معلومة

ما ترمز إليه M9

ما ترمز إليه M9



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل يمكن لأي شخص أن يخبرني ماذا م 9 تقف في M9 المتوسطة؟

لقد حاولت استخدام googling ولكني ما زلت لا أستطيع العثور عليه.


هندسة الإشريكية القولونية لتحويل الميثانول

تستخدم بكتيريا الميثيلوتروفيك الميثانول وغيره من المركبات أحادية الكربون المختزلة كمصدر وحيد للكربون والطاقة. لهذا الغرض ، طورت هذه البكتيريا عددًا من الإنزيمات والمسارات المتخصصة. هنا ، استخدمنا نهج البيولوجيا التركيبية لاختيار وتقديم مجموعة من "جينات methylotrophy" فيها الإشريكية القولونية مرتكز على في السيليكو الاعتبارات وتحليل توازن التدفق لتمكين تبديد الميثانول وامتصاصه. لقد قررنا أن النهج الواعد الذي يسمح باستخدام الميثانول هو تنفيذ نازع هيدروجين الميثانول المعتمد على NAD وإنشاء دورة ريبولوز أحادي الفوسفات من خلال التعبير عن جينات سينسيز هيكسيولوز -6-فوسفات (Hps) و 6-فوسفو -3. هيكسولويزوميراز (فاي). لاختبار أفضل الإنزيمات أداءً في المضيف غير المتجانسة ، تم اختيار عدد من الإنزيمات المرشحة من كائنات مانحة مختلفة وتحليلها بشكل منهجي من أجل في المختبر و في الجسم الحي الأنشطة في بكتريا قولونية. من بين هؤلاء ، Mdh2 و Hps و Phi التي نشأت من Bacillus methanolicus الأكثر فعالية. تجارب الوسم باستخدام 13 ج ميثانول مع بكتريا قولونية أظهر إنتاج هذه الإنزيمات دمج ما يصل إلى 40٪ من الميثانول في المستقلبات المركزية. وجود مسار أكسدة الفورمالديهايد المعتمد على الجلوتاثيون الداخلي بكتريا قولونية لم تؤثر سلبًا على معدل تحويل الميثانول. مجتمعة ، تمثل نتائج هذه الدراسة تقدمًا كبيرًا نحو إنشاء methylotrophs الاصطناعية عن طريق نقل الجينات.


جديد لعام 2014 و # 8211 الجيل التالي من السلسلة M.

ملاحظة المحرر: تأتي المعلومات الواردة أدناه من موقع الشركة المصنعة على الويب ومراجعتنا للآلات تتحقق من المعلومات.

الجديد 2014 M9 Life Ionizer هو إعادة تصميم كاملة ليحل محل LIFE 9100 الشهير. يرمز الحرف "M" في M-Series إلى Maximum & # 8211 و LIFE تعني ذلك! يتفوق الطراز M-9 الجديد على جميع المؤينات الأخرى:

  • مياه قلوية مع درجة حموضة تصل إلى 11.5
  • أعلى إمكانات مضادات الأكسدة التي يمكن تعديلها حتى -800 ORP
  • SMPS MAX Yield Power ™ & # 8211 يضبط ما يصل إلى 252 إلى 504 واط *

يزيد ثراء أنواع الأشجار من تخزين الكربون في النظام البيئي في الغابات شبه الاستوائية

تعد النظم الإيكولوجية للغابات جزءًا لا يتجزأ من دورة الكربون العالمية لأنها تمتص وتطلق كميات كبيرة من الكربون خلال فترات زمنية قصيرة (تدفق الكربون) أو تتراكم على مدى فترات زمنية أطول (مخزون الكربون). ومع ذلك ، لا يزال هناك عدم يقين بشأن ما إذا كانت تدفقات الكربون وفي أي اتجاه قد تختلف ، ولا سيما مخزونات الكربون ، بين الغابات ذات الثراء المرتفع مقابل الغنى بالأنواع المنخفضة. استنادًا إلى مجموعة بيانات شاملة مستمدة من القياسات الميدانية ، اختبرنا تأثير ثراء الأنواع (3-20 نوعًا من الأشجار) وعمر الوقوف (22-116 عامًا) على ستة أقسام من مخزون C فوق وتحت الأرض وأربعة مكونات من C في الغابات شبه الاستوائية في جنوب شرق الصين. عبر أكشاك الغابات ، كان إجمالي مخزون الكربون 149 ± 12 ميغاغرام هكتار -1 مع ثراء يوضح 28.5٪ والعمر يفسر 29.4٪ من التباين في هذا المقياس. تحتوي الأكشاك الغنية بالأنواع على مخزون وتدفق من الكربون أعلى من المدرجات ذات الثراء المنخفض ، بالإضافة إلى ذلك ، كان لدى المدرجات القديمة مخزون C أعلى من المدرجات الصغيرة. بشكل عام ، لكل نوع من أنواع الأشجار الإضافية ، زاد إجمالي مخزون الكربون بنسبة 6.4 ٪. تقدم نتائجنا دليلاً شاملاً على عزل C فوق وتحت الأرض بوساطة التنوع في الغابات شبه الاستوائية الغنية بالأنواع في جنوب شرق الصين. لذلك ، يجب أن تأخذ سياسات التحريج في هذه المنطقة وفي أي مكان آخر في الاعتبار التغيير من التركيز الحالي على الزراعة الأحادية إلى المزارع متعددة الأنواع لزيادة تثبيت الكربون وبالتالي إبطاء زيادة ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي.2 التركيزات والاحتباس الحراري.

