معلومة

هل هناك مقياس تقارب ملزم للتفاعلات غير المتوازنة؟

هل هناك مقياس تقارب ملزم للتفاعلات غير المتوازنة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقوم بدراسة قوة ارتباط الببتيد الصغير بالبروتين عن طريق عزل النسخة المرتبطة وتعريضها للتصادم مع جزيئات الغاز (مطياف الكتلة CID) لفصل المركب. عندما أرسم طاقة الاصطدام مقابل نسبة البروتينات المقيدة وغير المرتبطة ، أحصل على منحنى يشبه Kد منحنى. ومع ذلك ، نظرًا لأن التفاعل ليس في حالة توازن (أي أنه في مرحلة الغاز) حساب K.د لن تكون القيمة صحيحة.

إذن ، هل هناك قيمة أخرى يمكنني حسابها لوصف قوة التفاعل؟


كان Bobthejoe يشير في الاتجاه الصحيح يتم قياس معلمات kcat و Km-Michaelis Menton للنظر في المعدلات النسبية للإنزيم في حالة عدم التوازن. kcat في الأساس هو "مدى سرعة عمل الإنزيم مع القليل من المنتج أو عدم وجوده في المحلول". Km هو مدى قوة ارتباط الإنزيم بالركائز التي يستخدمها.

http://www.pearsonhighered.com/mathews/ch11/c11kkkk.htm


يجب أن تنظر إلى التفاعلات من حيث الخواص الحركية وليس الديناميكا الحرارية. يجب أن يقوم كل من k_on و k_off بالمهمة.


التقارب يقيس قوة التفاعل بين حاتمة وجسم مضاد وموقع ارتباط مستضد rsquos. يتم تعريفه بنفس المبادئ الأساسية للديناميكا الحرارية التي تحكم أي تفاعل جزيئي حيوي قابل للعكس:

  • كأ= ثابت التقارب
  • [أب] = التركيز المولي لمواقع الارتباط الشاغرة على الجسم المضاد
  • [اي جي] = التركيز المولي لمواقع الارتباط الشاغرة على المستضد
  • [حقيبة] = التركيز المولي لمركب الجسم المضاد-المستضد

بمعنى آخر ، Kأ يصف مقدار معقد الأجسام المضادة - المستضد الموجود عند النقطة التي يتم فيها الوصول إلى التوازن. الوقت الذي يستغرقه حدوث ذلك يعتمد على معدل الانتشار وهو مشابه لكل جسم مضاد. ومع ذلك ، فإن الأجسام المضادة عالية التقارب ستربط كمية أكبر من مولد الضد في فترة زمنية أقصر من الأجسام المضادة منخفضة التقارب. كأ لذلك يمكن أن تختلف بشكل كبير بالنسبة للأجسام المضادة من أقل من 10 5 مول -1 إلى أعلى من 10 12 مول -1 ، ويمكن أن تتأثر بعوامل تشمل الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة وتركيب المخزن المؤقت.

يمكن قياس ألفة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بدقة لأنها متجانسة وانتقائية لقمة واحدة. الأجسام المضادة متعددة النسيلة غير متجانسة وستحتوي على مزيج من الأجسام المضادة ذات الصلات المختلفة التي تتعرف على العديد من الحواتم وندش ، لذلك يمكن تحديد متوسط ​​التقارب فقط.


هل هناك مقياس تقارب ملزم للتفاعلات غير المتوازنة؟ - مادة الاحياء

يتم توفير جميع المقالات المنشورة بواسطة MDPI على الفور في جميع أنحاء العالم بموجب ترخيص وصول مفتوح. لا يلزم الحصول على إذن خاص لإعادة استخدام كل أو جزء من المقالة المنشورة بواسطة MDPI ، بما في ذلك الأشكال والجداول. بالنسبة للمقالات المنشورة بموجب ترخيص Creative Common CC BY ذي الوصول المفتوح ، يمكن إعادة استخدام أي جزء من المقالة دون إذن بشرط الاستشهاد بالمقال الأصلي بوضوح.

تمثل الأوراق الرئيسية أكثر الأبحاث تقدمًا مع إمكانات كبيرة للتأثير الكبير في هذا المجال. يتم تقديم الأوراق الرئيسية بناءً على دعوة فردية أو توصية من المحررين العلميين وتخضع لمراجعة الأقران قبل النشر.

يمكن أن تكون ورقة الميزات إما مقالة بحثية أصلية ، أو دراسة بحثية جديدة جوهرية غالبًا ما تتضمن العديد من التقنيات أو المناهج ، أو ورقة مراجعة شاملة مع تحديثات موجزة ودقيقة عن آخر التقدم في المجال الذي يراجع بشكل منهجي التطورات الأكثر إثارة في العلم. المؤلفات. يوفر هذا النوع من الأوراق نظرة عامة على الاتجاهات المستقبلية للبحث أو التطبيقات الممكنة.

تستند مقالات اختيار المحرر على توصيات المحررين العلميين لمجلات MDPI من جميع أنحاء العالم. يختار المحررون عددًا صغيرًا من المقالات المنشورة مؤخرًا في المجلة والتي يعتقدون أنها ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص للمؤلفين أو مهمة في هذا المجال. الهدف هو تقديم لمحة سريعة عن بعض الأعمال الأكثر إثارة المنشورة في مجالات البحث المختلفة بالمجلة.


تفاعلات تقارب الغلوبولين المناعي البشري G مع الببتيدات القصيرة: دور فاصل الترابط في الارتباط والحركية والنقل الجماعي

تم التحقيق في تقارب التفاعل بين IgG البشري ورابط الببتيد القصير (HWRGWV السداسي) باتباع التحولات في التردد وتبديد الطاقة في توازن دقيق بلوري كوارتز (QCM). تم تجميد HWRGWV عن طريق البولي (الإيثيلين جلايكول) المربوط بمستشعرات QCM المطلية بأكسيد السيليكون ، مما عزز إمكانية وصول الببتيد إلى hIgG وكذلك تخميل السطح. تم استخدام Ellipsometry و ToF-SIMS لتوصيف السطح. تم تحسين كثافة يجند الببتيد إلى 0.88 سلسلة نانومتر 2 ، مما أتاح تفاعل كل جزيء hIgG مع يجند واحد على الأقل. تم العثور على السعة القصوى للربط 4.6 مجم م 2 ، المقابلة لطبقة أحادية من hIgG ، مماثلة لقيم الراتنجات الكروماتوجرافية. كانت ثوابت التفكك أقل من تلك التي تم الحصول عليها من الراتنجات ، ربما بسبب المبالغة في تقدير الكتلة المقيدة بواسطة QCM. تم تحديد المعلمات الديناميكية الحرارية والحركية للتوازن ، مع إلقاء الضوء على التأثيرات البينية المهمة للكشف والفصل الحيوي.

تم التحقيق في تقارب التفاعل بين IgG البشري و ligand الببتيد القصير باستخدام مقياس الجاذبية الصغري البلوري ، وقياس القطع الناقص و ToF-SIMS. تم تحديد متغيرات الديناميكا الحرارية والحركية للتوازن ، وإلقاء الضوء على التأثيرات البينية المهمة للكشف والفصل الحيوي.


