have to trick them into using it

When lactose isn&rsquot around, a REPRESSOR protein sits on & &ldquohides&rdquo the part of the &beta-gall gene (lacZ) where the DNA-to-RNA copier RNA POLYMERASE (RNA Pol) binds to start making an mRNA copy of the gene that can then get read by ribosomes and translated into the protein. So, NO lactose -> no &beta-gal mRNA made -> no &beta-gal made (not even the monomers&hellip)

BUT when lactose is present, B-gal &ldquomoonlights&rdquo as a transglycosylator &ndash it converts lactose into ALLOLACTOSE by changing the glycosidic linkage site between the glucose & galactose units (just shifts things around a little to give you an isomer of lactose &ndash same atoms, different linking). Allolactose binds the repressor causing the repressor to change shape (undergo a conformational change) & fall off -> RNA Pol binds -> &beta-gal mRNA made -> &beta-gal made

So you&rsquod think, why not just add some lactose, or allolactose if we want to do B-W screening? Problem is, &beta-gal can also hydrolyze (split) our de-repressor allolactose. So, we&rsquod have to constantly add more if we wanted to have continuous &beta-gal making. So, instead, we trick the bacteria by using IPTG Isopropyl (&beta-D-1-thiogalactopyranoside). This is an allolactose analog (mimic) that can also de-repress the lac promoter, so &beta-gal is made. BUT unlike lactose it doesn&rsquot get hydrolyzed b y&beta-gal, so it sticks around.

note: if you move the lac promoter in front of a gene for something else, you can use IPTG to trick the bacteria into making that something else on cue. we looked at such &ldquoinduction&rdquo in yesterday&rsquos post on recombinant protein expression in bacteria: http://bit.ly/3cPVhLO

So, in practice, it works something like this.

  1. put your gene in the plasmid. (molecular cloning step)
  2. put the plasmid in the bacteria (transformation step)
  3. plate the bacteria on an agar plate (you&rsquore classic &ldquoPetri dish&rdquo w/food, antibiotic, IPTG, & X-gal
  4. stick it in a nice warm incubator
  5. wait for the bacteria to grow
  6. wait for blue color to show

If you come back the next day & all your colonies are white, don&rsquot get too excited yet &ndash It takes a while (16-20h) for &beta-gal to be expressed (remember it has to get de-repressed & everything first) & get to work. So the blue starts showing up gradually. Sometimes it&rsquos hard to tell early on, but the more you work w/this system, the more of a &ldquosense&rdquo you get for it. The white ones usually look kinda &ldquodifferent&rdquo &ndash they grow bigger & look &ldquogoopier&rdquo

If you come back the next next day & all the colonies are still white, definitely don&rsquot get excited &ndash get suspicious, because cloning is rarely that efficient. Did you forget the IPTG? the X-gal?

note: X-gal is the &ldquoclassic&rdquo chromogenic (color-producing) B-gal substrate, but you can change up that indoxyl part to change the absorbance and therefore the color you see. Our lab uses Bluo-gal, which is really similar but doesn&rsquot have the chlorine . This gives a darker blue product that&rsquos easier to see. You can also do things like move the Cl to a different position to get Magenta-gal (5-bromo-6-chloro-3-indolyl-&beta-D-galactopyranoside). Remove the Br from that and you get the more salmon-colored (thus aptly named) Salmon-gal (S-gal, 6-chloro-3-indolyl-&beta-D-galactopyranoside). The color differences come from the different molecular arrangements absorbing different wavelengths of light. And if you want to know more: http://bit.ly/2RDLVY4

Technical terminology talk time: Color chemistry-ly speaking, &ldquoDYE&rdquo is usually used for *soluble* colored things whereas &ldquoPIGMENT&rdquo implies *nonsoluble*. Since X-gal&rsquos product is insoluble, it&rsquod technically be a *pigment* not a *dye* but in biology, we tend to use the terms interchangeably

Technical terminology talk time 2: B-W is a form of SCREENING as opposed to SELECTION. SELECTION (like w/antibiotic resistance gene) does all the work for you (all the products are &ldquogood&rdquo in the aspect you selected for) BUT w/a screen you have to do some work (even if it&rsquos just looking) &ndash the &ldquoduds&rdquo are still there, they&rsquore just easier to see.