الكلمات الدالة: النظام الإيكولوجي لتخزين الكربون في BEF-China يعمل على التنوع البيولوجي للغابات عريضة الأوراق دائمة الخضرة.


المواد والأساليب

المواد الكيميائية والكواشف

تم شراء جميع المواد الكيميائية والمذيبات من Sigma-Aldrich ما لم ينص على خلاف ذلك. كانت نوكليازات التقييد والإنزيمات المعدلة للحمض النووي من نيو إنجلاند بيولابس. تم استخراج بلازميد DNA باستخدام GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific). تم التعاقد من الباطن على تسلسل الحمض النووي مع شركة Eurofins SAS (Ebersberg ، ألمانيا).

البناء البلازميد

تم استخدام المتجهات pZA23 و pZA33 و pZE23 و pZS23 من Expressys & # x000AE لأنها تحفزها IPTG وتأوي هيكلًا خفيفًا من لاسي الجين الذي يقلل من حجمه (2358 إلى 3764 زوج أساس) وهي قابلة للتعديل (من السهل تغيير أصل النسخ المتماثل وعلامة المقاومة ومحفز النواقل عن طريق التقييد / الربط). في هذه الدراسة ، تم استبدال المروج PA1lac0-1 في pZA33 بالمروج التأسيسي proC والمروج المحرض Pتاك، لتوليد pZA37 و pZA36 ، على التوالي. وبالمثل ، تم استبدال المروج PA1lac0-1 لـ pZS23 بـ proD الذي يولد pZS28.

تم إجراء استنساخ الجينات باستخدام NEBuilder HIFI DNA Assembly Master Mix (NEB E2621). تتيح هذه الطريقة تجميع عدة أجزاء في خطوة واحدة. يحتوي المزيج التجاري المقدم من New England Biolabs على (أ) نوكلياز خارجي ، مما يؤدي إلى إنشاء 3 & # x02032 نهايات حبلا مفردة ، مما يسهل تجميع الأجزاء ، التي تشترك في تكامل تسلسلي (ب) بوليميراز ، يملأ الفراغات بعد الشظايا تم تجميعها و (ج) ligase ، الذي يربط الأجزاء معًا. ال E. coli kdsd، fsaA و aldA تم تضخيم الجينات من الحمض النووي للجينوم المستخرج من بكتريا قولونية K12 MG1655 بواسطة PCR باستخدام الاشعال الموصوف في الجدول S1. فتات (كدسد & # x0002B fsaA أو aldA) بواسطة تجميع HiFi & # x000AE في pZ الخطي مسبقًا مع تهجين الاشعال على جانبي MCS. تم التحقق من جميع البلازميدات بالتسلسل. البلازميدات الناتجة تحمل kdsd و fsaA و aldA تم الإبلاغ عن الجينات في الجدول 2.

الجدول 2. استخدمت أو شيدت البلازميدات في هذه الدراسة.

سلالة البناء والتحول

ال بكتريا قولونية يتم سرد السلالات المستخدمة في هذا العمل في الجدول 3. حذف الجينات (أي ، glcD ، fucA ، mgsA ، pfkA ، ptsG) عن طريق التوصيل باستخدام فج P1vir. تم إجراء تحضير lysates P1vir وإجراءات التوصيل كما هو موضح في Bremer et al. (1984) مع تعديلات طفيفة. سلالات (سلالة مانحة) من مجموعة KEIO (Murakami et al. ، 2007) تحمل حذفًا واحدًا وتم تلقيح كاسيت مقاوم للمضادات الحيوية كانامايسين (200 & # x003BCl من زراعة مسبقة ليلية مصنوعة في LB) في 5 مل من LB تحتوي على 0.2 ٪ D- الجلوكوز و 5 ملي كلوريد الكالسيوم2 لمدة 30 دقيقة عند 37 & # x000B0C. بعد ذلك ، تمت إضافة 100 & # x003BCl من P1vir lysate (& # x0007E 5 & # x000D7 10 8 phages / ml) إلى كل ثقافة متبرع واحتضانها عند 37 & # x000B0C لمدة 2 إلى 3 ساعات حتى أصبحت الثقافة واضحة وكانت الخلايا خالية تمامًا ليسيد (بابا وآخرون ، 2006). تم استرداد المحللات بالترشيح باستخدام مرشحات حقنة معقمة مقاس 25 مم مع غشاء دعم 0.2 & # x003BCm (Pall) وحفظها عند 4 & # x000B0C. لحذف الجين المعني ، تم إصابة السلالة المستقبلة بـ P1vir تحمل كاسيت حذف الجين المانح الذي يحتوي على مقاومة كانامايسين. لهذا الغرض ، تمت زراعة السلالة المستقبلة مسبقًا في وسط 5 مل LB عند 37 & # x000B0C ، تم جمعها بالطرد المركزي عند 1500 جم لمدة 10 دقائق وإعادة تعليقها في 1.5 مل من 10 ملي MgSO4 و 5 ملي كاكل2. تمت إضافة P1vir Lysate الذي يحمل كاسيت حذف الجينات من سلالة المتبرع (0.1 مل) إلى تعليق السلالة المستقبلة وحضنت لمدة 30 دقيقة عند 37 & # x000B0 درجة مئوية. بعد ذلك ، تمت إضافة 0.1 مل من 1 مولار من سترات الصوديوم ، ثم 1 مل رطل ، وتم تحضين هذا المعلق الخلوي لمدة ساعة واحدة عند 37 & # x000B0 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة قبل أن ينتشر على وسط LB صلب مع المضاد الحيوي المناسب. تم فحص المستعمرات بواسطة PCR لعزل أحداث التنبيغ الناجحة. تمت إزالة شريط المضاد الحيوي عن طريق تحويل سلالات البكتيريا مع pCP20 بلازميد يحمل FLP recombinase ، متبوعًا بفحص PCR.

