معلومة

ما هي نقطة نهاية المادة من خلية موت الخلايا المبرمج بعد البلعمة؟

ما هي نقطة نهاية المادة من خلية موت الخلايا المبرمج بعد البلعمة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

يحدث موت الخلايا المبرمج. تشكل العضيات والمواد الداخلية أجسامًا أبوطوزية معبأة في حويصلات. يتفكك غشاء الخلية (لم تعد الخلية موجودة) وتدخل الأجسام الأبوطوزية إلى الفضاء خارج الخلية. البالعات "تأكل" أجسام موت الخلايا المبرمج.

ما يحدث بعد ذلك؟

هل تتم معالجة المادة مرة أخرى وتدفقها في الدم ، وترسل إلى خلايا أخرى ، ...؟


الحدود في علم المناعة

انتماءات المحرر والمراجعين هي الأحدث التي يتم توفيرها في ملفات تعريف بحث Loop وقد لا تعكس موقفهم في وقت المراجعة.


  • تحميل المادة
    • تحميل PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • تكميلي
      مادة
    • ملاحظة ختامية
    • مدير المراجع
    • ملف TEXT بسيط
    • BibTex


    مشاركه فى

    يربط كثرة الخلايا العضلية المعززة لخلايا عضلة القلب موت الخلايا المبرمج من خلال التيروزين كيناز النخاعي - الظهاري - الإنجابي بين حل الالتهاب الحاد لإصلاح القلب بعد الاحتشاء

    الأساس المنطقي: يعتبر التصفية الفعالة للخلايا المبرمج (كثرة الخلايا) شرطًا أساسيًا لحل الالتهاب وإصلاح الأنسجة. بعد احتشاء عضلة القلب ، يتم تجنيد الخلايا البلعمية للقلب وتعزيز إزالة الخلايا العضلية القلبية المحتضرة. الآليات الجزيئية لفرط الخلايا العضلية في عضلة القلب وفي عضلة القلب غير معروفة. يوفر القلب المصاب نموذجًا فريدًا لفحص العلاقات بين كثرة الخلايا البادرة وحل الالتهاب اللاحق وإعادة تشكيل الأنسجة ووظيفة الأعضاء.

    موضوعي: شرعنا في تحديد آليات احتضار خلايا عضلة القلب المحتضرة بواسطة البالعات ، وللمرة الأولى ، لتقييم الأهمية السببية لتعطيل كثرة الخلايا العضلية أثناء احتشاء عضلة القلب.

    الطرق والنتائج: على عكس مستقبلات الخلايا المبرمج الأخرى ، كان التيروزين كيناز الضامة النخاعية الظهارية والتناسلية ضروريًا وكافيًا لفرط الخلايا العضلية خارج الجسم الحي. في الفئران ، تم تحفيز Mertk على وجه التحديد في خلايا العضلة القلبية Ly6c (LO) بعد انسداد الشريان التاجي التجريبي. أدى نقص Mertk إلى تراكم خلايا عضلة القلب الأبوطوزية ، بغض النظر عن التغيرات في الخلايا العضلية غير القلبية ، وانخفاض مؤشر كثرة الخلايا في الجسم الحي. الأهم من ذلك ، أن كثرة الخلايا السرطانية المكبوتة سبقت زيادات في حجم احتشاء عضلة القلب وأدت إلى تأخر حل الالتهاب وانخفاض الأداء الانقباضي. تم استنساخ وظيفة القلب المخفّضة في الفئران الكيميرية التي تعاني من نقص في نخاع العظام. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم التعرف على شكل معطل من التيروزين كيناز النخاعي - الظهاري - التناسلي ، والمعروف باسم solMER ، في عضلة القلب المحتجزة ، مما يشير إلى آلية طبيعية لتعطيل التيروزين كيناز النخاعي - الظهاري - التناسلي بعد احتشاء عضلة القلب.

    الاستنتاجات: تربط هذه البيانات بشكل جماعي ومباشر بين كثرة الخلايا التئام الجروح في القلب وتحدد Mertk كحلقة وصل مهمة بين حل الالتهاب الحاد ووظيفة العضو.

    الكلمات الدالة: التهاب كثرة الخلايا الضامة الضامة احتشاء عضلة القلب البلعمة.

    بيان تضارب المصالح

    الأرقام

    الشكل 1. الخلايا العضلية البلعمية البلعمية (CMs) و ...

    الشكل 1. الخلايا العضلية البلعمية البلعمية (CMs) و ميرتك مطلوب على وجه التحديد لفرط الخلايا CM

    الشكل 2. تحديد وحركية ميرتك ...

    الشكل 2. تحديد وحركية ميرتك تعبير آخر MI في الفئران التجريبية

    الشكل 3. Chemokine و cytokine mRNA و ...

    الشكل 3. الشكل 3. Chemokine و cytokine mRNA والخلايا الالتهابية في القلوب من ميرتك + / + مقابل ...

    الشكل 4. الكمي لموت الخلايا المبرمج في عضلة القلب ...

    الشكل 4. الكمي لموت الخلايا المبرمج لعضلة القلب (CM) والارتباط مع CD68 + البالعات في ميرتك +/+…

    الشكل 5. حجم احتشاء عضلة القلب الحاد هو ...

    الشكل 5. يزداد حجم احتشاء عضلة القلب الحاد في ميرتك - / - الفئران بعد MI

    الشكل 6. التحديد الكمي لتكوين الندبة في ...

    الشكل 6. التحديد الكمي لتشكيل الندبة في القلوب المعاد تشكيلها بعد احتشاء عضلة القلب (MI) في ميرتك ...

    الشكل 7. تقييم وظيفة القلب من خلال ...

    الشكل 7. تقييم وظيفة القلب عن طريق تخطيط صدى القلب بعد احتشاء عضلة القلب (MI) في ميرتك ناقص ...


    المواد والأساليب

    تحضير المؤتلف MFG-E8

    تم تحضير المؤتلف MFG-E8-L وبروتيناته الطافرة كما هو موضح سابقًا (18). باختصار ، تم إدخال تعبير البلازميد من النوع البري MFG-E8-L ، D89E الذي يحمل تسلسل RGE بدلاً من RGD في المجال الثاني الذي يشبه EGF ، أو E1E2PT التي تفتقر إلى مجالات C1C2 في خلايا الإنسان 293T بواسطة طريقة ترسيب فوسفات الكالسيوم. تم استبدال وسط الثقافة بـ DMEM / 2 ٪ FCS بعد 16 ساعة من تعداء الجسم ، وتم زراعة الخلايا المنقولة لمدة 48 ساعة أخرى. تمت تنقية البروتينات المؤتلفة التي تم إفرازها في الوسط باستخدام هلام تقارب مضاد لـ FLAG M2 (Sigma-Aldrich) أو الجسم المضاد لـ MFG-E8 (استنساخ 2422) - خرز البروتين المترافق A-Sepharose 4FF (Amersham Biosciences). لفحص نقاوة البروتينات ، تم إخضاعها لـ SDS-PAGE والنشاف الغربي. بالنسبة لـ SDS-PAGE ، تم فصل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي على هلام متدرج بولي أكريلاميد بنسبة 10/20٪ وملطخة باللون الأزرق اللامع Coomassie. بالنسبة إلى النشاف الغربي ، تم فصل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي ، ونقلها إلى أغشية PVDF ، واكتشافها باستخدام الجسم المضاد لـ FLAG. لقد أكدنا أن البروتينات المؤتلفة وحدها لم تحفز إنتاج السيتوكينات الالتهابية بما في ذلك TNF α و IL-1β في الضامة.

    فحص البلعمة في المختبر وقياس إنتاج السيتوكينات.