It&rsquos like you&rsquore looking to hire some people &ndash with screening, you go through all the apps & separate them into yes/no piles but keep both for someone else to deal with. With selection, you toss the no pile, so the next person only sees the yeses.

Now for a couple caveats: Firstly, screening isn&rsquot always yes/no. You can have &ldquomaybes&rdquo like if you&rsquore screening for drugs that might work for something & some work really well, some don&rsquot work at all, but some are &ldquopotentials&rdquo

Secondly, only certain bacterial hosts & plasmids are designed for blue-white screening. Some that are:


Geographic Isolation Drives Evolution Of Hot Springs Microbe

Sulfolobus islandicus, a microbe that can live in boiling acid, is offering up its secrets to researchers hardy enough to capture it from the volcanic hot springs where it thrives. In a new study, researchers report that populations of S. islandicus are more diverse than previously thought, and that their diversity is driven largely by geographic isolation.

The findings open a new window on microbial evolution, demonstrating for the first time that geography can trump other factors that influence the makeup of genes an organism hosts.

S. islandicus belongs to the archaea, a group of single-celled organisms that live in a variety of habitats including some of the most forbidding environments on the planet. Once lumped together with bacteria, archaea are now classified as a separate domain of life.

"Archaea are really different from bacteria &ndash as different from bacteria as we are," said University of Illinois microbiology professor Rachel Whitaker, who led the study.

Whitaker has spent almost a decade studying the genetic characteristics of S. islandicus. The new study, in the وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم, compares three populations of S. islandicus, from hot springs in Yellowstone National Park, Lassen National Park in California and the Mutnovsky Volcano on the Kamchatka Peninsula, in eastern Russia.

The extreme physical needs of S. islandicus make it an ideal organism for studying the impact of geographic isolation. It can live only at temperatures that approach the boiling point of water and in an environment that has the pH of battery acid. It breathes oxygen, eats volcanic gases and expels sulfuric acid. It is unlikely that it can survive even a short distance from the hot springs where it is found.

By comparing the genetic characteristics of individuals from each of the three locations, Whitaker and her colleagues were able to see how each of the S. islandicus populations had evolved since they were isolated from one another more than 900,000 years ago.

The complete genetic package, or genome, of S. islandicus contains a set of core genes that are shared among all members of this group, with some minor differences in the sequence of nucleotides that spell out individual genes. But it also contains a variable genome, with groups of genes that differ &ndash sometimes dramatically &ndash from one subset, or strain, to another.

Whitaker's team found that the variable genome in individual strains of S. islandicus is evolving at a rapid rate, with high levels of variation even between two or three individuals in the same location.

"Some people think that these variable genes are the way that microbes are adapting to new environments," Whitaker said. "You land in a new place, you need a new function in that new place, you pick up that set of genes from whoever's there or we don't know who from, and now you can survive there. We have shown that does not occur."

"This tells you that there's a lot more diversity than we thought," Whitaker said. "Each hot spring region has its own genome and its own genome components and is evolving in its own unique way. And if each place is evolving in its own unique way, then each one is different and there's this amazing diversity. I mean, beetles are nothing compared to the diversity of microbes."

Archaea, like bacteria, can transfer genes to one another, but they also obtain new genes from free-floating genetic elements, called plasmids, or from viruses that infect the cells and insert their own genes into the archaeal DNA. What did vary in the genomes of S. islandicus could be traced back to plasmids and viruses, Whitaker said. There were also a lot of lost genes, with much variation in the genes lost between the strains.

"Most of the genes that are coming and going, at least on Sulfolobus, seem to be on viruses and plasmids," Whitaker said. The researchers found that about one-third of the variable genes were specific to a geographic location. The viruses and plasmids that had lent their genes to Sulfolobus in one site were different from those found in another. Also, much of the variation was found in genes devoted to the microbe's immune system, indicating that S. islandicus is evolving largely in response to the assault of local pathogens such as viruses.