الجدول 3. بكتريا قولونية السلالات المستخدمة والمبنية في هذا العمل.

تم تحضير السلالات غير التجارية المختصة وفقًا لبروتوكول Chung et al. (1989) مع تعديلات طفيفة على النحو التالي. تم عمل ثقافة مسبقة بين عشية وضحاها في LB بين عشية وضحاها. ثم تم تلقيح ثقافة LB الطازجة بالخلايا عند DO600 من 0.1. عندما تفعل600 يصل إلى حوالي 0.5 ، تم جمع 2 مل من المزرعة وتم تعليق الحبيبات الناتجة في محلول TSS 300 & # x003BCl [2.5٪(ث / ت) بيج 3350 ، 1 مجم مغكل2, 5%(المجلد / المجلد) DMSO]. بعد 10 دقائق على الجليد ، تمت إضافة البلازميد المعني إلى معلق الخلية ، والذي تم تحضينه لمدة 30 دقيقة على الجليد. تبعت هذه الخطوة صدمة حرارية عند 42 & # x000B0C لمدة 90 ثانية. تم وضع الخلايا المحولة على الجليد لمدة 10 دقائق ثم تمت إضافة 400 & # x003BCl LB وحضنت الثقافة عند 200 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 30 & # x000B0 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي عند 8000 دورة في الدقيقة لمدة 2.5 دقيقة ، تم تعليق حبيبات الخلية في 600 & # x003BCl من LB و 150 & # x003BCl تم نشرها على ألواح LB صلبة مع المضاد الحيوي المناسب.

شروط الثقافات

بالنسبة لتقنيات البيولوجيا الجزيئية ، تمت زراعة سلالات البكتيريا في وسط LB (10 جم / لتر من التربتون ، 5 جم / لتر مستخلصات الخميرة و 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم) ، وأضيف 5 جم / لتر أجار للوسط الصلب في أطباق بتري. لإنتاج GA ، تم استخدام الوسط المعدني M9. ما لم يُذكر خلاف ذلك ، فهو يحتوي على كل لتر: 18 جم Na2 HPO 4 * 12H2O ، 3 جرام KH2ص4، 0.5 جم كلوريد الصوديوم ، 2 جم NH4Cl ، 0.5 جم MgSO 4 * 7H2O ، 0.015 كاكل 2 * 2 ح2O ، 1 مل من 0.06 M FeCl3 من محلول مخزون 1000 & # x000D7 في حمض الهيدروكلوريك المركز ، 2 مل من 10 ملي مولار من محلول ثيامين حمض الهيدروكلوريك ، 20 جم MOPS ، و 1 مل من محلول العناصر النزرة (1000 & # x000D7 محلول 0.5 جم Na2EDTA & # x0002A 2H2O ، 0.18 جم CoCl 2 * 6H2O ، 0.18 جم ZnSO 4 * 7H2O ، 0.4 جم Na2 MoO 4 * 2H2O ، 0.1 جم ح3بو3، 0.12 جم MnSO 4 * H.2O ، 0.12 جم كلوريد الصوديوم2 & # x000D7 ح2س). تمت إضافة مصدر الكربون D-glucose أو L-arabinose أو D-xylose بتركيز نهائي قدره 10 جم / لتر ، وتم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7 مع حمض 3- (N-morpholino) بروبان سلفونيك (MOPS) ثم تعقيم المرشح من خلال أغشية 0.2 & # x003BCm. تمت إضافة المضادات الحيوية الأمبيسلين والكاناميسين والكلورامفينيكول عند الحاجة بتركيزات 100 و 50 و 25 مجم / لتر على التوالي. بالنسبة إلى بكتريا قولونية سلالات معيبة في نشاط ترانسكيتولاز (& # x00394tktA & # x00394tktB) ، تم استكمال وسط M9 بـ 500 & # x003BCM L-phenylalanine و 250 & # x003BCM L-tyrosine و 200 & # x003BCM L-tryptophan و 6 & # x003BCM p-aminobenzoate و 6 & # x003BCM p-hydroxydenzoate و 280 & # شيكيمات x003BCM # وتتبع LB (20٪ الخامس / الخامس). بالنسبة للسلالات المعيبة في نشاط نازعة الهيدروجين glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (& # x00394فجوة) ، تم إكمال وسيط M9 بـ 0.4 جم / لتر من حمض الماليك المعدل عند الرقم الهيدروجيني 7 باستخدام KOH. عند الحاجة ، تمت إضافة المضادات الحيوية المناسبة إلى الوسط عند 100 & # x003BCg / مل للأمبيسيلين ، 50 & # x003BCg / مل للكاناميسين ، أو 25 & # x003BCg / مل للكلورامفينيكول. تم وضع مزارع البكتريا في شاكر دوار عند 200 دورة في الدقيقة وعند 37 & # x000B0 درجة مئوية. تمت مراقبة النمو عن طريق قياس الامتصاصية عند 600 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي (Biochrom Libra S11).