    لتحضير الضامة المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) ، تم الحصول على خلايا نخاع العظم عن طريق طرد عظام الفخذ من الفئران C57BL / 6 التي يبلغ عمرها 8-10 أسابيع. عولجت الخلايا بمحلول تحلل كريات الدم الحمراء (17 ملي مولار Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 144 ملي مولار من كلوريد الأمونيوم ، و 0.5٪ FCS) لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تم تعليق الخلايا في وسط αMEM / 10 ٪ FCS ، وتم طلاءها بكثافة 10 6 خلايا / مل في وجود الماوس المؤتلف M-CSF (هدية من A. Kudo ، معهد طوكيو للتكنولوجيا ، كاناغاوا ، اليابان). تم حصاد الخلايا في اليوم الثالث ، وتم تخفيفها 1:10 بالوسيط ، وتم تربيتها لمدة 3 أيام أخرى عند 37 درجة مئوية. في اليوم السادس ، تم استخدام الخلايا لفحص البلعمة. تم زرع 2.5 × 10 5 BMDMs في مجموعة ثقافة خلية مكونة من 48 بئر (Corning Inc.) وتم تربيتها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. تم تحضين الخلايا مسبقًا مع أو بدون D89E (1 ، 2 ، و 4 ميكروغرام / مل) أو بروتين E1E2PT (4 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة. لتحضير الخلايا المبرمجة ، تم تحضين الخلايا التوتية من 4 إلى 8 أسابيع من الفئران التي تعاني من نقص CAD (6) مع 10 ميكرومتر من ديكساميثازون عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. تمت إضافة 2.5 × 10 6 من الخلايا التوتية الأبوطوزية إلى مزارع BMDM ، وتم السماح بالبلعمة بالمضي قدمًا لمدة ساعتين. تمت إزالة الخلايا التي لم يتم ابتلاعها عن طريق الغسيل باستخدام PBS ، وتم فصل BMDMs بـ 1 ملي مولار EDTA / PBS. بعد ذلك ، تم تلطيخ الخلايا بـ CD11b المضاد للفأر المترافق مع PE ، متبوعًا بتلطيخ TUNEL كما هو موضح سابقًا (18).

    تم تعليق الضامة البريتونية المقيمة في DMEM / 10 ٪ FCS وتم زرع 10 5 خلايا في مجموعة ثقافة خلية 96 بئر. تم تحضين الخلايا لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية واستخدامها لفحص البلعمة.

    لمقايسة السيتوكين ، تم زرع 10 5 خلايا من الضامة البريتونية المستخرجة من ثيوجليكولات من C57BL / 6 في مجموعة ثقافة خلية 96 بئر. تم تحضين البلاعم مسبقًا مع أو بدون بروتين D89E أو E1E2PT لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، تمت إضافة 2 × 10 6 خلية من الخلايا التوتية المبرمجة الناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية إلى الضامة من أجل البلعمة. بعد الحضانة لمدة ساعتين ، تم غسل الضامة مرتين ، وتم تحفيزها مع أو بدون 1 ميكروغرام / مل LPS لمدة 20 ساعة. لقياس TGF-، تم تغيير وسط الثقافة إلى AIM-V (Invitrogen) ساعة واحدة بعد التحفيز باستخدام LPS أو بدونه ، وتم تحضين الخلايا لمدة 20 ساعة. تم قياس تركيزات السيتوكين في طاف الثقافة باستخدام مجموعات ELISA لـ IL-10 و TNFα (BD Biosciences) و TGF-β (R & ampD Systems) وفقًا لبروتوكولات الشركة المصنعة.

    حقن البروتينات المؤتلفة وخلايا أبوبوتيك.

    تم تخفيف البروتينات المؤتلفة المنقى باستخدام PBS الذي يحتوي على 2.5 ٪ من مصل الفأر الطبيعي الذي تم الحصول عليه من C57BL / 6 الفئران ، وتم حقن 300 ميكرولتر من المحلول عن طريق الوريد في الفئران الإناث C57BL / 6 بعمر 8 أسابيع عبر الوريد الذيل. في حالة حقن الخلايا الزعترية الأبوطوزكية ، تمت إزالة الغدة الصعترية من الفئران C57BL / 6 بعمر 4 إلى 6 أسابيع وعصرها بين الشرائح الزجاجية. تم بعد ذلك ترشيح Thymocytes من خلال شبكة من النايلون ، وتعليقها في وسط RPMI 1640 الخالي من المصل. تم تشعيع الخلايا باستخدام 40 جول / م 2 من ضوء الأشعة فوق البنفسجية للحث على موت الخلايا المبرمج وتم تربيتها في وسط RPMI 1640 يحتوي على 1 ٪ من مصل الفأر الطبيعي عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة. بعد ذلك ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 مجم / مل من ألبومين مصل الفأر وتم تعليقها في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2.5 ٪ من مصل الفأر الطبيعي. تمت إضافة المؤتلف MFG-E8 إلى الخلايا التوتية الأبوطوزية قبل 30 دقيقة من الحقن ، وتم حقن الخلايا عن طريق الوريد في الفئران. تم إجراء التحصينات أسبوعياً لما مجموعه أربع إلى ست حقن.

    الكشف عن الأجسام المضادة

    تم الكشف عن مستويات مصل الجسم المضاد للكارديوليبين والأجسام المضادة لـ PS بواسطة ELISA. تم طلاء لوحات ELISA ذات 96 جيدًا (لوحة Immulon 1B ThermoLabsystems) بـ 10 ميكروغرام / مل من كارديوليبين (CL) في ميثانول أو 10 ميكروغرام / مل لتر -α-فوسفاتيديل- l -serine ، dioleoyl (Sigma-Aldrich) في الإيثانول. بعد الحجب بـ 10 ٪ FCS ، تمت إضافة مصل الفئران المخفف 50 مرة باستخدام PBS وحضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم الكشف عن الأجسام المضادة للفأر المرتبطة باللوحة باستخدام Ig المضاد للفأر الماعز المترافق مع HRP (ICN Biomedicals) بتخفيف 1: 2000. تم الكشف عن نشاط البيروكسيداز باستخدام ا-فينيلين ديامين في مجموعة الكشف عن البيروكسيداز (سوميتومو) كركيزة. تمت قراءة تفاعل اللون عند 492 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية (Titertek Instruments).

    تم الكشف عن الأجسام المضادة للنواة (ANA) عن طريق التألق المناعي غير المباشر و ELISA. من أجل التألق المناعي ، تم تخفيف عينات المصل 50 مرة باستخدام برنامج تلفزيوني ، وتمت إضافتها على شرائح زجاجية مطلية بخلايا Hep-2 (MBL). تم تحضين الشرائح عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة. تم اكتشاف الأجسام المضادة المرتبطة بالشرائح بواسطة Cy3- مترافق F (ab ′)2 تم تخفيف IgG المضاد للفأر من الماعز (معامل Jackson ImmunoResearch) 100 مرة باستخدام مصل الماعز الطبيعي PBS / 10٪. لوحظت الشرائح بالمجهر الفلوري (نموذج IX-70 أوليمبوس).

    تم اكتشاف ANAs أيضًا باستخدام مجموعة أدوات الكشف عن ANA (MBL). تمت إضافة مصل الفأر المخفف 100 مرة بمحلول رد الفعل للمجموعة إلى كوب صغير مغطى بمزيج من المستضدات النووية البشرية (ثلاثة أنواع من حاتمة RNP [70k ، RNP-A ، و RNP-C] ، SM الأصلي ، SS- الأصلي A ، SS-B المؤتلف ، Scl-70 المؤتلف ، cenp-B ، المؤتلف Jo-1 ، ومستضد DNA phage DNA) وحضنت لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم الكشف عن الأجسام المضادة المرتبطة بالصفيحة باستخدام الماعز المضاد للفأر Ig المترافق مع HRP (ICN Biomedicals) بتخفيف 1: 1،000. تم الكشف عن نشاط البيروكسيداز باستخدام TMB كركيزة. تمت قراءة تفاعل اللون عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية (Titertek Instruments).