1 المقدمة

تشارك التفاعلات الجزيئية الحيوية بين البروتينات في تنظيم والتحكم في كل عملية بيولوجية تقريبًا في الخلية. تعد التعديلات في مثل هذه التفاعلات مسؤولة عن العديد من الأمراض ، مما يجعل مجمعات البروتين والبروتين أهدافًا حاسمة لتطوير العلاجات (بيتا وآخرون.، 2015). في هذا السيناريو ، يعد تحديد المحددات الهيكلية لهذه التفاعلات وطاقاتها الملزمة خطوة مهمة لفهم هذه الأنظمة والتحكم فيها بشكل أفضل. على وجه الخصوص ، فإن تقارب الربط (أو الطاقة الحرة الملزمة) ، الذي يحدد ما إذا كان التكوين المعقد يحدث أم لا في ظروف معينة ، يحمل مفتاح التحكم في التفاعلات (مثل هندسة التفاعلات عالية التقارب) ، وتصميم علاجات جديدة (مثل توجيه تصميم الدواء العقلاني) أو توقع تأثير الطفرات في واجهات البروتين. تم التحقيق في التنبؤ بتقارب الربط لعقود (Chothia and Janin، 1975 Horton and Lewis، 1992) مما أسفر عن طرق تتراوح بين الطرق الدقيقة (مثل اضطراب الطاقة الحرة) ، والتي تكون دقيقة ولكنها مكلفة من الناحية الحسابية ، إلى الأساليب التجريبية (مثل وظائف التسجيل في لرسو السفن ، نماذج انحدار مختلفة) ، وهي سريعة ولكنها أقل دقة (Kastritis and Bonvin ، 2010). تم توفير العديد من خوادم الويب القيمة للمجتمع العلمي ، مما يوفر سلسلة من الواصفات المختلفة (علم الطاقة ، والميزات الهيكلية ، وما إلى ذلك) لواجهات البروتين والبروتين (Moal وآخرون.، 2015 رينولدز وآخرون.، 2009 تينا وآخرون.، 2007 ساها وآخرون.، 2006 تونكباغ وآخرون.، 2009 فانجون وآخرون.، 2011). تم اختبار بعض هذه أيضًا كمتنبئات تقارب ملزمة. ومع ذلك ، هناك نقص في الأدوات المحددة عبر الإنترنت للتنبؤ بتقارب الارتباط (Su وآخرون., 2009).

في الآونة الأخيرة ، قدمنا ​​واصفًا بسيطًا وقويًا لتقارب الارتباط يعتمد فقط على الخصائص الهيكلية لمركب البروتين والبروتين. استخدام معيار تقارب ارتباط البروتين بالبروتين في التهاب Kastritis وآخرون. (2011) ، أوضحنا أن عدد جهات الاتصال البينية في واجهة معقد البروتين والبروتين يرتبط بتقارب الارتباط التجريبي الخاص به. هذه المعلومات ، جنبًا إلى جنب مع خصائص السطح غير المتفاعل (Kastritis وآخرون.، 2014 ماريليت وآخرون.، 2016) ، إلى أحد أفضل المتنبئين الذين تم الإبلاغ عنهم حتى الآن. من حيث الدقة ، أظهرت طريقتنا معامل ارتباط بيرسون البالغ 0.73 بين تقارب الربط المتوقع والمقاس على المعيار (ص-value & lt0.0001) وخطأ مربع متوسط ​​الجذر (RMSE) يبلغ 1.89 كيلو كالوري مول −1 (Vangone and Bonvin ، 2015). بينما تعمل طريقتنا بشكل جيد في المتوسط ​​، قد تكون الأخطاء في حالات معينة متوقعة على سبيل المثال ، بعض المجمعات الطبيعية عالية التقارب لها مساحة سطح مدفونة متوسطة أو أقل من المتوسط ​​، وقد تقلل طريقتنا من تقاربها. يمكن أن تؤخذ النماذج الفيزيائية البديلة للإنتروبيا وتأثيرات المذيبات والكهرباء الساكنة في الاعتبار لمعالجة مثل هذه الحالات ، على الرغم من أنه ، حتى الآن ، لا يوجد مثل هذا النموذج يعمل بشكل أفضل في المتوسط ​​من نهجنا البسيط القائم على الاتصال (انظر الشكل 4 في فانجون وبونفين ، 2015 ).

لقد طبقنا طريقتنا القائمة على الاتصال كخادم ويب ، PRODIGY (توقع الطاقة PROtein binDIng) ، أداة سهلة الاستخدام عبر الإنترنت للتنبؤ بتقارب الارتباط في مجمعات البروتين والبروتين.


علاقات عملية بين [R] و [L] و Kد و [RL]

بالنسبة لنفس التركيز الإضافي للرابط والمستقبل ، سيحدث تكوين أكثر تعقيدًا بقيمة أقل من Kد

يُضاف المُستقبل والرابط إلى تركيز إجمالي 1.0 × 10 -4 مد بالنسبة لمركب RL هو 1.0 × 10 -4 م. ما هو تركيز [R] و [L] و [RL] عند التوازن؟

سيتم تقسيم ligand المضافة ، L ، بين الأشكال الحرة والمحددة:

إلالمجموع = L + RL = 1.0 × 10 -4 م

وبالمثل ، سيتم تقسيم المستقبل المضاف R بين الأشكال الحرة والمقيدة:

صالمجموع = R + RL = 1.0 × 10 -4 م

استبدال قيم L و R هذه في التعبير لـ K.د عائدات:

هذه معادلة تربيعية بقيمها أ = 1 ، ب = -3.0 × 10 -4 ، ج = 1.0 × 10 -8. ينتج عن ذلك قيمتان محتملتان لـ RL:

نظرًا لأن أقصى قيمة ممكنة لـ [RL] هي 1.0 × 10 -4 (على سبيل المثال ، نظرًا لتركيزات البداية لـ R و L ، فهذه هي أكبر كمية يمكن تكوينها من RL) ، فإن النتيجة الأولى غير ممكنة و [RL] = 3.82 × 10 -5 م

هكذا، 38.2٪ من المستقبل المضاف موجود في التكوين المعقد (أي 3.82 × 10-5 م / 1.0 × 10-4) × 100٪

تمت إضافة نفس المقدار من R و L ، ولكن هذه المرة Kد بالنسبة لمركب RL هو 1.0 × 10 -6 م. ما هو تركيز [R] و [L] و [RL] عند التوازن؟

هو تربيعي بقيمه أ = 1 ، ب = -2.01 × 10 -4 و ج = 1.0 × 10 -8. ينتج عن ذلك قيمتان محتملتان لـ RL:

نظرًا لأن أقصى قيمة ممكنة لـ [RL] هي 1.0 × 10 -4 (على سبيل المثال ، نظرًا لتركيزات البداية لـ R و L ، فهذه هي أكبر كمية يمكن تكوينها من RL) ، فإن النتيجة الأولى غير ممكنة و [RL] = 9.05 × 10-5 م

هكذا، 90.5٪ من المستقبل المضاف موجود في التكوين المعقد (أي 9.05 × 10-5 م / 1.0 × 10-4) × 100٪

بالنسبة لنفس التركيز الإضافي للرابط والمستقبل ، سيحدث تكوين أكثر تعقيدًا بقيمة أقل من Kد


ما هو & # 8220 good & # 8221 تقارب ملزمة لدواء؟

إذا كنت & # 8217 قد أمضيت أي وقت في البحث في العروض التقديمية لشركة التكنولوجيا الحيوية ، فمن المحتمل أن تكون قد صادفت شريحة مثل أدناه ، من مطوري أدوية السرطان Mirati ، والتي تلخص بشكل جيد النشاط والفعالية والانتقائية لمثبط KRAS الخاص بهم MRTX-849 [1] .

الهدف من هذا المنشور هو مراجعة المفاهيم المعروضة في شريحة Mirati أعلاه (تقارب الربط وكيفية ارتباطه بالفعالية والانتقائية) وتقديم بعض الحدس لما يبدو & # 8220 جيد & # 8221 لهذه المعلمات. أود أيضًا أن أجمع مرجعًا للأشخاص الذين ليس لديهم خلفية قوية في علم العقاقير والذين مع ذلك يرغبون في فهم عروض البيانات مثل هذا العرض.