إنتاج الإنزيمات وتنقيتها وفحوصاتها

ال kdsd ، fsaA، و aldA تم تضخيم الجينات باستخدام الاشعال في الجدول S1 واستنساخها في ناقل التعبير pET28a (Novagen). ال بكتريا قولونية تم تلقيح سلالة BL21 (DE3) المحولة بالبلازميد الحامل لهذه الجينات من ثقافة مسبقة مصنوعة في LB-kanamycin (50 مجم / لتر) في 200 مل من LB-Kanamycin عند 600 نانومتر (DO600) من 0.1 عند 16 & # x000B0C في شاكر دوار عند 200 دورة في الدقيقة. عندما تفعل600 عند الوصول إلى 0.6 & # x020130.8 ، تم إحداث تعبير عن البروتين المطلوب عن طريق إضافة IPTG بتركيز نهائي 1 ملي مولار 1 ملي مولار IPTG. بعد 16 ساعة عند 16 & # x000B0C ، تم جمع الثقافة بالطرد المركزي عند 4800 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 4 & # x000B0C. تم إعادة تعليق بيليه الخلية في محلول غسيل 1.5 مل (50 ملي مولار HEPES ، ودرجة الحموضة 7.5 0.3 مول كلوريد الصوديوم) وصوتها أربع مرات (30 ثانية لكل منهما) عند 30٪ من الطاقة على الجليد. تمت تنقية البروتينات التي تحمل علامات HIS باستخدام راتنج الكوبالت وفقًا للبروتوكول الموضح في المجموعة التجارية (Clontech). تم التحقق من تنقية البروتين بواسطة الرحلان الكهربائي SDS-PAGE وتم قياس تركيز البروتين بطريقة برادفورد (برادفورد ، 1976)

تم إجراء فحوصات الإنزيمات في Tris-Cl ، 100 ملي درجة الحموضة 7.5 / 10 ملي MgCl2 المخزن المؤقت عند 37 & # x000B0C. ما لم يذكر خلاف ذلك ، تم قياس نشاط KdsD في اختبار مقترن في وجود 3 ملي مولار NAD & # x0002B و 5 ملي مولار D-Ribu-5P مع 10 & # x003BCg / مل لكل من FsaA و AldA. تم قياس FSA عن طريق اقتران GAP الناتج من انشقاق 3 ملي مولار Ara5P مع أكسدة 0.2 ملي مولار NADH عند 340 نانومتر في وجود 1 وحدة / مل من ثلاثي إيزوميراز وجليسيرول -3-ف ديهيدروجينيز. تم قياس AldA في نفس المخزن المؤقت عن طريق تقليل NAD & # x0002B (3 مم) عند 340 نانومتر في وجود 5 ملي جلايكول ألدهيد.

الطرق التحليلية

تم تحديد المستقلبات خارج الخلية بواسطة كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) باستخدام كروماتوجراف Ultimate 3000 (Dionex ، Sunnyvale ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تجهيز نظام HPLC بعمود التبادل الكاتيوني (Aminex ، HPX87H 300 & # x000D7 7.8 mm ، 9 & # x003BCm ، BioRad) ، حاقن تلقائي (WPS-3000RS ، Dionex) ، كاشف الأشعة تحت الحمراء (RID 10A ، Shimadzu) و كاشف للأشعة فوق البنفسجية (SPD-20A ، شيمادزو). كان حجم حقن العينة 20 & # x003BCL ، وتم فصل المركبات في عمود Aminex HPX-87H محمي بواسطة عمود ما قبل Micro-Guard Cation H (BioRad ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء الفصل عند 35 & # x000B0C مع 1.25 ملي مولار H.2وبالتالي4 عند 0.5 مل دقيقة & # x022121 كمرحلة متنقلة. تم طرد جميع العينات (دقيقتان عند 10000 جم) وترشيحها بواسطة حقنة (0.2 & # x003BCm) ، وتم الاحتفاظ بالمادة الطافية الناتجة عند & # x0221220 & # x000B0C حتى التحليل.

نمذجة مقياس الجينوم وتحليل توازن التدفق

مقياس الجينوم iJO1366 بكتريا قولونية تم تكييف النموذج (Orth et al. ، 2011) لمحاكاة إنتاج GA من خلال مسار glycoptimus. والجدير بالذكر أن ملف fsaA تمت إضافة التفاعل إلى النموذج للسماح بتحويل Arabinose-5P إلى glyceraldehyde-3P و glycolaldehyde. تم إجراء تحليلات توازن التدفق الشحيح (pFBA) باستخدام برنامج OptFlux (Rocha et al. ، 2010) ، باستخدام إما D-glucose أو L-arabinose أو D-xylose كمصدر للكربون. لكل محاكاة ، تم ضبط معدل امتصاص مصدر الكربون بشكل تعسفي عند 10 مليمول. g CDW - 1 .h & # x022121. تم ضبط الصيانة المرتبطة بعدم النمو عند 3.15 ملمولATP. g CDW - 1.h & # x022121 ، والتفاعلات المتضمنة في نظام نقل الإلكترون مقيدة لمحاكاة نسبة P / O واقعية ، كما هو موضح سابقًا (Orth وآخرون ، 2011). تم إجراء عمليات محاكاة pFBA باستخدام تصدير GA كوظيفة موضوعية لتحقيق أقصى قدر.