    تم الكشف عن الجسم المضاد للحمض النووي المضاد المزدوج (ds) باستخدام مجموعة أدوات الكشف عن dsDNA (MBL). تمت إضافة مصل الفأر المخفف 100 مرة باستخدام محلول رد الفعل للمجموعة إلى كوب صغير مغطى بـ dsDNA البشري وحضنت لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم الكشف عن الأجسام المضادة المرتبطة بالصفيحة الدقيقة باستخدام الماعز المضاد للفأر Ig المترافق مع HRP (ICN Biomedicals) بتخفيف 1: 1000. تم الكشف عن نشاط البيروكسيداز كما هو موضح في الفقرة السابقة. تمت قراءة تفاعل اللون عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية (Titertek Instruments).

    الكيمياء المناعية

    تم إصلاح كلى فأر بعمر 20-36 أسبوعًا مع 4٪ بارافورمالدهيد / 4٪ سكروز في محلول فوسفات 0.1 مولار ، ودرجة الحموضة 7.2 ، وتم دمجها في البارافين. تم تحضير مقاطع بسمك 4 ميكرون وتركيبها على زجاج منزلق سيلاني. بالنسبة للكيمياء الهيستولوجية المناعية ، تم تحضين المقاطع لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ Triton X-100 و 10٪ من مصل الماعز الطبيعي وتم تلطيخها لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة باستخدام F (ab) 2 المترافق مع Cy3. يستخدم Mouse IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) بتخفيف 1: 100. تم غسل المقاطع ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 ٪ Triton X-100 وتم ملاحظتها بواسطة الفحص المجهري الفلوري.


    الملخص

    يتميز مرض الزهايمر ومرض الزهايمر (AD) بتراكم لويحات أميلويد بيتا (Aβ) خارج الخلية وكذلك شوائب داخل الأعصاب (تشابكات ليفية عصبية) تتكون من تاو الكلي والتاو الفسفوري. يوجد أيضًا العصب الحثل ، وفقدان نقاط الاشتباك العصبي ، وموت الخلايا العصبية ، والتسمم الدبق. أبرزت الدراسات الجينية لمرض الزهايمر أهمية الالتهاب في هذا المرض من خلال تحديد العديد من جينات الاستجابة المناعية المرتبطة بالمخاطر ، بما في ذلك TREM2. لقد تم تورط TREM2 بقوة في وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة الأساسية بما في ذلك البلعمة ، والاستماتة ، والاستجابة الالتهابية لـ Aβ في دماغ الفأر والخلايا الأولية. تظهر هذه الدراسات أن الخلايا الدبقية الصغيرة تلعب دورًا رئيسيًا في الاستجابة لـ Aβ وفي تراكم أمراض الزهايمر. ومع ذلك ، لا تزال التفاصيل مفقودة حول عوامل الاستماتة أو الالتهابية التي تعتمد على TREM2 في استجابتها لـ Aβ ، خاصة في سلالات الخلايا البشرية. بالنظر إلى هذه النتائج السابقة ، فإن فرضيتنا هي أن TREM2 يؤثر على الاستجابة لسمية Aβ من خلال تعزيز البلعمة وتثبيط كل من عائلة BCL-2 من البروتينات الأبوطوزية والسيتوكينات المؤيدة للالتهابات. أ42 تم إجراء علاج لخط الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية ، وخلايا HMC3 ، وتم زيادة التعبير عن TREM2 أو إسكاته ، وتم تقييم البلعمة والاستماتة والاستجابة الالتهابية. تشير النتائج إلى أن الاستجابة البلعمية القوية لـ Aβ بعد 24 ساعة تتطلب TREM2 في خلايا HMC3. أيضًا ، يمنع TREM2 موت الخلايا المبرمج المستحث بـ Aβ عن طريق تنشيط مجمع Mcl-1 / Bim. يشارك TREM2 في تنشيط IP-10 و MIP-1a و IL-8 ، بينما يثبط FGF-2 و VEGF و GRO. مجتمعة ، يلعب TREM2 دورًا في تعزيز الاستجابة الوظيفية الدبقية الصغيرة لسمية Aβ في خلايا HMC3. تشير هذه المعلومات الجديدة إلى أن الاستراتيجيات العلاجية التي تسعى إلى تنشيط TREM2 قد لا تعزز البلعمة وتمنع موت الخلايا المبرمج فحسب ، ولكنها قد تمنع أيضًا العوامل الالتهابية المفيدة ، مما يؤكد الحاجة إلى تحديد النشاط الالتهابي المرتبط بـ TREM2 ليس فقط في نماذج الفئران لمرض الزهايمر ، ولكن أيضًا في م الإنسان.


    فحوصات لا تغسل

    طريقة سريعة للغاية وعالية الدقة لمراقبة مراحل مسار البلعمة تستخدم مؤشرات pHrodo. يتم ربط pHrodo Deep Red ، والأحمر ، والأخضر مع مجموعة من الجسيمات لقياس البلعمة دون الحاجة إلى إخماد أو غسل.

    أصباغ pHrodo هي في الأساس غير الفلورية في درجة الحموضة المحايدة وتظهر إشارة متزايدة مع قراءات حمراء أو خضراء على التوالي مع انخفاض الرقم الهيدروجيني. يمكن استخدام الزيادة في إشارة الفلورسنت لمراقبة التقدم في مسار البلعمة.


    التجارب السريرية التي تشمل المركبات الكهربائية ونقل الميتوكوندريا

    يمكن الاطلاع على جميع التجارب السريرية المتعلقة بـ MSC-EVs و ATM على www.clinicaltrails.gov. على الرغم من أن غالبية التجارب المدرجة تركز على الخصائص التشخيصية للمركبات الكهربائية ، إلا أن هناك خمس تجارب تختبر التطبيقات العلاجية لـ MSCs-EVs واثنتان تقترحان استخدام أجهزة الصراف الآلي (الجدول 2).

    تم تصميم تجربة أولى لاختبار الخصائص المضادة للالتهابات للمشتقات MSCs-EVs المشتقة من الحبل السري لمنع تدمير جزر خلية البنكرياس. سيتم إعطاء MSCs-EVs عن طريق الوريد على جرعتين ، الجرعة الأولى من exosomes ، وبعد سبعة أيام ، الجرعة الثانية من الحويصلات المجهرية (NCT02138331). ستشمل تجربتان سريريتان أخريان تستخدمان المركبات الكهربائية الخيفية MSCs-EVs. سيقوم أحدهم بإدارة المركبات الكهربائية المخصبة بواسطة miR-124 لعلاج السكتة الدماغية الحادة (NCT03384433). ستحاول التجربة السريرية الثانية معالجة الآفات في المرضى المصابين بانحلال البشرة الفقاعي الحثلي (NCT04173650). تركز التجربة السريرية الأخيرة باستخدام المركبات الكهربائية الموجودة في مرحلة التجنيد على تعزيز التئام واستعادة الثقوب البقعية المقاومة للحرارة من خلال الحقن المباشر لإكسوسومات MSC في موقع الإصابة (NCT03437759). أخيرًا ، فإن المسار الوحيد الذي تم الانتهاء منه حتى الآن يستخدم MSCs-EVs المشتقة من الحبل السري لمنع تطور مرض الكلى المزمن في المرضى الذين يعانون من CKD من الدرجة III-IV [64]. أظهرت الدراسة استقرار تطور المرض ، كما تؤكده المستويات المستقرة لمعدل الترشيح الكبيبي ، والكرياتينين في الدم واليوريا في الدم في المرضى المعالجين ، وزيادة مستوى العوامل المضادة للالتهابات (TGF-β1 و IL-10) بالمقارنة مع معدل الترشيح الكبيبي. مطابقة مجموعة الدواء الوهمي.