These findings challenge the idea that microbes draw whatever they may need from a near-universal pool of available genetic material, Whitaker said. It appears instead that S. islandicus, at least, acquires new genes from a very limited genetic reservoir stored in viruses and other genetic elements that are constrained to each geographic location on Earth.


To Sing Fung and Ding Xiang Liu
Vol. 73, 2019

الملخص

Human coronavirus (HCoV) infection causes respiratory diseases with mild to severe outcomes. In the last 15 years, we have witnessed the emergence of two zoonotic, highly pathogenic HCoVs: severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) and . اقرأ أكثر

Figure 1: Taxonomy of HCoVs: the updated classification scheme of HCoV and other coronaviruses. The six known HCoVs are in blue. Abbreviations: BtCoV, bat coronavirus BuCoV, bulbul coronavirus HCoV.

Figure 2: Genome structure of human coronaviruses (HCoVs). Schematic diagram showing the genome structure of six known HCoVs (not to scale). The 5′-cap structure (5′-C) and 3′-polyadenylation (AnAOH-3.

Figure 3: Replication cycle of human coronaviruses (HCoVs). Schematic diagram showing the general replication cycle of HCoVs. Infection starts with the attachment of HCoVs to the cognate cellular rece.

Figure 4: Induction and modulation of autophagy by HCoV infection. Schematic diagram showing the signaling pathway of autophagy and the modulatory mechanisms utilized by HCoV. Viruses and viral compon.

Figure 5: Apoptosis induced by HCoV infection and modulatory mechanisms. Schematic diagram showing the signaling pathway of intrinsic and extrinsic apoptosis induction and the modulatory mechanisms ut.

Figure 6: Induction and modulation of unfolded protein response by HCoV infection. Schematic diagram showing the three branches of UPR signaling pathway activated and regulated by HCoV infection. Viru.

Figure 7: Activation and modulation of MAPK signaling pathways by HCoV infection. Schematic diagram showing the activation and modulation of MAPK signaling pathway by HCoV infection. Viruses and viral.

Figure 8: Type I interferon induction and signaling during HCoV infection and modulatory mechanisms. Schematic diagram showing the induction and signaling pathways of type I interferon during HCoV inf.


Cloning DNA into a vector, step by step

To introduce foreign DNA into a circular vector, scientists carry out a three-step process:

Scientists first remove their gene of interest from the DNA sequences on either side of it. They can use restriction enzymes to do the cutting. These enzymes, which came originally from bacteria, cut DNA at specific sites in the sequence. If there’s not enough DNA for successful cutting or no suitable restriction enzyme recognition sites around the gene, scientists first use polymerase chain reaction (PCR) to make many more copies. By designing their PCR primers carefully, they can introduce new restriction sites on either side of the copied DNA sequence.

Opening up the vector

Next, scientists make a cut in the circular DNA sequence of the vector. They use the same restriction enzymes as they used to cut out the gene in step 1. This turns the vector into a linear molecule and makes it ready to accept the new piece of DNA.

Sticking the vector and the gene together

The final step in cloning is to incorporate the DNA of interest into the vector. Scientists mix the gene and the opened vector together with a bacterial enzyme called DNA ligase . The ligase sticks DNA ends together to form a single circular molecule that includes both the vector and the gene.

Find out more in these articles:


How the DNA Revolution Is Changing Us

The ability to quickly alter the code of life has given us unprecedented power over the natural world. Should we use it?

If you took a glance around Anthony James’s office, it wouldn’t be hard to guess what he does for a living. The walls are covered with drawings of mosquitoes. Mosquito books line the shelves.

Hanging next to his desk is a banner with renderings of one particular species—Aedes aegypti—in every stage of development, from egg to pupa to fully grown, enlarged to sizes that would even make fans of حديقة جراسيك blanch. His license plates have a single word on them: AEDES.

“I have been obsessed with mosquitoes for 30 years,” says James, a molecular geneticist at the University of California, Irvine.

There are approximately 3,500 species of mosquito, but James pays attention to just a few, each of which ranks among the deadliest creatures on Earth. يشملوا Anopheles gambiae, which transmits the malaria parasite that kills hundreds of thousands of people each year. For much of his career, however, James has focused on Aedes. Historians believe the mosquito arrived in the New World on slave ships from Africa in the 17th century, bringing with it yellow fever, which has killed millions of people. Today the mosquito also carries dengue fever, which infects as many as 400 million people a year, as well as such increasingly threatening pathogens as chikungunya, West Nile virus, and Zika.