أساليب إحصائية

تم إجراء التحليلات الإحصائية في Microsoft Excel & # x000AE باستخدام حزمة Analysis ToolPak. ثنائي الذيل غير زوجي ر- كان الاختبار يستخدم لمقارنة مستويات الحث التألق ، حيث كان مستوى ألفا من ص تم تعيين & # x0003C 0.05 للدلالة.


معلومات الكاتب

ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي: Yuxin Chen و Yuanyuan Huang.

الانتماءات

قسم البيولوجيا التطورية والدراسات البيئية ، جامعة زيورخ ، زيورخ ، سويسرا

يوكسين تشين ويوانيوان هوانغ وباسكال إيه نيكلاوس وأمب نادية كاسترو-إيزاغيري

المختبر الرئيسي للنظم البيئية الساحلية والرطبة (وزارة التعليم) ، كلية البيئة وعلم البيئة ، جامعة شيامن ، شيامن ، الصين

كلية علوم الحياة / مختبر مفتاح الولاية للمكافحة الحيوية ، جامعة صن يات صن ، قوانغتشو ، الصين

قسم التنوع الفسيولوجي ، مركز هيلمهولتز للبحوث البيئية (UFZ) ، لايبزيغ ، ألمانيا

المركز الألماني لبحوث التنوع البيولوجي التكاملي (iDiv) هالي- جينا- لايبزيغ ، لايبزيغ ، ألمانيا

آدم توماس كلارك وأمبير هيلج برويلهيد

جامعة مارتن لوثر هالي-فيتنبرغ ، هاله (سال) ، ألمانيا

مختبر مفتاح الدولة للنباتات والتغير البيئي ، معهد علم النبات ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، بكين ، الصين

قسم الجغرافيا ، جامعة زيورخ ، زيورخ ، سويسرا

معهد الإيكولوجيا ، كلية العلوم الحضرية والبيئية ، جامعة بكين ، بكين ، الصين

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

ي. و ب. تصور الدراسة. ي. و أ. طور الإجراء التحليلي. ي. أجرى التحليلات بمساهمات من Y.H. و ب. H.B.، N.C.-I.، Y.C.، K.M.، Y.H.، P.A.N. و ب. ساهم في جمع البيانات. ناقش جميع المؤلفين نتائج التحليل وساعدوا في كتابة الورقة.

المؤلف المراسل


مناقشة

إن فهم كيفية ارتباط البنية النانوية للأنظمة البيولوجية بالوظيفة يمثل تحديًا مستمرًا. تتمثل إحدى الصعوبات في أن عددًا قليلاً فقط من المجسات قادرة على استجواب البنية بشكل مباشر على هذا النطاق: الإلكترونات والأشعة السينية والنيوترونات. تمتعت الإلكترونات بأوسع تطبيق في بيولوجيا الخلية ، ولا تزال EM أقوى أداة منفردة لدراسة البنية التحتية الخلوية الدقيقة. بالنظر إلى ب. الرقيقة الغشاء ، دراسة بالتبريد الكهرومغناطيسي للخلايا المقطعة والمستبدلة بالتجميد ، قدمت صورة مذهلة عن العمارة الخلوية ، بما في ذلك جدار الخلية. ومع ذلك ، لم يتم تحديد بنية غشاء البلازما بشكل جيد ، وقدر سمكها بـ 66 ± 8 Å ، وهي قيمة كبيرة بشكل مدهش. تكمل نتائجنا هذه الصورة EM لمغلف الخلية من خلال توفير تحديد عالي الدقة لسمك مسعور تم الحصول عليه في ظل الظروف الفسيولوجية.

تم استخدام نثر الأشعة السينية والنيوترونات على نطاق واسع لدراسة بنية الأغشية النموذجية المكونة من مخاليط دهنية محددة [3-5،28،29،46] أو مستخلصات دهنية طبيعية. [6-12] تم أيضًا تشتت الأشعة السينية. تم استخدامه مؤخرًا للدراسة خارج الجسم الحي للأغشية الخلوية ، [6] ولكن تطبيقه على الخلايا السليمة مرتبك بسبب مسألة تشتت الخلفية من الماء والجزيئات الحيوية. يوفر نثر النيوترونات بشكل فريد حلاً لمشكلة الخلفية في شكل تباين تباين نظيري. لقد أظهرنا هنا أن تباين التباين في الجسم الحي من خلال وضع العلامات الأيضية يمكن أن يقمع بشكل فعال التشتت من البيئة الخلوية المعقدة ، مع إبراز ميزات معينة مهمة ، حتى عندما تنشأ من مكونات ثانوية مثل الدهون (حوالي 1 ٪ من الكتلة الخلوية الرطبة). علاوة على ذلك ، فإن النيوترونات الباردة المستخدمة في تجارب التشتت مناسبة تمامًا للدراسات على الخلايا الحية بسبب طاقتها الحركية المنخفضة (& lt0.025 eV) وطابعها غير المؤين - على عكس الأشعة السينية عالية الطاقة وحزم الإلكترون (& GT5000) eV).