    كما تم الانتهاء من أول تجربة سريرية باستخدام إدارة الميتوكوندريا المعزولة لعلاج عضلة القلب IRI بنتائج إيجابية [65]. تم عزل الميتوكوندريا من عضلات الهيكل العظمي غير الإقفارية وحقنت في عضلة القلب لمرضى الأطفال الذين يعانون من عضلة القلب IRI. لم يتم الكشف عن أي آثار ضائرة بعد إجراء تحليل AMT ، وأظهر أربعة من كل خمسة مرضى تحسنًا في وظيفة البطين [65].

    تركز التجارب السريرية الأخرى باستخدام AMT على تحسين علاجات العقم (الجدول 2). من خلال الحقن الجزئي الذاتي للميتوكوندريا قبل حقن الحيوانات المنوية داخل السيتوبلازم ، تم تحسين جودة البويضات لدى المرضى. في التجربة الأولى ، التي اختتمت في عام 2017 ، تم عزل الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الذاتية للمبيض وحُقنت مباشرة في البويضات نفسها. حتى الآن ، لم يتم نشر أي نتائج. تم قياس جودة الأجنة من خلال معدل الحمل بعد العلاج والتقييم المورفولوجي للأجنة المعالجة. في التجربة السريرية الثانية ، التي لا تزال جارية ، سيتم عزل الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية السرطانية الذاتية لنخاع العظام وإدارتها على الفور قبل حقن الحيوانات المنوية داخل السيتوبلازم في البويضات. سيتم تقييم معدل المواليد الحي ومعدل الحمل وعدد البويضات المسترجعة ومعدل الخصوبة.


    نتائج

    البلدان النامية غير الناضجة الخلايا المبرمجية البلعمية بكفاءة.

    استنادًا إلى الملاحظات السابقة التي تشير إلى أن DCs غير الناضجة هي الخلايا المسؤولة عن التقاط المستضد (11) ، توقعنا أن الخلايا المبرمجة ستبتلع بشكل أفضل بواسطة DCs غير الناضجة. لاختبار هذه الفرضية ، أنشأنا مقايسة البلعمة التي سمحت لنا بالكشف البصري عن امتصاص الخلايا المبرمج ، ومقارنة قدرة البلعمة للـ DCs غير الناضجة ، والـ DCs الناضجة ، والضامة. باختصار ، تم تحضير DCs غير الناضجة عن طريق زراعة جزء مستنفد من الخلايا التائية من الدم المحيطي في وجود IL-4 و GM-CSF. تم إنشاء DCs الناضجة مع إضافة MCM وأعربت هذه الخلايا عن علامة النضج المقيدة بسطح الخلية CD83 (18 ، 19 ، 30). تم تحضير البلاعم عن طريق زراعة مجموعة خلايا ملتصقة بالبلاستيك في أكواب تفلون لمدة 3-9 أيام. كمصدر للخلايا الأبوطوزكية ، استخدمنا عدوى أحادية مصابة بالإنفلونزا (7) تسبب عدوى الفيروس في موت الخلايا المبرمج في هذه الخلايا خلال 6-10 ساعات (7 ، 25 ، 26). أُصيبت الخلايا الأحادية أولاً بفيروس الأنفلونزا كما هو موصوف سابقًا (24) ، ثم صُبغت باللون الأحمر باستخدام PKH-26 (Sigma Biosciences). بعد 6-8 ساعات ، تم صبغ ناقلات APCs المختلفة باللون الأخضر باستخدام مركب رابط الخلية الفلوريسنت PKH67-GL (Sigma Biosciences) وزُرعت مع الخلايا الأبوطوزية بنسبة 1: 1. بعد ساعتين عند 37 درجة مئوية ، تم تحليل زراعة الخلايا بواسطة تحليل FACScan ® ، مما يسمح بتقدير امتصاص البلعمة كخلايا إيجابية مزدوجة. اجتاحت 80٪ من البلاعم ، و 50٪ من البلدان النامية غير الناضجة ، و & lt10٪ من البلدان النامية الناضجة حيدات موت الخلايا المبرمج بعد ساعتين من الزراعة (الشكل 1 ،أ). تشير مسحة الخلايا الموجبة المزدوجة (APCs التي تحمل علامة PKH67 والتي اجتاحت الخلايا المبرمجة التي تحمل علامة PKH26) إلى أن كلاً من الأجسام الأبوطوزية والخلايا الأبوطوزية الكاملة كانت بمثابة "طعام" للخلية البلعمية (الشكل 1 ، ثالثا, السادس، و التاسع). لاحظ أنه مع زيادة الانتثار الأمامي لناقلات APCs وتحول إعداد FACS® ، تم استبعاد الخلايا الوحيدة المحتضرة من المنطقة المحددة (الشكل 1 ، ثانيا, الخامس، و ثامنا). تم تحقيق أقصى امتصاص من قبل جميع مجموعات APC في غضون 2-4 ساعات ويعتمد جزئيًا على مصدر الخلية المبرمج المستخدمة (الشكل 1 ،ب والبيانات غير معروضة). بالنظر إلى هذه البيانات الحركية ، نعتقد أن البلاعم و DCs تشارك وتستوعب الخلايا المحتضرة بينما لا تزال تعرض ميزات موت الخلايا المبرمج المبكر. توضح هذه البيانات أيضًا أن التيار المستمر غير الناضج هو الذي يكتسب بشكل تفضيلي مادة موت الخلايا المبرمج مقارنة بالعاصمة الناضجة. لم يكن مصدر الخلايا المبرمجية حرجًا ، لأننا حصلنا على نتائج مماثلة مع خلايا هيلا المشععة بالأشعة فوق البنفسجية (انظر الشكل 7 ، والبيانات غير معروضة).

    للتأكد من أن اختبار FACS ® هذا كان يقيس البلعمة ، أجرينا الفحص عند 4 درجات مئوية وفي وجود مثبطات البلعمة. كلاهما درجة حرارة منخفضة (الشكل 2 ،أ) و cytochalasin D ، وهو مثبط لوظيفة الهيكل الخلوي ، يمنع الامتصاص (الشكل 2 ،ب). تتطلب البلعمة بواسطة DCs غير الناضجة أيضًا الكاتيونات ثنائية التكافؤ لأن EDTA كانت مثبطة (الشكل 2 ،ج). لتأكيد الامتصاص المرئي الذي سجلته FACS ® ، قمنا بإعداد السيتوسبينات لزراعة جوز الهند المصبوغة. تواتر الامتصاص المرتبط بتلك المقاسة على FACS ® (البيانات غير معروضة). أجرينا أيضًا التألق المناعي على المزارع المشتركة من البلدان النامية غير الناضجة المسمى بمضاد HLA-DR (الدكتور) والخلايا الوحيدة المصابة بالإنفلونزا الموصوفة بالبروتين النووي المضاد للأنفلونزا (NP) (تين. 3). في اللوحة العلوية ، تُرى خلية موت الخلايا المبرمج قبل أن يبتلعها DC (رأس السهم). بعد البلعمة ، تم العثور على خلايا موت الخلايا المبرمج في حويصلات DR + (السهام) ، ولكن ليس في السيتوبلازم.

    مستضد موجود فقط في البلدان النامية غير الناضجة من خلية موت الخلايا المبرمج في الفئة الأولى معقد التوافق النسيجي الكبير.

