معلومة

ما هي أعلى كفاءة ممكنة للإي كولاي؟

ما هي أعلى كفاءة ممكنة للإي كولاي؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أبحث عن سلالة E coli عالية الكفاءة. أقوم بإنشاء مكتبة من بلازميد يبلغ 6.6 كيلوبايت تقريبًا ولا أحصل على كفاءة عالية بما يكفي. هل لدى أي شخص اقتراح إجهاد / بروتوكول بكفاءة عالية (> 1010).


هذا سؤال رائع لأنني صنعت للتو خلايا "التخمير المنزلي" الخاصة بي.

هناك مجموعة متنوعة من بكتريا قولونية السلالات التي يشيع استخدامها للاستنساخ. يمكن تحويلها كيميائيًا عن طريق طريقة الصدمة الحرارية ، أو كهربائيًا عن طريق التثقيب الكهربائي (يمكن العثور على ملخص موجز هنا). يمكن صنعها في المختبر يدويًا ، أو شراؤها تجاريًا من البائعين ذوي السمعة الطيبة (أوصي Invitrogen / Life Tech ، NEB ، Promega).

تتحقق الكفاءة كيميائيا باستخدام طريقة هاناهان أو بعض أشكالها. تتضمن الطريقة غسل البكتيريا في سلسلة من المحاليل التي تحتوي على أملاح كلوريد الكاتيون ثنائية التكافؤ المختلفة (CaCl2، RbCl2، إلخ). متاح تجاريا بكتريا قولونية تباع على أنها مختصة "عادية" و "فائقة" ، تتراوح من 106 حتى 106 بشكل منتظم ، وأعلى ما رأيته هو 1010 cfu / مكغ DNA. لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة ، خاصة وأن البلازميد الصغير مثل الخاص بك سيكون من السهل تحويله ، Electroporation هي تقنية أكثر كفاءة ، ولكنها تتطلب معدات متخصصة. يمكن أن ينتج Electroporation> 1010 cfu / مكغ. بالنسبة لممارسات الاستنساخ القياسية ، تعتبر الإشريكية القولونية ذات الكفاءة العالية والمنتظمة ذات الكفاءة العالية كافية تمامًا. نظرًا لأنك ذكرت أنك تقوم بإنشاء مكتبة ، فأنت بالتأكيد تريد الانتقال إلى تحويل كيميائي عالي الكفاءة أو ، إذا كان لديك المعدات اللازمة ، كهربائيًا. لم أر كفاءات Electroporation التي تم الإبلاغ عنها> 5x1010.

يتم توحيد كفاءات التحول من خلال الإبلاغ عن معدل كعدد وحدات تشكيل المستعمرة (cfu) لكل ميكروغرام من بعض بلازميد التحكم ، عادةً pUC19. تعتبر كفاءة التحويل حساسة للغاية للعديد من العوامل ، بما في ذلك وقت الصدمة الحرارية ، وأوقات التبريد ، ووقت الذوبان ، وكمية وحجم DNA البلازميد. كل الأشياء متساوية ، فإن حجم وكمية الحمض النووي مهمان لأغراضك. تزداد كفاءة التحول بشكل عام مع زيادة كمية الحمض النووي ، ولكن هناك نقطة تشبع ، وحتى وجود الكثير من الحمض النووي يؤدي إلى تقليل العائد. أيضًا ، تنخفض الكفاءة خطيًا مع حجم البلازميد. على سبيل المثال ، pUC19 ، ناقل التحكم ، يبلغ 2.7 كيلو بايت تقريبًا ، والبلازميد الخاص بمكتبتك يبلغ 6.6 كيلو بايت تقريبًا ، لذلك يجب أن تتوقع لنفس كتلة الحمض النووي أنك ستفقد تحولًا بنسبة 60٪ بسبب حجم البلازميد. يرجع هذا الفقد إلى أن الحجم المادي الأكبر للحمض النووي يكون أكثر صعوبة في الانتقال إلى البكتيريا.


لقد سمعت أن خلايا Epi300 الكهربائية (1) من Epicenter فعالة للغاية:> 1 × 1010 cfu / ميكروغرام من pUC19. استخدمهم دان جيبسون في ورقته لتركيب جينوم الميتوكوندريا (2). كنا نفكر أيضًا في استخدامها لتجمعاتنا ، لكنها باهظة الثمن.

1. TransforMax ™ EPI300 ™ Electrocompetent E. coli

2. التركيب الكيميائي لجينوم الميتوكوندريا الفأر ، جيبسون وآخرون. آل.


شاهد الفيديو: بكتيريا الايكولاي شبح الموت القادم (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Rio

    ربما سنرى أولاً

  2. Bagrel

    دب ... أود هذا :)))



اكتب رسالة