اعتمدت التطبيقات السابقة للنثر النيوتروني في الجسم الحي على تباين المذيبات الخارجية ، والذي كان كافياً في بعض الحالات لملاحظة تشتت براج من الهياكل المتكررة في أغشية الثايلاكويد والميتوكوندريا. لم تكشف هذه الدراسات عن بنية الغشاء بحد ذاتها ، ولكنها قدمت معلومات عن ترتيب الأغشية المعبأة بشكل وثيق. من خلال إنشاء تباين داخلي ، أي عن طريق وضع علامات تفاضلية على مكونات خلوية محددة ، قمنا ، لأول مرة بتمكين قياسات البنية التحتية عالية الدقة على غشاء واحد. في هذا العمل ، أظهرنا قوة النهج القائم على البيولوجيا الكيميائية لخلق تباين داخلي انتقائي ، وبالتالي تمكين قياسات عالية الدقة لسمك الغشاء في الجسم الحي.

يوفر نهج تباين التباين في الجسم الحي أيضًا أداة جديدة لدراسة بنية الغشاء الجانبي في الخلايا الحية. توفر الطرق الهيكلية القائمة على النيوترونات مزايا واضحة من حيث أنها تبلغ عن بنية الدهون النانوية بشكل مباشر ، دون الحاجة إلى نماذج أو تحقيقات خارجية. ظهرت مؤشرات الخلط غير المنتظم [60،61] داخل غشاء البلازما بالتزامن مع النموذج الفسيفسائي المائع المقترح في عام 1972 ، [16] أصبح مفهوم المجالات الغشائية راسخًا بحلول منتصف السبعينيات ، [62] وطوافة الدهون تمت صياغة الفرضية في عام 1997. [21] ومع ذلك ، ظل وجود المجالات الدهنية مثيرًا للجدل ، [63] ولأنه يُعتقد أنها عابرة وأصغر من حد الانعراج للضوء (200 نانومتر) ، فقد استعصت على الملاحظة بالتقنيات المجهرية التقليدية. في الآونة الأخيرة ، ومع ذلك ، تم استخدام مجهر مضان فائق الدقة لتحديد الجزر المقيدة انتشارًا بمقياس 20 نانومتر في غشاء البلازما للخلايا الظهارية لكلية الفئران. ملاحظتنا لفصل الدهون على نطاق مماثل في غشاء البلازما ب. الرقيقة يتوافق مع وجود مجالات شحمية مماثلة في البكتيريا ويدعم فكرة أن تجمعات الدهون النانوية هي سمة متكاملة للأغشية البيولوجية.

كان الحاجز الحرج الذي منع تطبيق تقنيات تشتت النيوترونات عالية الدقة في الجسم الحي هو الافتقار إلى وسيلة لخلق تباين داخلي. في هذا العمل ، تغلبنا على الحاجز وأظهرنا ذلك ب. الرقيقة هو نظام نموذجي مثالي في الجسم الحي لتطبيق استراتيجيات اختلاف التباين النيوتروني. من خلال ظروف نمو محددة وأنماط وراثية محددة ، تمكنا من تخفيف التباين الخلوي عالميًا وإعادة إدخال التباين في الغشاء بدقة. مع القدرة على التحكم في كل من الخصائص الكيميائية والنظيرية لدهون الغشاء ، تمكنا من استجواب بنية الغشاء العرضي والجانبي. يمكن أن يمتد نفس النهج العام للتباين الانتقائي إلى جزيئات حيوية أخرى وكائنات نموذجية للتطبيقات خارج مجال الغشاء. على الفور ، يمكن استخدام المنصة التجريبية في الجسم الحي للتحقيق في استجابة غشاء البلازما لمجموعة متنوعة من المحفزات الفيزيائية والكيميائية والجينية والبيئية. نتوقع أن هذه القدرة ستثبت بالتالي قيمتها في العديد من المجالات ، مثل تطوير المضادات الحيوية ، وإنتاج الوقود الحيوي ، ووظيفة بروتين الغشاء ، وفهم التفاعل بين الغشاء والهيكل الخلوي وجدار الخلية في إنشاء واجهة واقية وقابلة للتكيف ومتعددة الوظائف.


وسائل الإعلام LB

LB هو أكثر الوسائط شيوعًا المستخدمة في نمو المؤتلف الإشريكية القولونية (بكتريا قولونية). تم تسمية وسائل الإعلام LB من قبل جوزيبي بيرتاني باسم "مرق ليسوجيني" بسبب البحث الذي كان يجري حول اللايسوجيني. يُشار عادةً إلى LB بشكل غير صحيح إلى وسائط Luria-Bertani أو Luria Broth أو Lennox Broth. تُستخدم وسائط LB أيضًا في استنبات مجموعة متنوعة من الكائنات الاختيارية الأخرى.

مكونات وسائط LB

أحد أسباب استخدام LB بشكل شائع هو أنه سهل التحضير ، مع القليل من المكونات ، التربتون ، مستخلص الخميرة ، وكلوريد الصوديوم (NaCl). التربتون ، خليط من الببتيدات الناتجة عن هضم الكازين مع إنزيم البنكرياس التربسين ، يوفر النيتروجين والكربون. يوفر مستخلص الخميرة الفيتامينات (بما في ذلك فيتامينات ب) وبعض العناصر النزرة. يوفر كلوريد الصوديوم أيونات الصوديوم للنقل والتوازن الأسموزي. بكتريا قولونية مشتق من سلالة K-12 ، وهي إحدى السلالات الأبوية الأكثر استخدامًا بكتريا قولونية المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية اليوم تعاني من نقص في إنتاج فيتامين ب.