    قمنا بعد ذلك بربط القدرة البلعمية للبلاعم و DC مع قدرتها على عرض المواد المستضدية المشتقة من الخلايا المبرمجة. تم تحضير الخلايا من متبرعين HLA-A2.1 + (18 ، 19) ، تمت زراعتها مع HLA-A2.1 - وحيدات مصابة بالإنفلونزا لمدة 12 ساعة ، ثم تحميلها بـ Na 51 CrO4 لاستخدامها كأهداف لل CTL الخاصة بالأنفلونزا (7 ، 24). يشير التحلل النوعي إلى أن المواد المستضدية المقدمة عبر APCs والمشتقة من خلية موت الخلايا المبرمج عن طريق تكوين معقدات محددة من الببتيد- MHC من الفئة I على سطحها (الشكل 4 ،أ). كمقارنة مباشرة مع المسار الداخلي للعرض التقديمي من الفئة الأولى من معقد التوافق النسيجي الكبير ، أصيب نفس مجموعات APC بفيروس الأنفلونزا الحية واستخدمت كأهداف (الشكل 4). ب).

    على الرغم من أن DCs الناضجة كانت أهدافًا فعالة عند الإصابة بالأنفلونزا ، إلا أنها لم تكن قادرة على عرض المستضدات ، ربما لأنها قللت من القدرة على البلعمة وحيدات موت الخلايا المبرمج. ومع ذلك ، فإن البلدان النامية غير الناضجة قامت بعمل مستضدات متقاطعة من خلايا موت الخلايا المبرمج. علاوة على ذلك ، إذا تمت زراعة البلدان النامية غير الناضجة مع الخلايا المبرمجة في وجود MCM ، وهو محفز للنضج ، فإنها كانت أهدافًا أفضل. ربما يكون هذا بسبب زيادة تنظيم جزيئات الالتصاق والمُحَكِّز (13 ، 31) ، أو إلى زيادة ثبات مجمعات الببتيد - معقد التوافق النسيجي الأول. بالنظر إلى أن الامتصاص الأقصى للخلايا المبرمج بواسطة DC غير الناضج يحدث بين 2 و 4 ساعات (الشكل 1 د) ، نعتقد أن العرض المتقاطع للمواد المبرمج يعكس البلعمة ومعالجة الخلايا الأبوطوزية المبكرة بدلاً من الخلايا النخرية الثانوية (انظر المواد والطرق). فيما يتعلق بهذه المسألة ، من المهم إدراك أن الخلايا الوحيدة المصابة بالإنفلونزا تتطلب 24 ساعة للخضوع لنخر ثانوي (Albert، M.L.، N. Bhardwaj ، مراجع المعطيات غير المنشورة 25 ، 26).

    والجدير بالذكر أن الضامة التي تعمل بكفاءة على الخلايا المبرمجية البلعمية (الشكل 1 ،أ) لم يتعارض مع المستضدات إلى CTLs (الشكل 4 ب). من المفترض أن تكون المادة المبتلعة متدهورة ، وليست متقاطعة ، على معقد التوافق النسيجي الكبير I. هذا الاختلاف العميق بين سكان العاصمة والبلاعم مدعوم من خلال النتائج السابقة التي توصلنا إليها بأن البلاعم لا تتقاطع مع المستضدات من الخلايا الأبوطوزية أثناء مرحلة الاستقراء للفئة. قمت بتقييد استجابة الخلايا التائية الخاصة بمستضد معين. في الواقع ، عند وضعها في الثقافة مع DC في اختبار المنافسة ، فإنها تحبس المادة الأبوطوزية وتلغي استجابة CTL (7).

    يمكن تمييز DC غير الناضجة عن البلاعم عن طريق التعبير داخل الخلايا لـ CD83 والمظهر الفريد للمستقبلات البلعمية.

    لقد بحثنا في احتمال أن البلدان النامية غير الناضجة قد تكون خلايا موت الخلايا المبرمج البلعمية عبر مسارات متميزة عن البلاعم. لتمييز هذه الخلايا بوضوح ، قمنا بتمييزها بشكل ظاهري. تتميز DCs غير الناضجة بغياب كل من CD14 ، علامة مقيدة للبلاعم ، و CD83 ، علامة النضج لـ DC (30). لقد قمنا بتوسيع استخدام CD83 ، ووجدنا أنه يمكن تمييز DC غير الناضجة عن كل من الضامة والـ DC الناضج من خلال تعبيرها داخل الخلايا عن CD83. الضامة لا تعبر عن CD83 داخل أو خارج الخلية ، في حين أن DCs الناضجة تعبر عن CD83 داخل وخارج الخلية (الشكل 5).

    تم فحص مجموعات APC هذه للتعبير السطحي عن المستقبلات المشاركة في مادة موت الخلايا المبرمج بالبلعمة (الجدول 1). وتشمل هذه: αالخامسβ3 و CD36 ، والتي تعمل كمستقبلات لابتلاع العدلات الأبوطوزية والخلايا الليمفاوية بواسطة الضامة (32 ، 33) و CD14 ، والتي تورطت في امتصاص الخلايا المبرمج بواسطة الضامة (34). أثناء دراسة مجموعات DC غير الناضجة ، حددنا وجود تناقض في التعبير عن αالخامس و β3 وحققت سلاسل الإنتجرين في احتمال أن تكون αالخامس كان ملزمًا بسلسلة β بديلة. استخدام الأجسام المضادة التي تتعرف على حواتم مجمعة لـ αالخامسβ3 و αالخامسβ5 غير المتجانسة ، لاحظنا التعبير الانتقائي لـ αالخامسβ5 على البلدان النامية غير الناضجة (الشكل 6 ،أ). كما هو الحال بالنسبة لمعظم المستقبلات المشاركة في امتصاص المستضد (11 ، 12) ، فإن التعبير عن CD36 ، αالخامسβ5، ومستقبل مانوز في البلدان النامية يتم تنظيمه مع النضج (الشكل 6 ،ب، الجدول 1).

    لتقييم ما إذا كان يمكن ملاحظة هذا التنظيم المنخفض على مستوى تعبير mRNA ، أجرينا PCR النسخ العكسي باستخدام مواد أولية خاصة بـ β3، β5و CD36 (الشكل 6 ج). DCs غير ناضجة (ممر 1) أظهر تضخيم الحمض النووي بالحجم المناسب لـ3، β5و CD36. في المقابل ، في البلدان النامية الناضجة (حارة 2) ، لا5 وشوهد عدد أقل بكثير من تسلسلات CD36 ، بينما β3 كانت التسلسلات مماثلة لتلك الموجودة في الخلايا غير الناضجة. هذه البيانات ، على الرغم من أنها ليست كمية ، تتوافق مع مستويات التعبير البروتيني التي لاحظتها FACS ® وتشير إلى أن التعبير عن مستقبلات البلعمة في البلدان النامية يمكن تنظيمه على مستوى نسخي كتعبير مرنا عن CD36 و β5 هو downregulated أثناء النضج.

    Αالخامسβ5 و CD36 توسط البلعمة للخلايا الأبوطوزية في البلدان النامية غير الناضجة.

    لإثبات دور مباشر لـ αالخامسβ5 في التعرف على الخلايا المبرمجية بواسطة DCs غير الناضجة ، أجرينا مقايسة البلعمة FACS® في وجود الأجسام المضادة الخاصة بـ αالخامسβ5 (الشكل 7 ،أ). بالإضافة إلى الحظر الذي لوحظ باستخدام mAb إلى αالخامسβ5، تم اكتشاف الحظر أيضًا عند استخدام mAbs إلى αالخامس، β5و CD36. لم يُلاحظ الحظر عندما كانت mAbs المتطابقة مع النظائر محددة لـ β1، β3، أو مستقبل الترانسفيرين CD71. لاحظ أن أضداد التحكم المختارة مستقبلات سطحية معترف بها موجودة في DCs غير الناضجة (الشكل 7 ،أ، الجدول 1). تم اختبار mAbs بجرعات تتراوح من 10 إلى 80 ميكروغرام / مل (البيانات غير معروضة). لوحظ الحد الأقصى من تثبيط البلعمة للخلايا المبرمج باستخدام mAbs الخاص بـ CD36 ، αالخامسو β5 عند 50 ميكروغرام / مل. كان تثبيط البلعمة للخلايا المبرمج بواسطة DCs محددًا. لم نتمكن من منع امتصاص حبات اللاتكس الفلورية الحمراء ، وهي جسيمات تحكم ، بواسطة DC في وجود هذه mAbs (الشكل 7). ب). عن طريق تحليل الرسم البياني ، البلعمة DCs 1-6 جزيئات لكل خلية. mAbs إلى αالخامسβ5 أو αالخامس لم يغير ملف تعريف مخططات الرسم البياني هذه (البيانات غير معروضة).