بالنسبة لأولئك الذين يريدون فقط الملخص السريع: يعتبر التقارب الملزم الذي يقل عن 10 نانومتر (من حيث Kd / Ki / EC50 / IC50) بشكل عام & # 8220 جيد & # 8221 ، ولكن خلف هذه القيمة هو إجراء موازنة صعب يتضمن تحسين العديد سمات أخرى للدواء مثل الانتقائية وقابلية الذوبان والوزن الجزيئي للتأكد من أن المرضى قادرون على الاستفادة من دواء فعال وسُمي قليلًا وبدون متطلبات جرعات مرهقة للغاية.

ما هو التقارب الملزم؟

التقارب الملزم هو مقياس لقوة التفاعل بين جزيء يجند (أي دواء) والهدف الذي يرتبط به (غالبًا بروتين ، مستقبل ، إنزيم ، سيتوكين ، إلخ).

في النموذج المبسط & # 8220lock و key & # 8221 ، يعكس تقارب الربط مدى ملاءمة الدواء & # 8220key & # 8221 مع هدفه & # 8220lock & # 8221. بشكل حدسي ، وفقًا للنموذج ، ينتج الربط الضيق من التطابق الوثيق بين الأشكال & # 8220lock & # 8221 و & # 8220key & # 8221 ، حيث أن المجمعات المريحة مواتية بقوة أكبر من تلك المربوطة بشكل فضفاض. في الواقع ، البروتينات والجزيئات البيولوجية الكبيرة الأخرى هي هياكل مرنة وديناميكية بدون جامدة & # 8220locks & # 8221 ، لكن القياس مفيد بغض النظر.

بشكل عام ، يتم قياس تقارب الارتباط من حيث ثابت التفكك (Kd) ويتم التعبير عنه بالتركيز المولي. ثابت التفكك هو مقياس لنسبة الروابط غير المنضمة (المفصولة) إلى الروابط المرتبطة عند التوازن. كلما انخفضت قيمة Kd ، زادت قوة تقارب الربط. قد ترى أيضًا أن هذه النسبة يشار إليها باسم ثابت التثبيط (Ki) في سياق عقار مثبط ، وهو في الأساس نفس الشيء مثل ثابت التفكك. للحصول على نظرة عامة حول طرق قياس Kd ، راجع مقالة Wikipedia حول فحوصات ربط ligand.

معادلة تفاعل كيميائي عام قابل للانعكاس عند التوازن يتضمن جزيئين ، A و B ، ومركب من الاثنين ، AB يمكن التعبير عنها على النحو التالي:

ثم يتم حساب ثابت التفكك عن طريق قياس تركيزات الجزيئات المختلفة عند التوازن وتوصيل القيم بالصيغة أدناه

لأغراضنا ، يمكن أن يمثل A عقارًا ، و B مستقبله المستهدف و AB معقد مستقبل الدواء المرتبط. الأقواس المربعة تعني التركيز. تمثل x و y عدد جزيئات A و B المشاركة في كل حالة من التفاعل ، على التوالي. كلما انخفض Kd ، زاد ارتباط جزيئات الدواء (A) بهدفه (B) ، وبالتالي كان الارتباط أكثر إحكامًا. عند قياس Kd ، من المهم إعطاء التفاعل وقتًا كافيًا للموازنة بشكل صحيح قبل قياس التركيزات ، أو قد يتم المبالغة في تقدير Kd [2].

عندما تكون x = 1 و y = 1 (كما هو الحال غالبًا في علم الأحياء وعلم العقاقير ، على سبيل المثال عندما يرتبط جزيء واحد من الدواء بموقع مستقبل واحد) ، فإن Kd تساوي تركيز A حيث يرتبط A بنصف الجزيئات من B حتى مجمع AB عند التوازن (أي أن تركيز B يساوي تركيز AB). حسب الحساب أدناه:

هناك طريقة أخرى لحساب Kd وهي أخذ نسبة معدل ثابت للتفاعل الأمامي (الملزم) (kon) مقسومًا على ثابت المعدل للتفاعل العكسي (التفكك) (koff).

ومع ذلك ، نادرًا ما يتم تحديد قيم kon و koff عمليًا ولا يمكنك استخلاص استنتاجات مؤكدة حول مدة الربط من Kd وحدها [3]. على الرغم من أنه بشكل عام ، سيؤدي تقارب الارتباط الأعلى إلى إنفاق الدواء لنسبة زمنية أعلى مرتبطة بالهدف أكثر من عدمه.

يرتبط تقارب الربط أيضًا بـ & # 8220 الإشغال الجزئي & # 8221 للدواء ، أي النسبة المئوية للهدف المرتبط بالدواء ، محسوبًا بالمعادلة التالية:

يُعد الإشغال الجزئي مفيدًا لأن النشاط البيولوجي للدواء غالبًا ما يعتمد على قدرته على ربط نسبة كبيرة من الأهداف المتاحة. من المعادلة ، يمكنك أن ترى أن Kd مهم بشكل خاص عند تركيزات منخفضة من عقار ([A]) يمكن أن يكون للدواء الذي يحتوي على Kd منخفض جدًا إشغال كسري مرتفع حتى في التركيزات المنخفضة.

بينما يخبرك تقارب الربط بمدى إحكام ربط الدواء بهدفه ، فإنه ليس نفس الشيء مثل القدرة البيولوجية & # 8220_القدرة & # 8221 أو & # 8220 النشاط & # 8221. يتم التعبير عن هذه المفاهيم عادةً باستخدام المقاييس التالية ، والتي تُستخدم على نطاق واسع في الممارسة لفحص المركبات الدوائية أكثر من Kd أو Ki:

  • التركيز المثبط النصف الأقصى (IC50) ، وهو تركيز الدواء الذي يتم عنده تقليل نشاط هدفه (مثل الإنزيم) إلى 50٪ من أقصى نشاط له. تسمى الأدوية التي تثبط نشاط هدفها & # 8220antagonists & # 8221
  • نصف التركيز الفعال الأقصى (EC50) ، وهو تركيز الدواء الذي يؤدي إلى استجابة في هدفه بنسبة 50٪ من أقصى استجابة ممكنة. تمثل الاستجابة مقياسًا للنشاط البيولوجي للهدف ، مثل معدل التفاعل الإنزيمي. الأدوية التي تنشط أهدافها تسمى & # 8220agonists & # 8221. ناهضات معكوسة هي الأدوية التي تسبب استجابة بيولوجية معاكسة لما قد يسببه ناهض

في حين أن EC50 و IC50 ليسا مقاييس رسمية لتقارب الربط ، فقد ترى أنهما يشار إليهما بشكل غير رسمي على هذا النحو & # 8211 وصحيح أن EC50 / IC50 الأقل يشير إلى Kd / Ki أقل ، وكل شيء آخر متساوٍ.

عادةً ما تكون قيم EC50 / IC50 أعلى من قيم Kd / Ki ، ولكن يمكن أن تكون هي نفسها في ظل ظروف معينة (مثل الربط غير التنافسي). بالنسبة للقراء الذين يميلون إلى الرياضيات ، فإن هذه الورقة هي نظرة عامة لطيفة على كيفية ارتباط كي رياضيًا بـ IC50 في ظل ظروف مختلفة

لتوضيح العلاقة تقريبًا ، قمت & # 8217 برسم Ki مقابل IC50 لمجموعة فرعية من المركبات الشبيهة بالعقاقير الجزيئية الصغيرة في BindingDB أدناه & # 8211 بوضوح لا يوجد تحويل خطي بسيط من واحد إلى الآخر:

على الرغم من أن الرسم البياني أعلاه يحتوي على بعض الأمثلة على الأدوية ذات قيمة Ki أعلى من IC50 ، نظريًا ، يجب ألا تكون قيم Kd / Ki أقل من EC50 / IC50 نظرًا لعلاقة رياضية تُعرف باسم علاقة Cheng-Prusoff. ومع ذلك ، من الناحية العملية ، يمكن أن يكون IC50 في بعض الأحيان أقل من Ki في حالة تفاعلات الحالة غير المستقرة [4] أو الخطأ التجريبي.