الخلفية التاريخية لـ LB

LB هو وسيط غني من الناحية التغذوية تم استخدامه منذ الخمسينيات من القرن الماضي لاستنبات البكتيريا المعوية ومقايسات البلاك العاثية. يسمح LB بالنمو السريع مع غلات نمو جيدة للعديد من الأنواع. في عام 1951 ، طور جوزيبي بيرتاني LB لتحسين تشكيل البلاك في a شيغيلا سلالة المؤشر من Enterobacteriaceae. اليوم ، تعد وسائط LB أكثر الوسائط شيوعًا لنمو سلالات المؤتلف بكتريا قولونية. هناك ثلاث تركيبات شائعة من LB: LB Miller و LB Lennox و LB Luria. يشار إليها أحيانًا باسم LB ، على الرغم من أن صيغة LB Miller هي الصيغة الشائعة أو الأكثر قياسية لـ LB. تختلف الصيغ البديلة لـ LB في تركيز كلوريد الصوديوم (الجدول 1).

الجدول 1. تركيبات LB.

مكونات % لوريا (جم / لتر) لينوكس (جم / لتر) ميلر (جم / لتر)
تريبتون 1.0% 10 10 10
خلاصة الخميرة 0.5% 5 5 5
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) 0.05 أو 0.5 أو 1.0٪ 0.5 5 10

يمكن فهم الالتباس حول اسم LB نظرًا لتاريخ Bertani و Luria و Lennox. كان جوزيبي بيرتاني عضوًا في مختبر Luria بجامعة إنديانا عندما صاغ وسائط LB. كان Ed Lennox أيضًا عضوًا في مختبر Luria وعمل مع Bertani في بعض تجارب lysogeny المبكرة باستخدام شيغيلا. نشر سلفادور لوريا ورقة في عام 1955 قام فيها بنسخ الصيغة الأصلية لبيرتاني و LB يُنسب أحيانًا بشكل غير صحيح إلى لوريا بسبب مكانته العلمية ، وبالتالي يمكن أيضًا الإشارة إليه بشكل غير صحيح باسم Luria Broth. كانت تركيبة بيرتاني الأصلية 1.0٪ باكتو تريبتون (10.0 جم / لتر) ، 0.5٪ مستخلص الخميرة (5.0 جم / لتر) ، 1.0٪ كلوريد الصوديوم (10.0 جم / لتر) ، 0.1٪ جلوكوز (1.0 جم / لتر) درجة حموضة معدلة إلى 7.0. مع 1 N هيدروكسيد الصوديوم. تمت إضافة الجلوكوز بعد التعقيم. بمرور الوقت ، انخفضت إضافة الجلوكوز من جميع تركيبات LB. يأتي اسم ميلر من الصيغة الواردة في الكتاب تجارب في البيولوجيا الجزيئية بواسطة Jeffery Miller ، نُشر عام 1972 ، والذي لا يحتوي على الجلوكوز. تحتوي الصيغة الأصلية والأكثر شيوعًا لـ LB ، Miller ، على 1.0 ٪ NaCl. في عام 1955 ، كان إد لينوكس يدرس آليات تخليق الحمض النووي باستخدام سلالات بكتريا قولونية حساسة للإجهاد التناضحي طورت تركيبة من LB تحتوي على نصف ملح الصيغة الأصلية ، أي 0.5٪ كلوريد الصوديوم. يشار إلى هذه الصيغة باسم LB Lennox. اليوم ، يستخدم LB Lennox لزراعة بكتريا قولونية عند استخدام المضادات الحيوية الحساسة للملح مثل Blasticidin و Puromycin و Zeocin. يشار إلى الصيغة الثالثة من LB ، التي تحتوي على أقل كمية من الملح ، باسم LB Luria. تحتوي هذه التركيبة على 0.05٪ كلوريد الصوديوم. يستخدم LB Luria لعزل الكائنات البحرية مثل ضمة الكوليرا.

آليات النمو في LB

تم تصميم وسائط LB في الأصل لنمو البكتيريا بكثافات منخفضة. يُقدر النمو الأسي ، وهو فترة من النمو المطرد للدولة ، عند الانتهاء من التطوير التنظيمي600 (الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر) بين 0.6 و 1.0. ومن المعروف أن نمو بكتريا قولونية في LB عادة ما يتوقف عند OD600 تصل إلى 2.0 تقريبًا في ظل ظروف النمو الطبيعية ، والتي تقابل حوالي 0.6 مجم بكتريا قولونية (الوزن الجاف) لكل مل. في عام 2007 ، أجرى D'Ari وزملاؤه دراسة شاملة لخصائص النمو في LB ، مع النظر على وجه التحديد في فسيولوجيا بكتريا قولونية K-12 ، أحد السلالات الأكثر شيوعًا المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية اليوم. لقد أظهروا أن خلايا K-12 نمت في LB Miller مع OD نهائي600 من 0.6 إلى 1.0 ليسوا دائمًا في نفس الحالة الفسيولوجية. أكد D’Ari وزملاؤه في العمل الملاحظات السابقة للنمو diauxic (النمو على مرحلتين) في LB ولاحظوا أن النمو الأسي توقف عند