    على الرغم من ملاحظة بعض تثبيط البلعمة عند استخدام αالخامسβ3 قد يكون هذا جزئيًا بسبب التسلل و / أو التأثير على مجموعة α المجانيةالخامس (35). على سبيل المثال ، مكافحة αالخامسβ3 تثبط الأجسام المضادة الإشارات داخل الخلايا لـ α5β1 انتجرين (36). بدلا من ذلك ، αالخامسβ3 و αالخامسβ5 قد تعمل بشكل تعاوني في البلدان النامية غير الناضجة. لذلك قمنا باختبار توليفات من مضادات ألفاالخامسβ3 وضد αالخامسβ5 لكنه لم يلاحظ زيادة في تثبيط البلعمة. كثافة مستقبلات α منخفضةالخامسβ3 على DC (متوسط ​​شدة التألق 7 ± 2 الجدول 1) يجعل من غير المحتمل أيضًا أن يكون هذا المنتج متغاير الإنتغرين متورطًا في غمر الخلايا المبرمج بواسطة البلدان النامية غير الناضجة.

    لا تستبعد بياناتنا دورًا للمستقبلات الأخرى في بلعمة الخلايا المبرمج ، على سبيل المثال ، مستقبل PS المفترض أو مستقبلات الليكتين (5). في الواقع ، من المحتمل أن تكون هناك مستقبلات أخرى متضمنة ، حيث أن الحجب المرصود لم يتجاوز 60 ٪ حتى عندما تم اختبار مجموعات من جميع mAbs ذات الصلة (البيانات غير معروضة). من غير المحتمل أن يشارك CD14 في غمر الخلايا المبرمج بواسطة DC ، لأن DC لا تعبر عن هذا المستقبل (الجدول 1). في البلاعم ، تم تثبيط البلعمة للخلايا المبرمج بواسطة الأجسام المضادة لـ αالخامس، β3، αالخامسβ3، و CD36 ولكن ليس بالأجسام المضادة لـ β1، β5أو αالخامسβ5 (البيانات غير ظاهرة). هذا يرتبط بالبيانات المنشورة (6 ، 33).


    نتائج ومناقشة

    يختلف موت الخلايا النباتية الناجم عن HS عن موت الخلايا المبرمج

    واحدة من أولى السمات المميزة لموت الخلايا المبرمج هو AVD [79 ، 80] ، يليه نزيف من الجسيمات الدقيقة ، والتجزئة النووية ، وأخيراً تفتيت الخلية إلى أجسام أبوطوزية [17]. نظرًا لأن الهدف النهائي لتفكيك الخلية هو إزالة الخلية المحتضرة بواسطة الخلايا البلعمية ، يجب أن يظل PM للخلية الأبوطوزية سليمًا طوال العملية بأكملها ، مما يمنع انسكاب محتوى الخلية المحتضرة. من الواضح إلى حد ما أن تكوين أجسام موت الخلايا المبرمج أثناء موت الخلايا النباتية لن يخدم أي غرض ، حيث تفتقر النباتات إلى الخلايا البلعمية وتبقى الخلية النباتية الميتة معزولة داخل جدار خلوي صلب [25 ، 81]. ومع ذلك ، فإن موت الخلايا النباتية الناجم عن الإجهاد اللاأحيائي أو الحيوي يكون مصحوبًا بتمزق الجسيمات و / أو الغشاء الفراغي ، مما يتسبب في أضرار جسيمة لأنظمة الغشاء الداخلي وانفصال لا رجعة فيه عن الجسيمات الدقيقة عن جدار الخلية والذي يشار إليه غالبًا بالبروتوبلاست. انكماش [11 ، 82]. تم الخلط بين هذه الظاهرة مرارًا وتكرارًا مع AVD و PM blebbing وتشكيل أجسام موت الخلايا المبرمج ، وبالتالي تم استغلالها لدعم وجود AL-PCD في النباتات [38 ، 39].

    لفحص AVD و PM blebbing والتجزئة النووية والتجزئة الخلوية في النباتات ، قمنا بتحليل مورفولوجيا خلايا التبغ BY-2 تحت ظروف HS التي تم وصفها سابقًا لتحفيز AL-PCD [48 ، 51]. تم تلوين ثقافة الخلية بصبغة حمض نووي Sytox Orange (SO) غير منفذة للخلايا لتصور الخلايا ذات سلامة الجسيمات المهترئة ومع صبغة الستريل FM4-64 لتصور أغشية الخلايا ثم تعريضها لنبض HS عند 55 درجة مئوية (ملف إضافي 1: فيديو S1).

    أظهرت الخلايا الإيجابية فقط انكماش البروتوبلاست ، مما يشير بقوة إلى الارتباط بين انخفاض حجم الخلية ونفاذية الجسيمات (الشكل 1 أ). والجدير بالذكر أن الخلايا المعالجة أصبحت إيجابية جدًا في أقرب نقطة زمنية محددة ، أي في غضون 10 دقائق من النظام المنسق ، مما يشير إلى نفاذية الجسيمات السريعة. كانت إحدى السمات البارزة للخلايا الإيجابية SO هي تكوين هياكل تشبه الحويصلة في الجانب الداخلي من PM (الشكل 1 أ ، ب). هذا التشكل غير متسق مع AVD و blebbing ، والذي يتطلب PM سليمًا علاوة على ذلك ، تتشكل فقاعات PM الأبوطوزية للخارج على سطح الخلية [45].

    التغيرات المورفولوجية الإجمالية في الخلايا النباتية المعالجة بالـ HS لا تتطابق مع السمات المميزة لموت الخلايا المبرمج. أ تم استخدام أصباغ FM4-64 و SO لتصور جميع الخلايا والخلايا ذات PM المنفصل ، على التوالي. تم تصوير خلايا BY-2 تحت ظروف تحكم (بدون HS) أو بعد 10 دقائق من HS عند 55 درجة مئوية وتم تلطيخها وفقًا للبروتوكولين الأول والثاني ، على التوالي (انظر "تلوين Sytox Orange و FM4-64"). تم إجراء المسح في غضون ساعة واحدة بعد HS. The arrows indicate PM note the PM (red dotted line) being tightly pressed to the cell wall (white dotted line) under control conditions and detached under stress conditions. ب Higher magnification of the areas indicated with arrows in أ. ج BY-2 cells expressing green fluorescent protein (GFP) fused to nuclear localization signal (NLS) were subjected to the same treatments as in أ. Images represent maximum intensity projections of z-stack scans acquired 6 h post-HS. د Quantification of nuclear area in samples shown in ج. Data from three independent experiments, with ≥ 142 cells counted per treatment. Student’s ر test, *ص < 0.005. DIC, differential interference contrast microscopy. n, nucleus. IQR, interquartile range. Scale bars, 20 μm (a, c) or 5 μm (ب)

    The PM and shrunken protoplast were additionally imaged in the time interval from 15 min to 72 h after the pulse HS (Additional file 2: Figure S1). Nevertheless, we failed to detect PM blebbing or protoplast fragmentation into discrete bodies at any time point. Furthermore, although we did observe moderate nuclear condensation upon HS, it was not followed by segmentation of the nucleus (Fig. 1c, d). In summary, the gross morphological changes of cells undergoing HS-induced cell death do not resemble apoptosis.