In a widening outbreak that began last year in Brazil, Zika appears to have caused a variety of neurological disorders, including a rare defect called microcephaly, where babies are born with abnormally small heads and underdeveloped brains.

The goal of James’s lab, and of his career, has been to find a way to manipulate mosquito genes so that the insects can no longer spread such diseases. Until recently, it has been a long, lonely, and largely theoretical road. But by combining a revolutionary new technology called CRISPR-Cas9 with a natural system known as a gene drive, theory is rapidly becoming reality.

CRISPR places an entirely new kind of power into human hands. For the first time, scientists can quickly and precisely alter, delete, and rearrange the DNA of nearly any living organism, including us. In the past three years, the technology has transformed biology. Working with animal models, researchers in laboratories around the world have already used CRISPR to correct major genetic flaws, including the mutations responsible for muscular dystrophy, cystic fibrosis, and one form of hepatitis. Recently several teams have deployed CRISPR in an attempt to eliminate HIV from the DNA of human cells. The results have been only partially successful, but many scientists remain convinced that the technology may contribute to a cure for AIDS.

In experiments, scientists have also used CRISPR to rid pigs of the viruses that prevent their organs from being transplanted into humans. Ecologists are exploring ways for the technology to help protect endangered species. Moreover, plant biologists, working with a wide variety of crops, have embarked on efforts to delete genes that attract pests. That way, by relying on biology rather than on chemicals, CRISPR could help reduce our dependence on toxic pesticides.

No scientific discovery of the past century holds more promise—or raises more troubling ethical questions. Most provocatively, if CRISPR were used to edit a human embryo’s germ line—cells that contain genetic material that can be inherited by the next generation—either to correct a genetic flaw or to enhance a desired trait, the change would then pass to that person’s children, and their children, in perpetuity. The full implications of changes that profound are difficult, if not impossible, to foresee.

“This is a remarkable technology, with many great uses. But if you are going to do anything as fateful as rewriting the germ line, you’d better be able to tell me there is a strong reason to do it,” said Eric Lander, who is director of the Broad Institute of Harvard and MIT and who served as leader of the Human Genome Project. “And you’d better be able to say that society made a choice to do this—that unless there’s broad agreement, it is not going to happen.”

No discovery of the past century holds more promise—or raises more troubling ethical questions.

“Scientists do not have standing to answer these questions,” Lander told me. “And I am not sure who does.”

CRISPR-Cas9 has two components. The first is an enzyme—Cas9—that functions as a cellular scalpel to cut DNA. (In nature, bacteria use it to sever and disarm the genetic code of invading viruses.) The other consists of an RNA guide that leads the scalpel to the precise nucleotides—the chemical letters of DNA—it has been sent to cut. (Researchers rarely include the term “Cas9” in conversation, or the inelegant terminology that CRISPR stands for: “clustered regularly interspaced short palindromic repeats.”)

The guide’s accuracy is uncanny scientists can dispatch a synthetic replacement part to any location in a genome made of billions of nucleotides. When it reaches its destination, the Cas9 enzyme snips out the unwanted DNA sequence. To patch the break, the cell inserts the chain of nucleotides that has been delivered in the CRISPR package.

By the time the Zika outbreak in Puerto Rico comes to an end, the U.S. Centers for Disease Control and Prevention estimates that, based on patterns of other mosquito-borne illnesses, at least a quarter of the 3.5 million people in Puerto Rico may contract Zika. That means thousands of pregnant women are likely to become infected.

Currently the only truly effective response to Zika would involve bathing the island in insecticide. James and others say that editing mosquitoes with CRISPR—and using a gene drive to make those changes permanent—offers a far better approach.

Gene drives have the power to override the traditional rules of inheritance. Ordinarily the progeny of any sexually reproductive animal receives one copy of a gene from each parent. Some genes, however, are “selfish”: Evolution has bestowed on them a better than 50 percent chance of being inherited. Theoretically, scientists could combine CRISPR with a gene drive to alter the genetic code of a species by attaching a desired DNA sequence onto such a favored gene before releasing the animals to mate naturally. Together the tools could force almost any genetic trait through a population.