التطوير التنظيمي600 0.3 ، في وقت أبكر بكثير مما كان يعتقد عادة. ومن المعروف أن بكتريا قولونية من المعروف أن النمو ضعيف عندما يتجاوز الرقم الهيدروجيني 9.0 ، وليس من غير المألوف أن تتغير وسائط LB إلى درجة حموضة قريبة من 9.0. ومع ذلك ، عندما قام D'Ari وزملاؤه في العمل بتعديل الرقم الهيدروجيني لـ LB ، لم يكن هناك أي تأثير على منحنى النمو ، بينما عند إضافة الجلوكوز إلى الوسائط ، يمكن أن تنمو الثقافات إلى OD600 6.49. هذا يشير إلى أن نمو بكتريا قولونية في LB محدودة الكربون. كما لوحظ ، احتوت التركيبة الأصلية لـ LB بواسطة برتاني على 0.1٪ جلوكوز. يوضح هذا البحث أنه في حين أن LB هو وسيط جيد للنمو الروتيني ، لا ينبغي استخدامه للدراسات الفسيولوجية حيث يلزم التكاثر وفترة طويلة من النمو الأسي.

LB والاختيار

هناك مجموعة من الإضافات التي يمكن إضافتها إلى وسط LB لتحديد أو اختيار مجموعة من الكائنات الحية. غالبًا ما تضاف المضادات الحيوية إلى وسط LB لاختيار الخلايا التي تم تصميمها لتكون لديها مقاومة لواحد أو أكثر من المضادات الحيوية. يمكن إضافة X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) أو Bluo-Gal (indolyl-β-galactoside المهلجن) إلى وسط LB للفحص الأزرق والأبيض لإدخال التسلسل في موقع استنساخ متعدد (MCS) في بلازميد يحتوي على جزء α من جين β-galactosidase. للحث على التعبير عن الجينات التي يتحكم فيها محفز اللاكتوز ، يتم إضافة IPTG التناظري اللاكتوز غير القابل للاستقلاب (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) إلى الوسط. في البكتيريا التي لا يوجد فيها تسلسل يتم إدخاله في مستعمرات MCS البلازميدية ، سيكون لونها أزرق حيث سيتم شق X-Gal أو Bluo-Gal بواسطة β-galactosidase لتشكيل 5-برومو-4-كلورو-إندوكسيل. بالنسبة للبلازميدات حيث يوجد إدخال ، لن يكون هناك β-galactosidase وظيفي وستظل المستعمرات بيضاء.


يؤدي الاضطراب المتبادل من قبل نملة غازية إلى تقليل تثبيت الكربون لنبات النمل التأسيسي في شرق إفريقيا

يشكل النمل الغازي تجمعات وتفاعلات الأنواع المحلية ، لكن تأثيرها على العمليات البيئية الأساسية غير مفهوم جيدًا. في شرق إفريقيا ، فيدول ميجاسيفالا لقد غزا النمل مواقف أحادية السيادة لشجرة النمل أكاسيا دريبانولوبيوم، واستئصال المدافعين عن النمل الأصليين وجعل الأشجار عرضة لتلف المظلة من قبل الحيوانات العاشبة الفقارية. استخدمنا التجارب والملاحظات لتحديد التأثيرات المباشرة والتفاعلية للنمل الغازي والحيوانات العاشبة الكبيرة A. دريبانولوبيوم التمثيل الضوئي على مدار عامين. أظهرت الأشجار التي تم غزوها لمدة 5 سنوات انخفاضًا بنسبة 69 ٪ في التمثيل الضوئي للشجرة بأكملها خلال مواسم النمو الرئيسية ، الناتجة عن التفاعل بين النمل الغازي والحيوانات العاشبة الفقارية التي تسببت في انخفاض التمثيل الضوئي على مستوى الأوراق والظلة. قمنا أيضًا بمسح الأشجار قبل الغزو وبعده بفترة وجيزة ، ووجدنا أن الغزو الأخير تسبب فقط في تغييرات طفيفة في فسيولوجيا الأوراق. من المحتمل أن تتزايد نتائجنا من الأشجار الفردية ، مما يسلط الضوء على إمكانات الأنواع الغازية لتغيير تثبيت الكربون على مستوى النظام الإيكولوجي وغيرها من الدورات البيوجيوكيميائية.


ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي: فرناندا بينيرو وعمر وارسي.

الانتماءات

معهد الفيزياء البيولوجية ، جامعة كولون ، كولون ، ألمانيا

فرناندا بينيرو وأمبير مايكل لاسيج

قسم الكيمياء الحيوية الطبية وعلم الأحياء الدقيقة ، جامعة أوبسالا ، أوبسالا ، السويد

عمر وارسي وأمب دان آي أندرسون

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

شارك جميع المؤلفين في التحقيق وكتابة المسودة الأصلية ومراجعة وتحرير المخطوطة النهائية.

المؤلفون المراسلون


شكر وتقدير

نشكر J.R. Luque-Ortega للمساعدة في تجارب امتصاص الأكسجين. نشكر M. Abrahams و M. Mo و S. Burning على القراءة النقدية للمخطوطة. JN ممتن لـ T. Conrad لمساعدتكم أثناء الإقامة في سان دييغو و E. Díaz و MA Prieto لمساعدتهم القيمة واقتراحهم أثناء إعادة بناء التمثيل الغذائي. JN هي الحاصلة على زمالة I3P لما قبل الدكتوراه من Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) و JN stay في سان دييغو مدعومة بزمالة I3P قصيرة المدى.


شاهد الفيديو: DIY - Как сделать ШТЫК НОЖ BAYONET M9 из бумаги а4 своими руками (أغسطس 2022).