    PM integrity is irreversibly compromised during or shortly after pulse HS

    Intact PM is a pivotal hallmark of apoptosis [10]. However, SO staining described above suggested permeabilization of PM in most BY-2 cells already within 10 min of the HS. To investigate dynamics of the PM permeabilization, we analysed cellular content leakage after two types of HS, at 55 °C or 85 °C which were reported to induce AL-PCD or necrosis, respectively [61, 70]. The leakage of cellular content was assessed using a fluorescein diacetate (FDA)-based fluorochromatic assay [83]. In brief, the non-fluorescent FDA molecules can passively diffuse into the living cells where their acetate groups are cleaved off by esterases. The resulting fluorescein molecules have poor membrane permeability and are retained in cells with an intact PM, but are released into extracellular space upon PM permeabilization.

    We imaged BY-2 cells loaded with FDA prior to the pulse HS at 55 °C or 85 °C (Fig. 2a). Both types of HS caused rapid (within 10 min) leakage of the dye into the extracellular space (Fig. 2a). We measured the amount of fluorescein accumulated in the extracellular space immediately after the HS and found that the rate of cellular content leakage in HS-treated cells was comparable to that occurring after severe disruption of plant cells caused by freeze-thaw in liquid nitrogen (Fig. 2b).

    Both 55 °C and 85 °C HS cause instant and irreversible PM permeabilization. أ Green fluorescence in the BY-2 cells loaded with FDA. Fluorescein leaks into extracellular space within 10 min after HS at either 55 °C or 85 °C. Arrows indicate shrunken protoplasts in 55 °C HS-treated cells. ب Similar fraction of fluorescein leaks out of cells after 10 min of 55 °C, 85 °C or liquid nitrogen (N2) treatment. ج BY-2 cells stained with SO and FM4-64 to assess whether disruption of the PM integrity after pulse HS is transient or irreversible. Staining was performed for no HS, before HS or after HS treatments according to protocols i, ii and iii, respectively (see “Sytox Orange and FM4-64 staining”). The cultures were imaged within 1 h following HS. د Frequency of the SO-positive cells in the cultures shown in ج. DIC, differential interference contrast microscopy. IQR, interquartile range. أشرطة مقياس في أ و ج, 50 μm. ب Representative data from one out of three independent experiments. د Data from three independent experiments, with ≥ 115 cells counted per treatment. ب, د One-way ANOVA with Dunnet’s test *ص < 0.005

    To determine whether PM permeabilization was transient or permanent, we added SO and FM4-64 stains to the cell cultures either before or 30 min after HS. We speculated that if PM permeabilization upon HS was transient, cultures stained after HS would show a significantly lower frequency of SO staining as compared to cells stained before HS. However, SO staining before and after 55 °C or 85 °C HS showed no differences in the proportion of SO-positive cells (Fig. 2c, d), indicating that both treatments caused irreversible rapid permeabilization of PM typical for necrosis [10, 11, 84].

    The protoplast shrinkage during HS-induced cell death is ATP- and Ca 2+ -independent

    Dismantling of the apoptotic cells is ATP-dependent [42, 85]. Yet, loss of the PM integrity would lead to rapid depletion of intracellular ATP, rendering all energy-dependent processes defunct. To examine whether the HS-induced cell death requires ATP, we first imaged mitochondria after 55 °C and 85 °C HS. Already at the earliest checked time points 4–10 min after HS, under both temperatures, mitochondrial dye MitoTracker localized to aberrant structures similar to those observed after treatment with mitochondrial uncoupler and ATP synthesis inhibitor, protonophore carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) [86], indicating disruption of mitochondrial membrane potential (MMP Fig. 3a). Furthermore, intracellular ATP content dropped dramatically after both HS treatments (Fig. 3b), most probably due to dissipation of the MMP and leakage of cytoplasmic content through the permeabilized PM.

    Protoplast shrinkage at 55 °C HS is an ATP- and Ca 2+ -independent process. أ Mitochondria in BY-2 cells stained with MitoTracker Red and imaged 10 min after 55 °C or 85 °C HS, or after treatment with 48 μM CCCP under normal temperature. Severely damaged mitochondria were observed upon all three treatments. ب Loss of intracellular ATP content upon HS. Snap freeze-thaw treatment in liquid nitrogen (N2) and CCCP treatment were used as positive controls for completely disrupted and uncoupled mitochondria, respectively. The experiment was repeated twice, each time using four biological replicates per treatment. ج MitoTracker Red staining of BY-2 cells exposed to 55 °C in the presence or absence of 15 μM Cyclosporin A (CsA) reveals that inhibition of MPTP opening does not rescue mitochondria from severe damage and loss of MMP caused by HS. د MitoTracker Red localization in the cells pre-treated with 10 mM EGTA prior to the HS reveals that chelation of extracellular Ca 2+ does not rescue mitochondrial phenotype. e, f Dynamics of cell death (% SO-positive cells ه) and protoplast shrinkage (F) in cells with normal and uncoupled (48 μM CCCP treatment) mitochondria. ز, ح Pre-treatment with 10 mM EGTA before HS does not affect dynamics of cell death (% SO-positive cells ز) and protoplast shrinkage (ح). Experiments shown in e–h were repeated three times, with ≥ 184 cells per treatment and time point. Each microscopy experiment was performed at least twice. Staining for no HS and 55 °C treatments were performed according to protocols i and ii, respectively (see “Sytox Orange and FM4-64 staining”). Scale bars, 20 μm (أ) or 50 μm (c, d). IQR, interquartile range. ب, هح One-way ANOVA with Dunnet’s test *ص < 0.05

    In addition to ATP depletion, PM permeabilization would also cause entry of Ca 2+ into the cells, potentially followed by its accumulation in mitochondria. MMP-driven accumulation of Ca 2+ can trigger mitochondrial permeability transition (MPT) due to the opening of a nonspecific pore (mitochondrial permeability transition pore, MPTP) [87], which will cause arrest of ATP synthesis and production of reactive oxygen species ultimately resulting in necrotic cell death [88]. Although HS-induced plant cell death was previously suggested to be a Ca 2+ -dependent process [51], those experiments lacked controls for mitochondrial phenotype, respiration or ATP production.

    To test whether MPT plays a role in the observed mitochondrial phenotype, experiments were performed in the presence of cyclosporin A (CsA), an inhibitor of MPTP opening, or the Ca 2+ chelator ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA). Neither CsA nor EGTA could alleviate the mitochondrial phenotype in cells subjected to the HS (Fig. 3c, d), indicating that mitochondrial malfunction was caused by the direct loss of the mitochondrial membrane integrity during the HS, independently on PM permeabilization.

    Next, we examined the importance of intracellular ATP for the AVD-like protoplast shrinkage. We found that pre-treatment of the cell cultures with CCCP prior to HS had no effect on the protoplast shrinkage (Additional file 2: Figure S2), demonstrating that the protoplast shrinkage does not require ATP. Time-resolved quantitative analysis of cell death (frequency of SO-positive cells) and protoplast shrinkage upon HS of cells with normal or uncoupled mitochondria revealed that both parameters were independent of the mitochondrial bioenergetic function (Fig. 3e, f). Pre-treatment with CsA or EGTA prior to HS did not alleviate the cell death rate either (Fig. 3g, h Additional file 2: Figure S2).