لماذا تكون قيم EC50 / IC50 أكبر بشكل عام من تقارب الربط؟

لقد ذكرت سابقًا أن قيم EC50 / IC50 عادة ما تكون أعلى من قيم Kd / Ki. لذا فإن تقارب الربط ليس هو نفسه النشاط البيولوجي. قد يكون هذا لعدة أسباب محتملة:

  • في الحالات التي يتنافس فيها دواء ما على موقع ارتباط مع جزيئات أخرى (مثل الرابط الطبيعي لمستقبل ما) ، تختلف قيم EC50 / IC50 اعتمادًا على تركيز الجزيئات الأخرى. هذا بسبب الحاجة إلى وجود فائض من الدواء للتغلب على الجزيئات الأخرى في موقع الارتباط [5]
  • قد يصبح موقع الربط متاحًا فقط في ظل حالة نادرة أو عابرة للهدف ، وقد تكون هناك حاجة إلى تركيز عالٍ من الدواء لذلك يوجد دواء كاف & # 8220 جاهز & # 8221 لربط وتعديل نشاط الهدف بشكل فعال في فترات وجيزة عندما يكون من الممكن القيام بذلك [5]
  • لا يتم تحويل كل الروابط إلى نشاط بيولوجي

تستحق هذه النقطة الأخيرة التوسع فيها ، في حين أن المنبهات الكاملة تنشط هدفها إلى أقصى حد ، إلا أن المنبهات الجزئية لا تؤدي إلا إلى استجابة دون الحد الأقصى ، بغض النظر عن تركيزها. يوجد أدناه رسم بياني بسيط لطيف من مقالة Wikipedia & # 8217s حول الروابط التي توضح هذا المفهوم جيدًا.

يمكن أن تكون المواد الناهضة الجزئية مرغوبة في الحالات التي يرتبط فيها التنشيط الأقصى للهدف بالسمية أو يؤدي إلى إزالة حساسية المستقبل [6].

ترتبط المثبطات إما بشكل مباشر بالمواقع النشطة لأهدافها وتمنع ارتباط الروابط الطبيعية (التثبيط التنافسي) أو ترتبط في مكان آخر بالهدف وتمنع النشاط بشكل غير مباشر من خلال إحداث تغيير في شكل الهدف أو تثبيت شكل معين (خيفي) أو تثبيط غير تنافسي). قد تظهر المثبطات الخيفية أو غير التنافسية تثبيطًا جزئيًا على الرغم من تقارب الارتباط العالي ، عن طريق تقليل فعالية هدفها دون القضاء على النشاط تمامًا.

ما هو التقارب المستهدف الذي يهدف إليه مطورو الأدوية؟

عند الشروع في برنامج اكتشاف الأدوية ، ستقوم الشركات بفحص مكتبات المركبات [7] باستخدام اختبار معين وقياس تقارب / قوة الارتباط لكل منها ، مع التقدم بأعلى فعالية & # 8220hits & # 8221 لمزيد من التطوير. تحتوي فحوصات قياس الفاعلية على مجموعة متنوعة من التصميمات المحتملة ، اعتمادًا على الوظيفة البيولوجية للهدف. في مثال Mirati في بداية هذا المنشور ، قاموا بقياس النشاط (IC50) من خلال تحديد مستوى MRTX-849 المطلوب لمنع تكاثر سلالات الخلايا السرطانية التي تحمل الطفرة المستهدفة (KRAS G12C).

كإرشاد عام ، يريد مطورو العقاقير الجزيئية الصغيرة تحقيق تقارب أقل من 10 نانومتر لأدويتهم. يعتبر الحد الفاصل المحدد تعسفيًا إلى حد ما ، ولكن النطاق أقل من 10 نانومتر Kd / Ki / EC50 / IC50 تاريخيًا حيث انتهى الأمر بالعديد من المركبات الدوائية الفعالة وهو منخفض بما يكفي لمطوري الأدوية ليكونوا واثقين من أنهم يشاركون بشكل كافٍ في الهدف المنشود . على حد قول ديريك لوي: [8]

كلما كان [IC50] أقل ، كلما كانت الأشياء الأخرى متساوية. معظم الأدوية متدنية في النطاق النانوي - أقل من ذلك نطاقات البيكومولار الفائق القوة والفيمتومولار ، حيث يغامر القليل من المركبات. وفوق ذلك ، بمجرد حصولك على ما يصل إلى 1000 نانومولار ، يكون ميكرومولار ، ثم 1000 ميكرومولار هو ميليمولار واحد. حسب معايير med-chem التقليدية:

  • نانومولار أحادي الرقم = جيد
  • نانومولار مزدوج الرقم = ليس سيئًا
  • النانومولار ثلاثي الأرقام أو الميكرومولار المنخفض = نقطة البداية لصنع شيء أفضل
  • ميكرومولار مرتفع = تجاهل
  • الميلي مولار = يمكن أن يعمل بشكل أفضل مع الأشياء الموجودة أسفل حذائك

تم توضيح ذلك بشكل جيد من خلال الشريحة أدناه من عرض Mirati & # 8217s في AACR في أكتوبر 2019 [9] ، حيث يحددون التعديلات التي تم إجراؤها على مركبهم المبدئي لزيادة الفاعلية والوصول إلى مركبهم الرئيسي النهائي ، MRTX849:

ومع ذلك ، بالمقارنة مع الجزيئات الصغيرة ، فإن ما يسمى بالطرق العلاجية & # 8220 بيولوجي & # 8221 يمكن أن يكون لها روابط ارتباط قوية للغاية في النهاية العليا لما هو ممكن مع الجزيئات الصغيرة & # 8211 ميزة ساعدت في جعل هذه الفئة من الأدوية فعالة للغاية و بشكل عام آمن. على سبيل المثال:

    عادةً ما يكون للأجسام المضادة وحيدة النسيلة روابط ارتباط في النطاق البيكومولار المنخفض ، بمتوسط ​​يبلغ حوالي 70 مساءً [10]. على سبيل المثال ، الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد لـ TNF هووميرا لديه Kd مُقاس عند 8.6pM [11] Kd لهدف مطابق تمامًا هو

لذلك في حين أن 10 نانومتر قد تكون كافية لجزيء صغير ، قد يتوقع مطورو عقاقير الأجسام المضادة المزيد من المرشحين الرئيسيين قبل تطويره في التطوير السريري.

ما المقاييس الأخرى ذات الصلة التي يُحتمل أن تكون مهمة بصرف النظر عن التقارب والنشاط والفعالية؟

غالبًا ما ينطوي الانتقال من الضربة الأولية إلى العقار النهائي على إجراء مقايضات في السمات المختلفة للجزيء الذي يعمل على تحسين تقارب الارتباط على كل شيء آخر ، مما قد يؤدي إلى دواء دون المستوى الأمثل بشكل عام. نقلا عن مقال بقلم ج. سينغ: [15]

يتمثل التحدي الرئيسي في اكتشاف الأدوية في تحقيق فاعلية وانتقائية عالية في المركب دون زيادة كتلته الجزيئية إلى الحد الذي تتعرض فيه الخصائص الصيدلانية المفيدة للخطر

لقد اخترت بعض المقاييس الإضافية للتغطية في انتقائية المنشور هذه ، وكفاءة الترابط والترابط التساهمي.