Last year, in a study published in the Proceedings of the National Academy of Sciences, James used CRISPR to engineer a version of Anopheles mosquitoes that makes them incapable of spreading the malaria parasite. “We added a small package of genes that allows the mosquitoes to function as they always have,” he explained. “Except for one slight change.” That change prevents the deadly parasite from being transmitted by the mosquitoes.

“I’d been laboring in obscurity for decades. Not anymore, though—the phone hasn’t stopped ringing for weeks,” James said, nodding at a sheaf of messages on his desk.

Combating the Ae. aegypti mosquito, which carries so many different pathogens, would require a slightly different approach. “What you would need to do,” he told me, “is engineer a gene drive that makes the insects sterile. It doesn’t make sense to build a mosquito resistant to Zika if it could still transmit dengue and other diseases.”

To fight off dengue, James and his colleagues have designed CRISPR packages that could simply delete a natural gene from the wild parent and replace it with a version that would confer sterility in the offspring. If enough of those mosquitoes were released to mate, in a few generations (which typically last just two or three weeks each) entire species would carry the engineered version.

James is acutely aware that releasing a mutation designed to spread quickly through a wild population could have unanticipated consequences that might not be easy to reverse. “There are certainly risks associated with releasing insects that you have edited in a lab,” he said. “But I believe the dangers of not doing it are far greater.”

It has been more than 40 سنوات since scientists discovered how to cut nucleotides from the genes of one organism and paste them into the genes of another to introduce desired traits. Molecular biologists were thrilled by the possibilities this practice, referred to as recombinant DNA, opened for their research. From the start, however, scientists also realized that if they could transfer DNA between species, they might inadvertently shift viruses and other pathogens too. That could cause unanticipated diseases, for which there would be no natural protection, treatment, or cure.

This possibility frightened no one more than the scientists themselves. In 1975, molecular biologists from around the world gathered at the Asilomar Conference Grounds, along California’s central coast, to discuss the challenges presented by this new technology. The group emerged from the meeting having agreed to a series of safeguards, including levels of laboratory security that escalated along with the potential risks posed by the experiments.

It soon became clear that the protections seemed to work and that the possible benefits were enormous. Genetic engineering began to improve the lives of millions. Diabetics, for example, could count on steady supplies of genetically engineered insulin, made in the lab by placing human insulin genes into bacteria and then growing it in giant vats. Genetically engineered crops, yielding more and resisting herbicides and insects, began to transform much of the world’s agricultural landscape.

Yet while genetically engineered medicine has been widely accepted, crops produced in a similar fashion have not, despite scores of studies showing that such products are no more dangerous to eat than any other food. As the furor over the labeling of GMOs (genetically modified organisms) demonstrates, it doesn’t matter whether a product is safe if people refuse to eat it.

CRISPR may provide a way out of this scientific and cultural quagmire. From the beginning of the recombinant era, the definitions of the word “transgenic” and the term “GMO” have been based on the practice of combining in a laboratory the DNA of species that could never mate in nature. But scientists hope that using CRISPR to alter DNA could appease the opposition. It gives researchers the ability to redesign specific genes without having to introduce DNA from another species.

Golden rice, for example, is a GMO engineered to contain genes necessary to produce vitamin A in the edible part of the grain—something that doesn’t happen naturally in rice plants. Each year up to half a million children in the developing world go blind for lack of vitamin A—but anti-GMO activists have interfered with research and prevented any commercial production of the rice. With CRISPR, scientists could almost certainly achieve the same result simply by altering genes that are already active in rice plants.

Scientists in Japan have used CRISPR to extend the life of tomatoes by turning off genes that control ripening. By deleting all three copies of one wheat gene, Caixia Gao and her team at the Chinese Academy of Sciences in Beijing have created a strain that is resistant to powdery mildew.

Without regulation, the tremendous potential of this revolution could be overshadowed by fear.