    The discrepancies between our observations and the previous studies could be caused by technical issues, primarily precision of the temperature measurement during HS. To examine this possibility, we compared frequency and phenotype of cell death after treatment at 40, 45, 50 and 55 °C. Although cell viability was inversely proportional to the temperature, the morphology of dead cells in all cases was identical to that observed at 55 °C (Fig. 4). Pre-treatment of cells with CCCP confirmed that at any of the checked temperatures the rate of cell death did not depend on mitochondrial activity (Fig. 4).

    HS at the temperature range 40–55 °C induces ATP- independent cell death. أ SO staining of BY-2 cells heat-shocked for 10 min at 40, 45, 50 or 55 °C and imaged after 6 or 24 h. ب Quantification of cell death (% SO-positive cells) in the samples showed that pre-treatment with CCCP provided no protection against cell death and protoplast shrinkage at any of the tested HS temperatures. On the contrary, after prolonged exposure (24 h), CCCP appeared to decrease HS tolerance of plant cells. Staining was performed for no HS and HS treatments according to protocols i and ii, respectively (see “Sytox Orange and FM4-64 staining”). IQR, interquartile range. Experiments were repeated three times, with ≥ 134 cells per treatment and time point. The data was subjected to one-way ANOVA with Bonferroni correction. *ص < 0.05, ns, non-significant. Scale bars, 20 μm

    A recent study [89] proposed that HS at 55 °C caused ferroptosis in A. thaliana root hair cells. Therefore, we examined whether the cell death we observed in BY-2 cells under the same stress conditions could be classified as a ferroptosis. For this, BY-2 cells were treated with a ferroptosis inhibitor, Ferrostatin-1 (Fer-1), prior to HS at 55 °C and cell death rate was measured during 24 h after the stress. Treatment with Fer-1 did not alleviate the cell death (Fig. 5a, b data is shown for the first 12 h after HS). Furthermore, two independent experiments replicating conditions that were reported to induce ferroptosis in أرابيدوبسيس root hair cells [89] did not confirm such type of cell death (Fig. 5c). Taken together, our results reject the notion that HS-induced cell death is a programmed process. On the contrary, they demonstrate that HS triggers rapid destruction of cellular components and passive decay of plant cells resembling accidental necrosis.

    HS-induced cell death response is not ferroptosis. أ SO staining of BY-2 cell cultures demonstrates that pre-treatment with 1 μM Fer-1 does not affect HS-induced cell death. Staining for no HS and 55 °C treatments was performed according to protocols i and iii, respectively (see “Sytox Orange and FM4-64 staining”). ب Quantification of cell death frequency in the samples illustrated in أ. The chart shows representative results of three independent experiments, each including ≥ 280 cells per treatment and time point. ج Pre-treatment with Fer-1 does not alleviate the HS-induced death of نبات الأرابيدوبسيس thaliana root hair cells. Arrows indicate SO-positive nuclei. Three independent experiments demonstrated the same results. No quantification was performed in these experiments, since all cells were SO-positive. DIC, differential interference contrast. Scale bars, 20 μm

    Necrotic deaths caused by 55 °C or 85 °C display different cell morphologies due to a fixating effect of higher temperature

    The lack of protoplast shrinkage during cell death induced by 85 °C was used to classify it as necrosis [61, 70]. However, both 55 °C and 85 °C HS trigger instant and irreversible permeabilization of the PM, MMP dissipation, and drop in intracellular ATP content, which are hallmarks of necrosis [84]. Plausibly, morphological differences between necrotic cell deaths triggered by 55 °C and 85 °C could be explained by rapid protein denaturation occurring at 85 °C that would crosslink cellular components. Such “fixation” would prevent protoplast shrinkage. Consistent with this suggestion, high-temperature cell fixation protocols have been used as an alternative to chemical fixation [90].

    To test whether 85 °C HS acts as a fixative, we induced protoplast retraction from the cell wall by exposing stressed cell cultures to hypertonic conditions at 500 mM D-mannitol (Fig. 6a). The high osmotic pressure of the medium would induce dehydration and protoplast shrinkage in the non-fixed cells. As expected, the living cells treated with D-mannitol underwent typical plasmolysis manifested by reversible protoplast detachment from the cell wall. Cells exposed to 55 °C displayed irreversible protoplast shrinkage phenotype both with and without D-mannitol treatment. However, although cells treated at 85 °C HS exhibited visible signs of dehydration in the hypertonic solution, protoplasts of virtually all cells remained attached to the cell wall. Quantitative analysis revealed no significant changes in the protoplast area of cells treated at 85 °C HS under normal or high osmotic pressure (Fig. 6b). These data provide compelling evidence that the fixing effect of 85 °C HS prevents protoplast shrinkage. Thus, distinct phenotypes of cell deaths induced by HS at 55 °C and 85 °C do not reflect differences in the cell death execution mechanism.

    85 °C HS prevents protoplast shrinkage in necrotic cells by fixing cellular content. أ Cells stained with FDA were exposed to 55 °C or 85 °C and mounted in the normal growth medium or hypertonic medium supplemented with 500 mM D-mannitol. As expected, hypertonic medium induced plasmolysis in the non-stressed cells (No HS) and had no effect on protoplasts shrunken after 55 °C HS. Importantly, high osmotic pressure failed to induce protoplast shrinkage in cells exposed to 85 °C HS, thus confirming that cells were fixed by the high-temperature treatment. ب The extent of protoplast shrinkage upon HS followed by increased osmotic pressure was quantified as the percentage of the cell area (outlined by the white dotted line in أ) occupied by the protoplast area (outlined by the red dotted line in أ). Student’s ر اختبار، ن = 3 replicates (each replicate representing ≥ 34 cells), *ص < 0.0001, ns, non-significant. IQR, interquartile range. Scale bars, 20 μm


    أساليب

    Recombinant sRAGE protein and Rage −/− mice were used for this study.

    Identification of sRAGE by flow cytometry. Alexa Fluor 660 dye-labeled sRAGE or bovine serum albumin was added to dexamethasone-treated thymocytes. Apoptotic cells were identified using a MitoProbe JC-1 assay kit (Molecular Probes). Flow cytometry was performed on a BD FACSCanto II (BD Biosciences).

    PIP strip assay. PIP strips on which the indicated phospholipids had been spotted, were purchased from Echelon Bioscience, and dot-blot experiments were carried out according to the manufacturer's protocol.

    Surface-plasmon resonance analysis (Biacore). The binding affinity of sRAGE to phosphatidylserine was analysed using a Biacore X100 (Biacore AB) in a single-cycle affinity model. كد was calculated using كأ و كد values by a trivalent analyte model.

    FRET analysis. FRET analysis was performed as described previously (Liu et al, 2008).

    Confocal laser scanning microscopy. Alveolar macrophages were grown on coverslips and then preincubated with 5 μM NBD-phosphatidylserine liposome for 2 h, after which mRAGE was detected by indirect immunofluorescence using a rabbit polyclonal RAGE antibody (Abcam) with Alexa Fluor 647-conjugated goat rabbit IgG (Molecular Probes).

    Phagocytosis of apoptotic thymocytes. Phagocytosis was assayed by adding apoptotic thymocytes (2.5 × 10 6 cells/ml) with or without sRAGE (3 μg/ml). Phagocytosis was determined as a phagocytic index under microscopy, as described previously (Morimoto et al, 2006). Each condition was tested in duplicate, and the samples were analysed blindly and independently by two researchers (M.H. and K.M.).

    Rac1 activity assays. Rac1 activity was measured using an ELISA-based Rac1 Activation Assay Biochem Kit (G-LISA, Cytoskeleton).

    LPS-induced lung injury. LPS from الإشريكية القولونية serotype 055:B5 was obtained from Sigma-Aldrich, and the induction of lung injury was performed as described previously (Yamada et al, 2004).


    شاهد الفيديو: ТЕЛЕЖКА ИЗ СУПЕРМАРКЕТА vs ГОНОЧНЫЙ КАРТ (قد 2022).