الانتقائية:

الانتقائية ، نزعة الدواء إلى ربط هدف على آخر ، هي سمة مهمة يجب على الدواء إدارتها. الأدوية & # 8220 انتقائية للغاية & # 8221 لها تقارب ارتباط كبير بالهدف الأساسي ، وتقارب ربط منخفض مع هدف غير مرغوب فيه ، وهذا ما يوضحه Mirati على الجانب الأيمن من الشريحة في بداية المنشور. قد يكون من المرغوب فيه أن تربط المركبات أهدافًا متعددة إذا كانت هناك مسارات متعددة تساهم في المرض. ترتبط العديد من الأدوية المعتمدة بالعديد من البروتينات ذات الصلة ، مثل مثبطات JAK ومثبطات بان-كيناز الأخرى.

قد يؤدي رفع تقارب الربط للهدف الأساسي إلى أعلى مستوى ممكن أيضًا إلى زيادة ميله إلى الارتباط & # 8220off-target & # 8221 ، مما يؤدي إلى السمية. على هذا النحو ، يمكن أن يكون هناك نوع من & # 8220Goldilocks zone & # 8221 لتقارب الربط الذي يتأثر بالسياق البيولوجي الذي يُقصد استخدام الدواء فيه. تتمثل الطريقة الرئيسية التي سيختبر بها مطورو الأدوية المرشح للعقار عن طريق الفحص العكسي مقابل مكتبة من الأهداف المرتبطة بالسمية ، على سبيل المثال. hERG (& # 8220antitargets & # 8221) للتحقق من أن دوائهم لا يرتبط جيدًا بهذه & # 8220antitargets & # 8221.

كفاءة يجند:

من المحتمل أن ينظر مطورو الأدوية المترية الآخرون في كفاءة الترابط ، وهو مقياس لتقارب الارتباط الذي تم تحقيقه للوزن الجزيئي للمركب. يفضل استخدام الأوزان الجزيئية المنخفضة بشكل عام ، لأن الأدوية الأكبر حجمًا تكون أقل قابلية للذوبان ويصعب الوصول إليها في الخلايا المستهدفة. Lipinski & # 8217s الشهيرة & # 8220Rule of five & # 8221 تستدعي وزنًا جزيئيًا أقل من 500 دالتون ، على الرغم من طرح المزيد والمزيد من الأدوية الفموية الكبيرة في السوق مؤخرًا ، ويعد semaglutide الفموي # 8211 مثالًا جيدًا بشكل خاص.

الربط التساهمي

ترتبط معظم الأدوية بشكل عكسي بهدفها. MRTX-849 هو في الواقع مثبط تساهمي مستهدف ، مما يعني أنه يشكل روابط كيميائية (يحتمل أن لا رجوع فيها) مع هدفه. كان مطورو الأدوية ، تاريخيًا ، مترددين في متابعة العقاقير التساهمية بشكل منهجي بسبب المخاوف من السمية والتفاعل خارج الهدف ، ولكن كان هناك شيء من الانبعاث مؤخرًا مدفوعًا بنجاح الأدوية مثل ibrutinib. لنقتبس من ج. سينغ مرة أخرى: [15]

تفضل المثبطات التي تعتمد على الترابط التساهمي بشكل كبير الشكل المرتبط ، مما يؤدي إلى الفاعلية وكفاءات الترابط التي تكون إما عالية بشكل استثنائي أو ، للتفاعلات التساهمية التي لا رجعة فيها ، حتى غير محدودة بشكل أساسي. وبالتالي ، فإن الترابط التساهمي يسمح بتحقيق فاعلية عالية بشكل روتيني في المركبات ذات الكتلة الجزيئية المنخفضة ، إلى جانب جميع الخصائص الصيدلانية المفيدة المرتبطة بالحجم الصغير

يتم التعامل مع حساب التقارب للمثبطات التساهمية بطريقة مختلفة عن تلك الخاصة بالمثبطات غير التساهمية ، حيث لا يمكن عكس التفاعلات. IC50 من الناحية النظرية ذات قيمة محدودة بسبب تأثير وقت رد الفعل على القيمة & # 8211 ومع ذلك ، لا يزال ميراتي يختار الإبلاغ عنه.

اعتبارات أخرى

عند تصميم دواء يرتبط ارتباطًا تنافسيًا ، من المهم أيضًا مراعاة التقارب النسبي للرابط الطبيعي للهدف مقابل الدواء & # 8217s ، حيث سيكون من الصعب إزاحة الروابط الطبيعية شديدة الارتباط وقد تتطلب روابط ارتباط عالية بشكل خاص.

تشمل العوامل الأخرى التي قد تكون مهمة شكل وانحدار منحنى الاستجابة للجرعة (المرتبط بعرض النافذة العلاجية) ، والتباين من خلية إلى خلية داخل عينة فحص الفحص [16] ، وحركية التفاعل والديناميكا الحرارية المرتبطة بالرباطات [17].


6. طرق أخرى لقياس الإلزام: اختبار الاستبعاد الحركي والاستجابة السطحية PLASMON

في حين أن فحوصات ربط الخلايا مفيدة في السرعة والسهولة التي يمكن إجراؤها بها ، إلا أنها محدودة في قدرتها على قياس تفاعلات الارتباط عالية التقارب والمعلمات الحركية (Bylund & # x00026 Toews ، 1993). في هذه الحالات ، يمكن استخدام مقايسة الاستبعاد الحركي (KinExA) أو رنين البلازمون السطحي (SPR) (Blake، Pavlov، & # x00026 Blake، 1999 Darling & # x00026 Brault، 2004 Myszka، 2000 Patching، 2014). سنقدم هنا مقدمة موجزة لكل منها وسرد المزايا والعيوب الرئيسية لكل تقنية. لاحظ أن تسميات ligand والمستقبلات في الأمثلة أدناه عشوائية ويمكن عكسها.

6.1 فحص الاستبعاد الحركي

التفاعلات الملزمة التي تم قياسها بواسطة KinExA (Blake et al. ، 1999) تستفيد من عمود من الخرز المعبأ الذي يتم لصق رابطة مثبتة عليه (Darling & # x00026 Brault ، 2004). يتم إعداد تفاعلات الربط بتركيزات متفاوتة من الترابط وتركيزات ثابتة للمستقبلات ، ويُسمح لها بالتوازن ، ثم يتم تشغيلها فوق العمود لالتقاط مستقبل غير منضم بواسطة اللجند الملصق (Darling & # x00026 Brault ، 2004). ثم يتم الكشف عن كمية المستقبلات المرتبطة بالخرز وتحديد كميتها باستخدام جسم مضاد الفلورسنت (الشكل 7A & # x02013C). وبالتالي ، يسمح KinExA بالقياس المباشر للمستقبلات الحرة المتبقية عند التوازن في كل تفاعل ملزم.

(A & # x02013C) KinExA. (أ) صورة مقربة لنظام الكشف القائم على حبة KinExA. يجند مثبت على خرزات في عمود ربط قابل للذوبان ومستقبلات حرة ، والتي يتم الكشف عنها عن طريق ربط الجسم المضاد الفلوري بالمستقبل. (B و C) رسم تخطيطي لمقايسة KinExA. (ب) يتم تحضين اللجين القابل للذوبان والمستقبلات حتى يتم الوصول إلى التوازن. يتدفق هذا التفاعل فوق العمود ، مما يسمح للمستقبلات الحرة عند التوازن بربط ترابط مثبت بالخرز. (ج) بعد الغسل ، يتم الكشف عن مستقبلات ملزمة باستخدام أجسام مضادة الفلورسنت محددة وقياسها كمياً. (د) رنين سطح البلازمون. يتم لصق المستقبل على سطح فيلم ذهبي. يجند ، أو & # x0201canalyte ، & # x0201d يتدفق فوق السطح. يتم قياس التغييرات في الرنين بسبب الارتباط عن طريق كاشف من الضوء المنبعث من خلال منشور وتحليلها. لاحظ أنه بالنسبة إلى KinExA و SPR ، يكون تعيين الترابط والمستقبل تعسفيًا ويمكن عكسهما.