Farmers have been adjusting genes in single species—by crossbreeding them—for thousands of years. CRISPR simply offers a more precise way to do the same thing. In some countries, including Germany, Sweden, and Argentina, regulators have made a distinction between GMOs and editing with tools such as CRISPR. There have been signs that the U.S. Food and Drug Administration might follow suit, which could make CRISPR-created products more readily available and easily regulated than any other form of genetically modified food or drug. Whether the public will take advantage of them remains to be seen.

The potential for CRISPR ابحاث to improve human medicine would be hard to overstate. The technology has already transformed cancer research by making it easier to engineer tumor cells in the laboratory, then test various drugs to see which can stop them from growing. Soon doctors may be able to use CRISPR to treat some diseases directly.

Stem cells taken from people with hemophilia, for example, could be edited outside of the body to correct the genetic flaw that causes the disease, and then the normal cells could be inserted to repopulate a patient’s bloodstream.

In the next two years we may see an even more dramatic medical advance. There are 120,000 Americans on waiting lists to receive organ transplants, and there will never be enough for all of them. Thousands of people die every year before reaching the top of the list. Hundreds of thousands never even meet the criteria to be placed on the list.

For years, scientists have searched for a way to use animal organs to ease the donor shortage. Pigs have long been considered the mammal of choice, in part because their organs are similar in size to ours. But a pig’s genome is riddled with viruses called PERVs (porcine endogenous retroviruses), which are similar to the virus that causes AIDS and have been shown to be capable of infecting human cells. No regulatory agency would permit transplants with infected organs. And until recently, nobody has been able to rid the pig of its retroviruses.

Now, by using CRISPR to edit the genome in pig organs, researchers seem well on their way to solving that problem. A group led by George Church, a professor at Harvard Medical School and MIT, used the tool to remove all 62 occurrences of PERV genes from a pig’s kidney cell. It was the first time that so many cellular changes had been orchestrated into a genome at once.

When the scientists mixed those edited cells with human cells in a laboratory, none of the human cells became infected. The team also modified, in another set of pig cells, 20 genes that are known to cause reactions in the human immune system. That too would be a critical part of making this kind of transplant work.

Church has now cloned those cells and begun growing them in pig embryos. He expects to start primate trials within a year or two. If the organs function properly and are not rejected by the animals’ immune systems, the next step would be human trials. Church told me he thinks this could happen in as few as 18 months, adding that for many people the alternative to the risk of the trial would surely be death.

Church has always wanted to find a way to provide transplants for people who aren’t considered healthy enough to receive them. “The closest thing we have to death panels in this country are the decisions made about who gets transplants,” he said. “A lot of these decisions are being made based on what else is wrong with you. Many people are rejected because they have infectious diseases or problems with substance abuse—a whole host of reasons. And the conceit is that these people would not benefit from a transplant. But of course they would benefit. And if you had an abundance of organs, you could do it for everyone.”

The black-footed ferret is one of the most endangered mammals in North America. Twice in the past 50 years, wildlife ecologists assumed that the animals, which were once plentiful throughout the Great Plains, had gone extinct. They came close every black-footed ferret alive today descends from one of seven ancestors discovered in 1981 on a cattle ranch near Meeteetse, Wyoming.

But the ferrets, inbred for generations, lack genetic diversity, which makes it harder for any species to survive.

“The ferrets are a classic example of an entire species that could be saved by genomic technology,” said Ryan Phelan of the group Revive & Restore, which is coordinating efforts to apply genomics to conservation. Working with Oliver Ryder at the San Diego Frozen Zoo, Phelan and her colleagues are attempting to increase the diversity of the ferrets by introducing more variable DNA into their genomes from two specimens preserved 30 years ago.

Phelan’s work can address two immediate and interlocking threats. The first is lack of food: Prairie dogs, the ferrets’ main prey, have been decimated by sylvatic plague, which is caused by the same bacterium that gives rise to bubonic plague in humans. And the plague is also fatal to the ferrets themselves, which become infected by eating prairie dogs that have died of the disease. A vaccine against human plague developed in the 1990s appears to provide lifelong immunity in ferrets. Teams from the Fish and Wildlife Service have captured, vaccinated, and released as many of the ferrets (a few hundred exist in the wild) as they can. But such a ferret-by-ferret approach cannot protect the species.