يشير الاستبعاد الحركي إلى السرعة السريعة التي يتدفق بها تفاعل الارتباط فوق العمود (& # x0003c0.5 ثانية) ، بحيث لا يكون لدى مجمع المستقبلات المرتبطة & # x02013 وقت للانفصال وزيادة تركيز المستقبل الحر في المحلول (حبيبي & # x00026 Brault ، 2004). وبالتالي ، فإن تفكك LR & # x0201 مستبعد مبدئيًا & # x0201d من الحدوث. تعني هذه الميزة الحاسمة أن كمية المستقبل التي تم التقاطها بواسطة الترابط الثابت تتناسب مع [R]مجانا، توفير طريقة يتم من خلالها كد يمكن تحديده دون الحاجة إلى النظر في العوامل الكامنة وراء فحوصات ربط الخلايا ، مثل استنفاد الترابط (Blake et al.، 1999 Darling & # x00026 Brault، 2004 Drake، Myszka، & # x00026 Klakamp، 2004).

نظرًا لأنه يتم قياس الارتباط مباشرة واستقراءه من كمية صغيرة من المقاسة [R]مجانا، يسمح KinExA بتحديد ملف كد من تفاعلات الارتباط عالية التقارب ، ويمكن أيضًا قياس معلمات الربط الحركية (Darling & # x00026 Brault ، 2004). يتم ذلك عن طريق خلط تركيزات محددة مسبقًا من [L]ا و [R]ا معًا ، ثم قياس [R]مجانا مع مرور الوقت (Darling & # x00026 Brault، 2004 Drake et al.، 2004). يمكن رسم هذه البيانات وتناسبها مع معادلة المعدل الجزيئي الحيوي القياسية واستقراءها لتحديد كتشغيل (دارلينج & # x00026 Brault ، 2004). لمزيد من التفاصيل ، تمت مراجعة KinExA كتقنية لتحديد الصلات الملزمة على نطاق واسع في مكان آخر (Darling & # x00026 Brault، 2004 Drake et al.، 2004).

6.2 الرنين السطحي للبلازمون

يعتمد SPR على قياس تغير معامل الانكسار من مستقبل مرتبط بسطح ذهبي بعد تدفق ليجند قابل للذوبان ، أو مادة تحليلية ، فوق الشريحة (الشكل 7 د) (J & # x000f6nsson et al.، 1991، 1993 Myszka، 2000 Patching، 2014 ). يتم إجراء هذه القياسات في الوقت الفعلي ، ويتناسب حجم تغير معامل الانكسار بشكل مباشر مع الوزن الجزيئي للتحليل (Myszka، 2000 Patching، 2014).

لقياس المعلمات الحركية ، يستخدم بروتوكول SPR تركيزات متفاوتة من المادة التحليلية المتدفقة عبر شرائح من المستقبلات المعطلة. يتم إجراء القياسات في الوقت الفعلي لمرحلة الارتباط ، حيث يتم تدفق المادة التحليلية ، ومرحلة التفكك ، حيث يتم تدفق المخزن المؤقت (Myszka ، 2000 Patching ، 2014). تولد هذه البيانات مجموعة من منحنيات الربط التي يتم من خلالها إنشاء ملف كتشغيل (منظمة)، كإيقاف (التفكك) ، و كد يمكن استنتاجها (Myszka ، 2000 Patching ، 2014).

على عكس KinExA ومقايسات الربط القائمة على الخلية ، لا يتطلب SPR ردود فعل للوصول إلى التوازن ، وهو مفيد للتفاعلات الملزمة التي لها أوقات توازن طويلة جدًا. ومع ذلك ، لأنها تتطلب القياس كتشغيل و كإيقاف، إذا كانت أي من هذه القيم سريعة جدًا أو بطيئة جدًا ، على التوالي ، لا يمكن الاعتماد على SPR في قياس هذه المعلمات ويجب استخدام نوع آخر من مقايسة الربط. لمزيد من التفاصيل ، تمت مراجعة استخدام SPR لتحديد تقاربات الربط على نطاق واسع في مكان آخر (Myszka ، 2000 Patching ، 2014).

6.3 المقارنة

لكل مقايسة ملزمة مشمولة في هذه المراجعة مجموعة محددة من الظروف التي يكون استخدامها فيها هو الأمثل. يلخص الجدول 4 مزايا وعيوب كل نوع من المقايسة الملزمة. يمكن استخدام جميع الطرق الأربعة لقياس تفاعلات الارتباط لوصف البروتينات من النوع البري والبروتينات المهندسة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام YSD للتعبير بسرعة عن متغيرات بروتينية متعددة واختبارها لربط التوازن أو معدل الحركية للارتباط بالبروتين محل الاهتمام ، دون الحاجة إلى إجراء تنقية على نطاق واسع والتعبير عن البروتينات الفردية. يمكن أيضًا اختبار الروابط باستخدام مقايسات ربط خلايا الثدييات المباشرة أو المنافسة للتحقيق في تفاعلات البروتين المرتبطة بالمستقبل أو الغشاء في بيئة داخلية. مزيد من التوصيف ، بما في ذلك التحليل الحركي المتعمق واختبار أكثر صرامة لـ كد، خاصة إذا كان التقارب الهندسي ضيقًا جدًا ، يمكن قياسه باستخدام إما KinExA أو SPR ، اعتمادًا على خصائص تفاعل الارتباط (انظر الجدول 4). يمكن أيضًا استخدام هذه الطرق الأربعة بالتنسيق للحصول على الثقة في دقة قياسات الربط.

الجدول 4

مزايا وعيوب فحوصات ربط الخلايا و KinExA و SPR

لا حاجة للتعبير وتنقية البروتين على نطاق واسع

من السهل قياس الارتباط بمتغيرات البروتين المتعددة

إنتاجية عالية نسبيًا

انخفاض المتطلبات الفنية والوقت

يمكن قياس تعبير البروتين وتطبيعه بالربط

متوافق مع قياس التدفق الخلوي

تعذر قياس التفاعلات عالية التقارب بدقة (& # x0003c10 صم)

قد لا يحاكي تجميد البروتين على سطح الخميرة البيئة الطبيعية

يتطلب قياس المجلدات عالية التقارب معرفة نضوب الترابط ووقت التوازن

يتطلب فحوصات منفصلة لقياس التوازن والمعلمات الحركية

يكرر ظروف الارتباط الطبيعية (للبروتينات المرتبطة بالغشاء)

No need to express or purify the receptor of interest

Compatible with flow cytometry

Relatively high throughput

Can perform direct- or competition-binding assays

Unable to accurately measure high-affinity interactions (㰐 pم)

Mammalian cells are fragile, dead cells can nonspecifically bind to ligand or reagents

Measurement of high-affinity binders requires cognizance of ligand depletion and time to equilibrium

Requires separate assays to measure equilibrium and kinetic parameters

True solution-based measurements of unmodified proteins

Accurately measures high-affinity interactions (㰐 pم), can measure fM

Avoids nonspecific cell binding

Measures amount of [R]مجانا at equilibrium removing concerns of ligand depletion

Measurements can be made with unpurified mixtures

Relatively low throughput, although autosampler is available

Nonspecific bead binding may occur

Weaker binders can be measured but may require extra care

Solution binding might not mimic natural environment

Requires separate assays to measure equilibrium and kinetic parameters

Low quantities of samples needed

Able to measure كتشغيل و كإيقاف الوقت ذاته

Reactions do not need to reach equilibrium to be evaluated

Binding partner is immobilized to a surface

Requires purified proteins

Limited by mass transport effects in measuring very fast association rates or very slow dissociation rates

Can be relatively low throughput, depending on the instrument


مراجع

DeRisi JL, Iyer VR, Brown PO: Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. علم. 1997, 278: 680-686. 10.1126/science.278.5338.680.