A more sophisticated solution has been proposed by Kevin Esvelt, an assistant professor at the MIT Media Lab, who developed some of the CRISPR and gene drive technology with Church. Esvelt describes his work as sculpting evolution. “All you need to do is provide resistance,” he explained—by encoding antibodies generated by vaccination and then editing them into the ferrets’ DNA.

With gene drives and CRISPR
we now have a power over species of all kinds that we never thought possible.

Esvelt believes a similar approach could not only help the ferrets resist plague but could also help eradicate Lyme disease, which is caused by a bacterium transmitted by ticks that commonly feed on white-footed mice.

If resistance to Lyme could be edited into the mice’s DNA with CRISPR and spread through the wild population, the disease might be reduced or eliminated with little visible ecological impact. Esvelt and Church, however, both feel strongly that no such experiment should be attempted without public participation and unless the scientists who carry it out have developed a reversal system, a kind of antidote. Should the original edits have unforeseen ecological consequences, they could drive the antidote through a population to cancel them out.

Black-footed ferrets are hardly the only endangered animals that could be saved through a CRISPR gene drive. The avian population of Hawaii is rapidly disappearing, largely because of a type of malaria that infects birds. Before whalers brought mosquitoes in the early 19th century, birds in the Hawaiian Islands had no exposure to the diseases that mosquitoes carry, and therefore no immunity. Now only 42 of more than a hundred species of birds endemic to Hawaii remain, and three-quarters of those are listed as endangered. The American Bird Conservancy has referred to Hawaii as “the bird extinction capital of the world.” Avian malaria is not the only threat to what remains of Hawaii’s native birds, but if it cannot be stopped—and gene editing seems to be the best way to do that—they will likely all disappear.

Jack Newman is a former chief science officer at Amyris, which pioneered development of a synthetic form of artemisinin, the only genuinely effective drug available to treat malaria in humans. Now he focuses much of his attention on eliminating mosquito-borne disease in birds. The only current method of protecting birds from malaria is to kill the mosquitoes by spreading powerful chemicals over an enormous region. Even that is only partially successful.

“In order to kill a mosquito,” Newman says, “the insecticide actually has to touch it.” Many of these insects live and breed deep in the hollows of trees or in the recessed crags of rock faces. To reach them with insecticides almost certainly would require poisoning much of the natural life in Hawaii’s rain forests. But gene editing, which would result in sterile mosquitoes, could help save the birds without destroying their surroundings. “Using genetics to save these species is just an incredibly targeted way to address a variety of environmental ills,” Newman says. “Avian malaria is destroying the wildlife of Hawaii, and there is a way to stop it. Are we really willing to just sit there and watch?”

In February of this year, U.S. Director of National Intelligence James Clapper warned in his annual report to the Senate that technologies like CRISPR ought to be regarded as possible weapons of mass destruction. Many scientists considered the comments unfounded, or at least a bit extreme. There are easier ways for terrorists to attack people than to conjure up new crop plagues or deadly viruses.

Nevertheless, it would be shortsighted to pretend that the possibility for harm (including, and perhaps especially, accidental harm) does not exist with these new molecular tools. The scientists most responsible for advances like CRISPR agree that when we begin to tinker with the genetic heritage of other species, not to mention our own, it may not be easy, or even possible, to turn back.

“What are the unintended consequences of genome editing?” asked Jennifer Doudna, as we spoke in her office at the University of California, Berkeley, where she is professor of chemistry and molecular biology. In 2012, Doudna and her French colleague Emmanuelle Charpentier were the first to demonstrate that scientists could use CRISPR to edit purified DNA in lab dishes. “I don’t know that we know enough about the human genome, or maybe any other genome, to fully answer that question. But people will use the technology whether we know enough about it or not.”

The more rapidly science propels humanity forward, the more frightening it seems. This has always been true. Do-it-yourself biology is already a reality soon it will almost certainly be possible to experiment with a CRISPR kit in the same way that previous generations of garage-based tinkerers played with ham radios or rudimentary computers. It makes sense to be apprehensive about the prospect of amateurs using tools that can alter the fundamental genetics of plants and animals.

But the benefits of these tools are also real, and so are the risks of ignoring them. Mosquitoes cause immense agony throughout the world every year, and eradicating malaria or another disease they carry would rank among medicine’s greatest achievements. Although it is clearly too soon to contemplate using CRISPR in viable human embryos, there are other ways of editing the human germ line that could cure diseases without changing the genetic lineage of our species.

Children born with Tay-Sachs disease, for instance, lack a critical enzyme necessary for the body to metabolize a fatty waste substance found in the brain. The disease is very rare and occurs only when both parents transmit their defective version of the gene to a child. With CRISPR it would be easy to treat one parent’s contribution—say, the father’s sperm—to ensure that the child did not receive two copies of the faulty gene. Such an intervention would clearly save lives and reduce the chance of recurrence of the disease. A similar outcome can be achieved already through in vitro fertilization: Implanting an embryo free of the defective gene ensures that the child won’t pass the disorder on to a future generation.

When faced with risks that are hard to evaluate, we have a strong tendency to choose inaction. But with millions of lives at stake, inaction presents its own kind of danger. Last December scientists from around the world met in Washington to discuss the difficult ethics of these choices. More discussions are planned. There will never be simple answers, but without any regulatory guidance—and there is none yet for editing human DNA—the tremendous potential of this revolution could be overshadowed by fear.

“With gene drives and CRISPR we now have a power over species of all kinds that we never thought possible,” says Hank Greely, director of Stanford’s Center for Law and the Biosciences. “The potential good we can do is immense. But we need to acknowledge that we are dealing with a fundamentally new kind of power, and figure out a way to make sure we use it wisely. We are not currently equipped to do that, and we have no time to lose.”


Why can't we use plasmids to add genes to ourselves? - مادة الاحياء

When comparing prokaryotic cells to eukaryotic cells, prokaryotes are much simpler than eukaryotes in many of their features (Figure 1). Most prokaryotes contain a single, circular chromosome that is found in an area of the cytoplasm called the nucleoid.

سؤال الممارسة

Figure 1. A eukaryote contains a well-defined nucleus, whereas in prokaryotes, the chromosome lies in the cytoplasm in an area called the nucleoid.

In eukaryotic cells, DNA and RNA synthesis occur in a separate compartment from protein synthesis. In prokaryotic cells, both processes occur together. What advantages might there be to separating the processes?

The size of the genome in one of the most well-studied prokaryotes, E.coli, is 4.6 million base pairs (approximately 1.1 mm, if cut and stretched out). So how does this fit inside a small bacterial cell? The DNA is twisted by what is known as supercoiling. Supercoiling means that DNA is either under-wound (less than one turn of the helix per 10 base pairs) or over-wound (more than 1 turn per 10 base pairs) from its normal relaxed state. Some proteins are known to be involved in the supercoiling other proteins and enzymes such as DNA gyrase help in maintaining the supercoiled structure.

Eukaryotes, whose chromosomes each consist of a linear DNA molecule, employ a different type of packing strategy to fit their DNA inside the nucleus (Figure 2). At the most basic level, DNA is wrapped around proteins known as histones to form structures called nucleosomes. The histones are evolutionarily conserved proteins that are rich in basic amino acids and form an octamer. The DNA (which is negatively charged because of the phosphate groups) is wrapped tightly around the histone core. This nucleosome is linked to the next one with the help of a linker DNA. This is also known as the “beads on a string” structure. This is further compacted into a 30 nm fiber, which is the diameter of the structure. At the metaphase stage, the chromosomes are at their most compact, are approximately 700 nm in width, and are found in association with scaffold proteins.

In interphase, eukaryotic chromosomes have two distinct regions that can be distinguished by staining. The tightly packaged region is known as heterochromatin, and the less dense region is known as euchromatin. Heterochromatin usually contains genes that are not expressed, and is found in the regions of the centromere and telomeres. The euchromatin usually contains genes that are transcribed, with DNA packaged around nucleosomes but not further compacted.

Figure 2. These figures illustrate the compaction of the eukaryotic chromosome.


شاهد الفيديو: BIOSHOCK Remastered - Все ПЛАЗМИДЫ. (أغسطس 2022).