Hughes JD, Estep PW, Tavazoie S, Church GM: Computational identification of cis-regulatory elements associated with groups of functionally related genes in Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 2000, 296: 1205-1214. 10.1006/jmbi.2000.3519.

Liu X, Clarke ND: Rationalization of gene regulation by a eukaryotic transcription factor: calculation of regulatory region occupancy from predicted binding affinities. J Mol Biol. 2002, 323: 1-8. 10.1016/S0022-2836(02)00894-X.

Beer MA, Tavazoie S: Predicting gene expression from sequence. زنزانة. 2004, 117: 185-198. 10.1016/S0092-8674(04)00304-6.

Chu S ، DeRisi J ، Eisen M ، Mulholland J ، Botstein D ، Brown PO ، Herskowitz I: برنامج النسخ من الأبواغ في الخميرة الناشئة. علم. 1998 ، 282: 699-705. 10.1126/science.282.5389.699.

Iyer VR, Horak CE, Scafe CS, Botstein D, Snyder M, Brown PO: Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. طبيعة سجية. 2001, 409: 533-538. 10.1038/35054095.

Spellman PT, Sherlock G, Zhang MQ, Iyer VR, Anders K, Eisen MB, Brown PO, Botstein D, Futcher B: Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. خلية مول بيول. 1998 ، 9: 3273-3297.

Schneider TD: Information content of individual genetic sequences. J ثور بيول. 1997, 189: 427-441. 10.1006/jtbi.1997.0540.

Stormo GD, Fields DS: Specificity, free energy and information content in protein-DNA interactions. اتجاهات علوم الكيمياء الحيوية. 1998, 23: 109-113. 10.1016/S0968-0004(98)01187-6.

Zhu G, Spellman PT, Volpe T, Brown PO, Botstein D, Davis TN, Futcher B: Two yeast forkhead genes regulate the cell cycle and pseudohyphal growth. طبيعة سجية. 2000, 406: 90-94. 10.1038/35021046.

Hollenhorst PC, Pietz G, Fox CA: Mechanisms controlling differential promoter-occupancy by the yeast forkhead proteins Fkh1p and Fkh2p: implications for regulating the cell cycle and differentiation. تطوير الجينات. 2001, 15: 2445-2456. 10.1101/gad.906201.

Pierce M, Benjamin KR, Montano SP, Georgiadis MM, Winter E, Vershon AK: Sum1 and Ndt80 proteins compete for binding to middle sporulation element sequences that control meiotic gene expression. مول الخلية بيول. 2003, 23: 4814-4825. 10.1128/MCB.23.14.4814-4825.2003.

Lieb JD, Liu X, Botstein D, Brown PO: Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. نات جينيه. 2001, 28: 327-334. 10.1038/ng569.

Hanley JA, McNeil BJ: The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve. Radiology. 1982, 143: 29-36.

Clarke ND, Granek JA: Rank order metrics for quantifying the association of sequence features with gene regulation. المعلوماتية الحيوية. 2003, 19: 212-218. 10.1093/bioinformatics/19.2.212.

Roth FP ، Hughes JD ، Estep PW ، Church GM: البحث عن الأشكال التنظيمية للحمض النووي ضمن تسلسلات غير مشفرة غير متراصة متجمعة عن طريق تقدير كمية الرنا المرسال للجينوم الكامل. Nat Biotechnol. 1998 ، 16: 939-945. 10.1038/nbt1098-939.

Boros J, Lim FL, Darieva Z, Pic-Taylor A, Harman R, Morgan BA, Sharrocks AD: Molecular determinants of the cell-cycle regulated Mcm1p-Fkh2p transcription factor complex. الدقة الأحماض النووية. 2003, 31: 2279-2288. 10.1093/nar/gkg347.

Miller JA, Widom J: Collaborative competition mechanism for gene activation in vivo. مول الخلية بيول. 2003, 23: 1623-1632. 10.1128/MCB.23.5.1623-1632.2003.

Hepworth SR, Friesen H, Segall J: NDT80 and the meiotic recombination checkpoint regulate expression of middle sporulation-specific genes in Saccharomyces cerevisiae. مول الخلية بيول. 1998, 18: 5750-5761.

Xie J, Pierce M, Gailus-Durner V, Wagner M, Winter E, Vershon AK: Sum1 and Hst1 repress middle sporulation-specific gene expression during mitosis in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 1999, 18: 6448-6454. 10.1093/emboj/18.22.6448.

Wang W, Cherry JM, Nochomovitz Y, Jolly E, Botstein D, Li H: Inference of combinatorial regulation in yeast transcriptional networks: a case study of sporulation. بروك ناتل أكاد علوم الولايات المتحدة الأمريكية. 2005, 102: 1998-2003. 10.1073/pnas.0405537102.

Djordjevic M, Sengupta AM, Shraiman BI: A biophysical approach to transcription factor binding site discovery. الدقة الجينوم. 2003, 13: 2381-2390. 10.1101/gr.1271603.

Liu X, Noll DM, Lieb JD, Clarke ND: DIP-chip: Rapid and accurate determination of DNA-binding specificity. الدقة الجينوم. 2005, 15: 421-427. 10.1101/gr.3256505.

Markstein M, Markstein P, Markstein V, Levine MS: Genome-wide analysis of clustered Dorsal binding sites identifies putative target genes in the Drosophila embryo. بروك ناتل أكاد علوم الولايات المتحدة الأمريكية. 2002, 99: 763-768. 10.1073/pnas.012591199.

Berman BP, Nibu Y, Pfeiffer BD, Tomancak P, Celniker SE, Levine M, Rubin GM, Eisen MB: Exploiting transcription factor binding site clustering to identify cis-regulatory modules involved in pattern formation in the Drosophila genome. بروك ناتل أكاد علوم الولايات المتحدة الأمريكية. 2002, 99: 757-762. 10.1073/pnas.231608898.

Rebeiz M, Reeves NL, Posakony JW: SCORE: a computational approach to the identification of cis-regulatory modules and target genes in whole-genome sequence data. Site clustering over random expectation. بروك ناتل أكاد علوم الولايات المتحدة الأمريكية. 2002, 99: 9888-9893. 10.1073/pnas.152320899.

Hertz GZ, Stormo GD: Identifying DNA and protein patterns with statistically significant alignments of multiple sequences. المعلوماتية الحيوية. 1999, 15: 563-577. 10.1093/bioinformatics/15.7.563.

Carroll KL, Pradhan DA, Granek JA, Clarke ND, Corden JL: Identification of cis elements directing termination of yeast nonpolyadenylated snoRNA transcripts. مول الخلية بيول. 2004, 24: 6241-6252. 10.1128/MCB.24.14.6241-6252.2004.

Oliphant AR, Brandl CJ, Struhl K: Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. مول الخلية بيول. 1989, 9: 2944-2949.

Liu X, Brutlag DL, Liu JS: BioProspector: discovering conserved DNA motifs in upstream regulatory regions of co-expressed genes. Pac Symp Biocomput. 2001, 127-138.

Conlon EM, Liu XS, Lieb JD, Liu JS: Integrating regulatory motif discovery and genome-wide expression analysis. بروك ناتل أكاد علوم الولايات المتحدة الأمريكية. 2003, 100: 3339-3344. 10.1073/pnas.0630591100.

Benos PV, Bulyk ML, Stormo GD: Additivity in protein-DNA interactions: how good an approximation is it?. الدقة الأحماض النووية. 2002, 30: 4442-4451. 10.1093/nar/gkf578.

Murtin C, Engelhorn M, Geiselmann J, Boccard F: A quantitative UV laser footprinting analysis of the interaction of IHF with specific binding sites: re-evaluation of the effective concentration of IHF in the cell. J Mol Biol. 1998, 284: 949-961. 10.1006/jmbi.1998.2256.

van Rossum G, de Boer J: Interactively testing remote servers using the python programming language. CWI Quarterly. 1991, 4: 283-303.

Schneider TD, Stephens RM: Sequence logos: a new way to display consensus sequences. الدقة الأحماض النووية. 1990, 18: 6097-6100.

Wynne J, Treisman R: SRF and MCM1 have related but distinct DNA binding specificities. الدقة الأحماض النووية. 1992, 20: 3297-3303.

Rice P, Longden I, Bleasby A: EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. Trends Genet. 2000, 16: 276-277. 10.1016/S0168-9525(00)02024-2.


SSB-DNA binding monitored by fluorescence intensity and anisotropy

Fluorescence methods have proven to be extremely useful tools for quantitative studies of the equilibria and kinetics of protein-DNA interactions. If the protein contains tryptophan (Trp), as is often the case, and there is a change in intrinsic Trp fluorescence of the protein, one can use this change in signal (quenching/enhancement) to monitor binding. One can also attach an extrinsic fluorophore to either the protein or the DNA and monitor binding due to a change in fluorescence intensity or a change in fluorescence anisotropy. Such equilibrium studies can provide important quantitative information on stoichiometries (occluded site size, number of binding sites) and energetics (affinities and cooperativities) of the interactions. This information is needed to understand the mechanisms of protein-DNA interactions. A critical aspect of such approaches for systems that have non-unity stoichiometries (e.g., a protein that binds multiple ligands) is knowledge of the relationship between the change in fluorescence signal (intensity or anisotropy) and the average extent of binding. Here we describe procedures for using fluorescence approaches to examine the stoichiometries and equilibrium binding affinities of Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein (SSB) and Deinococcus radiodurans SSB with long polymeric ssDNA to determine an occluded site size. We also provide examples of studies of SSB binding to shorter oligonucleotides to demonstrate analysis and fitting of the data to an appropriate model (monitoring fluorescence intensity or anisotropy) to obtain quantitative estimates of equilibrium binding parameters. We emphasize that the solution conditions (especially salt concentration and type) can influence not only the binding affinity, but also the mode by which an SSB oligomer binds ssDNA.

الأرقام

Determination of the occluded site…

Determination of the occluded site size of الدكتور SSB ( أ ) and…

83% quenching). The occluded site size (≈52 nucleotides per الدكتورSSB dimer) was determined by extrapolation of the linear part of the titration curve to the point of intersection with the corresponding plateau value after saturation (shown in أحمر). For 1.0 M NaCl (yellow triangles) the titration is not stoichiometric, so a determination of occluded site size is not possible (in this case the concentrations used in the experiment were 0.2 μM الدكتورSSB and 817 μM of poly(dT)). (ب) Fluorescence titration of سابقة بمعنى البيئةSSB (0.14 μM) with Poly(dT) (495 μM (nucleotides)) under stoichiometric conditions (0.2 M NaCl, buffer T, pH 8.1, 25°C). For this titration the occluded site size determined from the intersection point (as described in panel A) يكون

65 and maximum quenching is

90%. (ج) Fluorescence titrations of الدكتورSSB with (dT)50 in buffer T (pH 8.1, 25°C) under stoichiometric (0.2 M NaCl, green circles) and nonstoichiometric conditions (1.0 M NaCl, yellow squares و مثلثات). The titration isotherms are presented in the form of the dependence of relative fluorescence quenching versus the ratio of total (dT)50 to total protein concentration. The concentrations of الدكتورSSB (dimer) used in the titrations are shown under corresponding plots. (د) Fluorescence titration of سابقة بمعنى البيئةSSB (0.1 μM tetramer) with (dT)70 in buffer T (0.2 M NaCl, pH 8.1, 25°C) is indicative of 1:1 stoichiometric binding of سابقة بمعنى البيئةSSB tetramer to ssDNA.

The analysis of titration isotherms…

The analysis of titration isotherms of SSB binding to oligo(dT) using model-independent approach…

80% is reached when the binding density <X> = 1). Smooth curves through the data points represent a global fit of the two experimental data sets to the model of n-independent and identical sites (see Eqs. 5 and 5a and text for details) with the following parameters: سالأعلى = 0.80 ± 0.01 ن = 0.94 ± 0.02 and كobs = (8.09 ± 0.73) × 10 7 M −1 . (ب) Titration curves representing fluorescence titrations of the سابقة بمعنى البيئةSSB tetramer with (dT)35 in buffer T (0.2 M NaCl, pH 8.1, 25°C) at two protein concentrations, 0.1 μM tetramer (closed circles) and 0.32 μM tetramer (دوائر مفتوحة) (14). The insert shows the results of an MBDF analysis of the data (as described for Fig. 1a), which indicates that two molecules of (dT)35 bind to سابقة بمعنى البيئةSSB tetramer upon saturation. The binding of the first one is characterized by the fluorescence quenching of

50% and the second one by fluorescence quenching of

90% quenching for the final complex having 2 mol of (dT)35 bound per mole of سابقة بمعنى البيئةSSB tetramer).

Titrations of fluorescein-labeled DNA (F-(dT)…

Titrations of fluorescein-labeled DNA (F-(dT) 50 ) with SSB monitoring ( أ )…


Additional file 1: Fig. S1.

Endogenous G4 landscape in human K562 and HepG2 cells. الشكل S2. Genomic association of TFs and endogenous G4s is independent of the genomic regions used for randomization and the cell line. الشكل S3. TF binding is independent of G-richness. الشكل S4. R-loops vs. endogenous G4s. الشكل S5. Double-stranded DNA consensus binding motifs vs. endogenous G4s. Fig. S6. Structural verification of oligonucleotides used in this study. Fig. S7. TFs selectively bind to G4 structures. Fig. S8. TFs are recruited to G4s in chromatin. Fig. S9. Structural specificity of TF-G4 interactions. Fig. S10. G4 ligands compete with TFs for binding to G4 structures. Fig. S11. RNA Polymerase 2 occupancy depends on TF occupancy, but not on G4s. Table S1. DNA oligonucleotides used in this study. Table S2. Western-blot quantification corresponding to Fig. 2a and S7. الجدول S3. Western-blot quantification corresponding to Fig. 2b. Table S4. Antibodies used in this study. Table S5. qPCR control regions for TF native ChIP experiments.

Additional file 2: Table S1.

Randomization of G4 ChIP-seq peaks different workspaces contrasted to TF ChIP-seq peaks from ENCODE for K562 cells.

Additional file 3: Table S2.

Randomization of G4 ChIP-seq peaks different workspaces contrasted to TF ChIP-seq peaks from ENCODE for HepG2 cells.

Additional file 4: Table S3.

Enrichment at G4 ChIP for TFs that have been mapped in both K562 and HepG2. The maximum enrichment was used if TFs have been mapped multiple times.

Additional file 5: Table S4.

Randomization of control sites (potential G4, open chromatin, promoter&5’UTR, no endogenous G4) in open chromatin. Genomic associations of endogenous and control sites are contrasted for K562 cells.

Additional file 6: Table S5.

Randomization of predicted consensus dsDNA binding sites (from JASPAR) or endogenous G4s in promoters / open chromatin promoters. Enrichment at TF chromatin binding sites is contrasted for K562 cells.

Additional file 7.

Supplemental Information (Supplemental Methods Supplemental Data Analysis Supplemental Discussion.).


شاهد الفيديو: تفاعل الإحلال المزدوج (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Akilabar

    يمكنك مناقشته بلا حدود

  2. Maunos

    أعتذر ، هذا البديل لا يأتي في طريقي. هل يمكن أن تكون المتغيرات موجودة؟

  3. Jean Baptiste

    ما الحماسة!

  4. Stod

    هذا الموضوع مذهل فقط :) ، مثير للاهتمام بالنسبة لي)))



اكتب رسالة